材料和试剂

白色念珠菌菌株，SC5314和ATCC18804
小鼠
注意：C57BL/6背景上的每只WT或Dectin-1 KO小鼠的2x应当为完整的24孔板实验提供足够的巨噬细胞。小鼠年龄和性别匹配。
硫代乙醇酸酯引发的巨噬细胞
注意：这种方法已经在Kerrigan等人（2012）。
RPMI 1640培养基（Life Technologies，目录号：11875-093）
70％乙醇
Sabouraud葡萄糖肉汤（Oxoid Limited，目录号：CM0147）
罗丹明Green-X（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：R-6113）
Difco硫代乙醇酸液体培养基（BD Biosciences，目录号：225710）
Triton-X 100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
OptEIA TNF试剂盒（BD Biosciences，目录号：555268）
酵母聚糖（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：Z2849）}
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
胎牛/小牛血清（FCS）（Sigma-Aldrich，目录号：F6178）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）

设备

Titer-Tek Fluoroskan II（Labsystems）
振动器
注意：振荡器温度控制在30℃，速度在150到200rpm之间。
离心机（Eppendorf，型号：5810R，带有旋转斗转子S-4-72）
光学显微镜
血细胞计数器
24孔板（BD Biosciences）
2 ml Eppendorf管
96孔板（用于荧光测量的黑色）（BD Biosciences）
注射器柱塞的橡胶背面
注意：上述设备的品牌对于重现性不重要。

程序

白色念珠菌的生长和标记
1. 开始 C。白色念珠菌培养物接种冷冻储备液到5ml Sabouraud葡萄糖肉汤并在30℃下孵育16至24小时以200rpm摇动
2. 将细胞以3,000rpm离心5分钟，并在10ml Dulbecco's PBS中洗涤三次
3. 在显微镜下使用血细胞计数器计数酵母细胞。
4. 将细胞密度调节至至少3.2×10 6酵母/ml，或者在PBS中所需的并转移到2ml eppendorf管中。
5. 加入Rhodamine Green-X至浓度为200μg/ml
6. 用箔覆盖管，并在室温下温和搅拌孵育30至45分钟
7. 将标记的细胞以3,000rpm离心5分钟，并重悬于PBS中
8. 用2ml PBS洗涤细胞约10次，或直到除去游离的罗丹明绿-X。
巨噬细胞结合和促炎测定
注意：
1. 巨噬细胞的提取在动物设施内的罩中进行。
2. 用白色念珠菌治疗巨噬细胞是在组织培养BSL2区域的罩中进行的。
3. 用70％乙醇喷雾罩表面以防止样品污染。
1. 用1ml巯基乙酸盐肉汤腹腔注射小鼠（Kerrigan等人，2012）。轻轻地握住鼠标以允许自由空间注射部位。使用注射器注射巯基乙酸盐培养液在腹部的下象限; 小心不要刺伤重要器官如膀胱或肠。
2. 四天后，通过用冰冷的5ml含有5mM EDTA的PBS灌洗来分离腹膜渗出液细胞。
3. 离心腹膜细胞在1,000 rpm 10分钟，并重悬在含有10％（体积/体积）热灭活的FCS（通过在60℃加热30分钟）。
  注意：以下步骤中使用的所有FCS都已被热灭活。
4. 在血细胞计数器上计数巨噬细胞，将其稀释至5.0×10 5个细胞/ml，并将其以2.5×10 5个细胞/孔的密度接种在24孔平板用含有10％FCS的RPMI培养基。将板孵育过夜在37℃（无任何搅拌）。
5. 吸出孔，加入0.5 ml新鲜RPMI加10％FCS到附着在孔上的巨噬细胞。
6. 将MOI（感染复数）为5：1或10：1的罗丹明绿-X-标记的白色念珠菌加入巨噬细胞。
7. 荧光素异硫氰酸酯标记的酵母聚糖可用作对照在MOI为25：1。酵母聚糖由β-葡聚糖颗粒制成被巨噬细胞受体识别并诱导促炎症反应; Dectin-1是这些颗粒的受到很好研究的受体（Brown等人，2003）。
  注意：
  1. 酵母聚糖用FITC标记根据制造商（Molecular Probe）说明书进行也在Kerrigan等人（2012）。
  2. 预期的结果是酵母聚糖将结合巨噬细胞并诱导炎症反应 Dectin-1依赖型。
8. 孵育板在冰上30分钟以允许颗粒沉降，然后再孵育30分钟在37℃，5％CO 2下
9. 用0.5ml RPMI加10％FCS洗涤孔三次，以除去未结合的颗粒
10. 向孔中加入500μlRPMI加10％FCS，并在37℃下孵育3小时，5％CO 2。
11. 等分150μl的上清液，并储存在-80℃，以便以后分析促炎细胞因子的产生
12. 洗涤孔和裂解细胞，通过加入150μl3％Triton X-100（pH 7.5）。将Triton X-100在蒸馏水中稀释至3％（v/v）
13. 分离细胞使用注射器柱塞的橡胶背，并添加100微升进入黑色96孔板。也可以使用刮刀。
14. 至量化真菌颗粒与巨噬细胞的结合，测量在490nm的激发下的荧光和在514nm的514nm的发射 Titer-Tek Fluoroskan II。预期结果如图4b所示（Marakalala等人，2013年）。
15. 对于促炎反应，使用ELISA（OptEIA TNF试剂盒）以测量上清液等份的TNF浓度其已储存在-80℃ 注意：促炎症反应可以类似地测量菌丝，除了加入巨噬细胞直接到已经含有活或热灭活菌丝的孔。有关菌丝感应的详细说明，请参阅下文。
对菌丝的促炎反应
1. 为了诱导菌丝形成，如步骤A1-3中所述，培养和定量白色念珠菌。
2. 在37℃下用RPMI培养基孵育2.5×10 6个酵母/孔（细胞密度约3.2×10 6个酵母/ml或根据所需量）3小时。在显微镜下观察细胞以确认菌丝形成
3. 热灭菌菌丝通过孵育在65°C 2小时，或使用活菌丝，如果需要。
4. 加入2.5×10 5的巯基乙酸酯 - 引发的巨噬细胞（密度为5.0×10 5个细胞/ml，直接含有菌丝的孔）。
5. 在37℃，5％CO 2下孵育平板过夜。
6. 取上清液样品并储存于-80℃直到需要进行细胞因子分析

