材料和试剂

酵母tRNA（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM7119）
MEGAshortscript T7转录试剂盒（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM1354）
寡核苷酸（50μM）
重组RNA酶抑制剂（Takara Bio Company，目录号：2313A）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：63063）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
苯甲酰氰（Sigma-Aldrich，目录号：115959）注意：保存在干燥器中！
3 M乙酸钠（pH 5.5）（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9740）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）
ATP（[γ-32 P] -6,000Ci/mmol 10mCi/ml铅，250μCi）（PerkinElmer，目录号：NEG002Z250UC）
Micro Bio-Spin P-30凝胶柱Tris缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-6250）
用于引物延伸的dNTP混合物（各2.5mM）（Takara Bio公司，目录号：4030）
ddNTP（设定为5mM）（GE Healthcare，目录号：27-2045-01）
dNTP（梯度设置为100mM稀释至10mM）（Life Technologies，目录号10297-018）
SuperScript II（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：18064-014）}
凝胶加载缓冲液II（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM8546G）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
过硫酸铵（APS）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0700）
100％乙醇
Biospin柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-6250）
10x TBE缓冲区（参见配方）
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（参见配方）
排序梯（ddNTP/dNTP混合）（参见配方）
5x SHAPE缓冲区（请参阅配方）
0.4 M苯甲酰氰（见配方）

设备

标准实验室设备
纳米装置
培养箱或水浴
测序凝胶电泳系统
电源
真空泵
凝胶干燥器（Bio-Rad Laboratories，型号：583）
磷化仪和屏幕
台风9410扫描仪
UreaGel系统（国家诊断，目录号：EC-833）

软件

图像分析软件（Bio-Rad Laboratories，Quantity One; SAFA footprinting software， https://simtk.org/home/safa ）
RNA二级结构预测
1. MC-Fold： http://www.major.iric.ca/MC-Fold
2. Mfold： http://mfold.rna.albany.edu/?q = mfold/RNA-折叠形式

程序

克隆要在SHAPE盒中分析的RNA
RNA片段克隆到SHAPE盒中（图1）（Wang等人，2010）。已经检查了SHAPE盒以确保其不容易与内部序列形成稳定的碱基配对相互作用。
我们设计了包含侧翼序列的结构盒，其允许评估感兴趣的RNA内的所有位置。该盒的引物结合位点有效地结合到cDNA引物

图1.用于通过SHAPE技术测定二级RNA结构的构建体的示意图。将要分析的RNA的序列片段克隆在EcoRI和HpaI之间 SHAPE盒的限制性位点（Wang等人，2010）。
通过体外转录制备RNA
1. 线性化DNA质粒（≈0.5μg），用SmaI作为模板用于体外转录使用MEGAshortscript（转录方案在用户指南）。
2. 转录后，通过纯化苯酚：氯仿萃取和醇沉淀协议。在-20℃下进行乙醇沉淀过夜用3M乙酸钠（pH 5.2）代替乙酸铵。
3. 通过离心回收RNA，然后用70％乙醇洗涤，并将沉淀溶于20μl无核酸酶的水中

SHAPE分析

RNA重折叠
每次反应需要500ng至1μgRNA。
在水中重悬RNA。例如对于4个反应，重悬RNA以在Eppendorf管中制备40μl总体积
RNA变性，94℃/1分钟
在冰上孵育2分钟。
将10μl重折叠的RNA分到每个管中
向每个管中加入30μl不含核酸酶的水，其中补充有0.5μlRNA酶抑制剂
加入10μl5x SHAPE缓冲液，并孵育，30℃/30分钟
修改
加入5.5μlDMSO（未处理）或BzCN（处理），2分钟
在每个epp中加入6μl的3M NaOAc（pH5.2）
加入2μl的tRNA酵母1.9毫克/毫升+ 190微升100％乙醇，-20°C，过夜第二天
14,000rpm离心4℃，40分钟
使用1ml的70％乙醇洗涤，并在14,000rpm，4℃，10分钟离心
干燥RNA沉淀并重悬于20μl。在Nanodrop中量化。继续引物延伸只有RNAs≥100 ng /μl，15分钟。

标签引物

dH 2 2 O	33微升
引物（150pmol）	3微升
10x PNK缓冲区	6微升
γP32ATP	15微升
PNK	3微升

37℃，30分钟

使用biospin柱进行净化。
如果10 cpm活性进行探测，在液体闪烁计数器中测量计数。

引物延伸

RNA修饰		顺序梯子
RNA	500 ng	RNA未经处理	200 ng
dNTPs（2.5mM）	2微升	dNTPs/ddNTPs	2微升
标签引物	2微升	标签引物	2微升
dH 2 2 O
总计	12微升	总计	12微升

