材料和试剂

赫拉细胞
尼日利亚霉素（Sigma-Aldrich，目录号：N7143）准备在乙醇中的10mM尼日利亚菌素（1：10,000）股票（存储在-20℃的等分试样，并在实验期间保持在冰上）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
BCECF-AM（Life Technologies，目录号：B1170）
葡萄糖
1％抗生素 - 抗真菌剂（Gibco ，目录号：15240）
DMEM（Mediatech，Cellgro ，目录号：10-013-CV）
10％FBS
石蜡
校准溶液（参见配方）
10x Earle's平衡盐溶液（EBSS），不含葡萄糖和碳酸氢钠（见配方）。
加载解决方案（参见配方）
细胞培养基（参见配方）

设备

用于35mm盘的灌注嵌件（Warner Instruments，目录号：RC-33DM）
35mm聚赖氨酸涂布的玻璃底培养皿（MatTek，目录号：P35GC-1.0-14-C）
50ml锥形管
针
铝箔
配有高分辨率摄像机（ZEISS，Axio CAM MRm）的Axiovert 200 M Zeiss荧光显微镜
BCECF过滤器组（Chroma Technology Corporation，目录号：71001a）
中和密度滤光片（ND 1.0A-10.0％透射率-25mm;这是针对给定显微镜定制设计的）（Chroma Technology Corporation）
管道和灌注连接
流量泵（Rainin蠕动泵Dynamax RP-1.4通道;目录号因供应商而异）
5％CO 2 罐
37°C水浴
5％CO 2培养箱（确保其被定期校准; CO 2浓度的变化可对pH产生显着影响，在实验中产生噪声）

软件

AxioVision 4.8
Slidebook 4.2
SigmaPlot
Excel或任何电子表格分析软件

程序

在35mm玻璃底培养皿中生长细胞（〜10 ）至40％融合。请注意，与塑料餐具相比，细胞需要较长时间才能贴附到玻璃底部菜肴。
用感兴趣的药物或siRNA处理细胞达期望的时间长度直到细胞达到〜40％融合
应该安装灌注系统以减少由于BCECF泄漏出细胞的背景信号，并且在整个pH 测量中保持培养基温度和pH恒定。
1. 流出和流入管应具有相同的长度，以防止板的溢出或干燥。
2. 2 ml/min是推荐的灌注速率;更快的速率可能对影响pH的细胞具有剪切效应。
3. 为了将流出管和流入管连接到盘，我们使用针，我们弯曲成钩的形状，并用石蜡将其固定在盘上。 Premade套装可从市场购买： https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id = 958。
4. 为了有效的流动和防止湍流，我们使用35毫米菜肴的灌注插入和固定在与石蜡的菜。我们建议使用可见染料（如台盼蓝）测试流动的平滑度，以确保实验开始前的有效流动。
5. 在实验前用蒸馏水冲洗灌注系统4小时，以除去管道内的任何残留物，尤其是前面实验中的尼日利亚菌素。
在37℃的水浴中设置一个架子以容纳含有与装载溶液相同的灌注溶液的50ml锥形管。类似于培养箱内的条件，在实验前平衡pH的加载溶液中以缓慢至中等速率（〜1个气泡/秒）至少20分钟的气泡5％CO 2。在实验期间继续鼓泡5％CO 2至装载溶液中以维持pH
有一个校准的pH计方便。可以连续监测装载溶液的pH以确保一致性。
在显微镜上设置灌注系统和设置。为BCECF安装色度滤波器组，并定义软件的通道。检查滤光轮，确保激发和发射通道在Axiovision软件中正确定义
确保灯泡强度为50％，过滤器密度为10％，以防止对细胞的光毒性
打开Axiovision并将曝光时间设置为100毫秒（对于440nm）和200毫秒（对于495nm）。发射设置在535nm。同时指定程序以30秒间隔拍摄6张照片。
稀释一瓶BCECF在80μlDMSO。使用预分装的BCECF粉末以防止反复冻融循环（BCECF染料在2次冻融循环后不能很好地工作）。
从细胞中取出培养基，用3ml上样溶液洗涤细胞以去除残留的培养基（某些氨基酸干扰染料加载）。
吸取2毫升1×EBSS到细胞板上，然后直接加入10微升BCECF板上。通过向上和向下移液EBSS-BCECF溶液轻轻混匀。
将细胞在孵化器中25分钟。在孵育前5分钟开始通过灌注系统开始流动加载溶液。
为了防止光漂白，一旦从培养箱中取出并且被转移到显微镜室，就用一片铝箔包裹细胞板。关闭房间中的灯（电脑屏幕的灯应提供充足的灯光）。
（在此步骤快速工作）立即将装载的菜肴安装在显微镜载物台上，并用石蜡固定在适当位置，以防止图像采集过程中的任何运动。安装灌注插入件和流入和流出管。运行灌注系统，同时聚焦显微镜找到一个合适的面积 - 约40％汇合 - 用于拍照。我们建议使用卤素灯以尽可能弱的强度进行聚焦，然后使用荧光灯进行精细聚焦，以降低细胞毒性的风险。可以使用10x-40x放大。放大10倍可以评估更多的细胞数量。
让装载溶液通过系统运行2-3分钟，然后以30秒间隔拍摄6张照片（在步骤6自动化）（图1）。