致谢

该方案改编自以前的出版物，包括（Marakalala等人，2008; Brown等人，2003; Kerrigan等人，2012年），和Taylor等人，2007）。我也感谢悉尼布伦纳奖学金，国家研究基金会和南非医学研究委员会的资助。

参考文献

Brown，G.D.，Herre，J.，Williams，D.L.，Willment，J.A.，Marshall，A.S.and Gordon，S。（2003）。 Dectin-1介导β-葡聚糖的生物学作用。 Med 197（9）：1119-1124。
Kerrigan，A.M.，de Sousa Mda，G.and Brown，G.D。（2012）。测量与真菌的先天相互作用的简单测定法 em> 845：303-317。
Marakalala，MJ，Vautier，S.，Potrykus，J.，Walker，LA，Shepardson，KM，Hopke，A.，Mora-Montes，HM，Kerrigan，A.，Netea，MG，Murray，GI，Maccallum， Wheeler，R.，Munro，CA，Gow，NA，Cramer，RA，Brown，AJand Brown，GD（2013）。体内白色念珠菌的差异适应调节dectin-1的免疫识别。 PLoS Pathog 9（4）：e1003315。
Taylor，PR，Tsoni，SV，Willment，JA，Dennehy，KM，Rosas，M.，Findon，H.，Haynes，K.，Steele，C.，Botto，M.，Gordon， 2007）。 Dectin-1是β-葡聚糖识别和控制真菌感染所必需的。 > Nat Immunol 8（1）：31-38。