图1. 显示了用于细胞内pH测量的最终设置。系统的组件已标记
将图片导入到Slidebook（确保在Slidebook中正确定义通道）。
导入图片后，通过选择靠近图片中间的区域（附近有一些单元格）来定义背景。然后使用遮罩工具选择单元格。在比率工具中，将495定义为分子，将450定义为分子。提取495/450通道的比率数据，并将数据导入Excel。删除异常值。使用校准方程式将比率数据转换为pH值（见下文）。

原位校准

通过测定当在〜490nm激发染料时在535nm处的发射强度（pH依赖性）与当在〜440nm的非等静点处激发染料时的发射强度的比值来进行用BCECF的细胞内pH测量pH依赖性）。 BCECF的荧光的原位校准以相同的方式进行，但是在存在10-50μM的尼日利亚霉素和100-150mM的K on + 以平衡内部和外部pH。应对每个实验进行原位校准。
拍摄照片后，从显微镜上的装载和固定板中小心地吸取加载溶液，并使用板的侧部缓慢添加2ml校准溶液。吸出校准溶液，然后使用移液管缓慢加入2毫升校准溶液与尼日利亚菌素。等待5分钟后拍摄2张照片。在pH值5.5,6,6.5,7,7.5,8和8.5重复该过程。此时不需要流量。
将图片导入Slidebook并按上述分析，以获得每个校准pH值的495/450比例
为了将比率转换为pH，使用SigmaPlot获得最能描述数据的方程。校准数据应符合S形曲线。使用描述S形曲线的方程式将上面得到的实验比值转换为pH值（图2）

图2. 典型的S形校准曲线和描述它的公式如所示

食谱

校准溶液
135 mM KCl
2mM K 2 HPO 2
20 mM HEPES
1.2mM CaCl 2 0.8mM MgSO 4 通过加入HCl或KOH将pH调节至5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5
10x EBSS原液（无葡萄糖和无碳酸氢钠）

CaCl 2 ^。 2H O
2.65g/L

MgSO 4（无水）
0.9767g/L

KCl
4 g/L

NaCl
68克/升

NaH 2 PO 4 sub
0.122 g/L
装载解决方案

EBSS
1x（从10x股票）

葡萄糖
1g/L（来自100g/L储液）

NaHCO 3
24mM（pH 7.4）

注意：
1. 所需的NaHCO 3的量由加载溶液的所需pH确定。
2. 通过添加葡萄糖酸盐或山梨醇将溶液的摩尔渗透压浓度调整为290-310 mOsm。
3. 准备足够的溶液，每板约25毫升。过滤溶液并等分到50ml锥形管中。将其盖子在5％CO 2培养箱中稍微打开以使pH平衡过夜。
细胞培养基
注意：Hela细胞在10cm培养皿中使用以下细胞培养基培养。
Cellgro DMEM
10％FBS
1％抗生素 - 抗真菌剂
5％CO 2 2，37℃培养箱

致谢

该协议已经从参考文献部分中描述的几个先前出版物修改，并且最近在McBrian等人（2013）中使用。

参考文献

Casey，J.R.，Grinstein，S。和Orlowski，J。（2010）。细胞内pH的传感器和调节剂。 Nat Rev Mol Cell Biol em> 11（1）：50- 61.
Kurkdjian，A.and Guern，J。（1989）。细胞内pH：细胞活性的测量和重要性。 em> Annu Rev Plant Biol 40（1）：271-303。
McBrian，M.A.，Behbahan，I.S.，Ferrari，R.，Su，T.，Huang，T.W.，Li，K.，Hong，C.S.，Christofk，H.R.，Vogelauer，M.，Seligson D.B.and Kurdistani，S.K.（2013）。组蛋白乙酰化调节细胞内pH 。 Mol Cell 49（2）：310-321。
Orij，R.，Urbanus，M.L.，Vizeacoumar，F.J.，Giaever，G.，Boone，C.，Nislow，C.，Brul，S.and Smits，G.J。（2012）。细胞内pH的全基因组分析揭示了通过pH的细胞分裂速率的定量控制（c） em> Saccharomyces cerevisiae 。 Genome Biol 13（9）：R80。