在冰上孵育2分钟。
在室温下孵育5分钟

鸡尾酒RT（逆转录）

0.1 mM DTT	2微升
RT缓冲区	4微升
核糖核酸酶抑制剂	0.2μl
RT	0.1μl
dH 2 2 O	2微升

42℃，30分钟

加入4μl1M NaOH，95℃，30分钟
加入凝胶上样缓冲液II（参见材料和试剂中的第18项）（15-20μl），95℃，4分钟。
混合，旋转并在加载到凝胶上之前在冰上孵育3分钟
预运行凝胶：加载2μl凝胶上样缓冲液II，并以60W，15分钟的恒定功率进行电泳
加载凝胶样品：2μl/泳道。以60 W的恒定功率进行电泳
运行凝胶（你可以长时间运行约3小时解决 5秒或短跑约。 2小时用于拆分3'末端或分子）， 2-3小时。
取出一个眼镜板，让凝胶保持附接到第二板。按一张Whatman纸凝胶顶部。凝胶将粘附在Whatman纸上并且可以从剩余的玻璃板剥离。用塑料覆盖凝胶包装。
干燥凝胶，2小时
暴露于phosphorimager屏幕，≈15小时。
在Typhoon 9410扫描仪中以50微米分辨率（图2），10分钟扫描
使用SAFA Footprinting软件进行分析频段： https://simtk.org/docman /view.php/69/496/SAFAUserGuide_v1_1.pdf。
在SAFA中实现的协议具有五个步骤：（a）通道鉴定，（b）凝胶精馏，（c）谱带分配，（d）模型拟合和（e）频带强度归一化。
软件将生成标准化带强度值（反应性数据）。
使用SAFA的反应性数据，并将其分类为"高，中和低反应性"根据来自每个的标准化带强度值核苷酸。使用"x"或"X"表示反应性核苷酸，使用"。"表示表示无反应。填写点4（单股化学/酶反应性数据） http://www.major.iric.ca/MC-Fold/（图3）。
MC-Fold将生成前20个结构。
选择他们更适合您的反应数据的结构。

图2.帽独立翻译的二级结构探测增强子（3'-CITE）。 SHAPE的前65个结构探针 3'-UTR，包括新的3'-CITE。引物延伸产物在RNA处理的（泳道4-6）或未处理的变性PAGE上分离（泳道3）。 Mg 2+的浓度（mM）如上所示第4-6行。通过逆转录产生测序梯的未修饰的RNA在双脱氧CTP（ddCTP）或ddATP的存在下。核苷酸A4002，A4029和A4047的位置显示在剩下。

图3.新3'-CITE探针的二级结构图2。叠加在二级核苷酸上的核苷酸的SHAPE反应性结构由Mfold预测。颜色编码的碱基表示的水平 BzCN改性，具有更暖的颜色，表明更大的改性（插图）。

食谱

10 x TBE缓冲区
108克Tris碱
55克硼酸 40ml 0.5M EDTA（pH8.0）
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
凝胶测序系统
8 M尿素
8-15％37％丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺29：1
1x TBE
10％过硫酸铵（APS）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）注意：或者，UreaGel系统可用于制备不同百分比的凝胶。

顺序梯子（ddNTP/dNTP mix）
注意：如果信号太强，则添加较少的ddNTP，反之亦然。

排序梯子
	A（ul）	T（ul）	C（ul）	G（ul）
dATP（10mM）	1	2	2	2
dTTP	2	0.5	2	2
dCTP	2	2	1	2
dGTP	2	2	2	1
ddATP（5mM）	20
ddTTP		20
ddCTP			10
ddGTP				20
dH 2 2 O	13	13.5	23	13

5x SHAPE缓冲区
注意：应针对每个要研究的单个RNA优化缓冲液。

	1x	5x
KCl	100 mM	20ml 1 M KCl
HEPES KOH（pH 7.5）	50 mM	10ml 1M HEPES KOH（pH 7.5）
MgCl 2	8 mM	1.6ml 1M MgCl 2·h/v
		8.4ml H 2 O x/v

0.4M苯甲酰氰重量0.0524g并溶于1ml DMSO中

致谢

这项工作得到了2009年PLANT-KBBE行动计划下的跨国（德国，法国，西班牙和葡萄牙）合作的授权AGL2009-07552/AGR和西班牙Ministerion deInnovacón（西班牙）的EUI2009-04009资助， eInnovación（西班牙）。 Manuel Miras是西班牙Ministerio de Ciencia eInnovación的牧师奖学金获得者。 JJK由美国农业部国家研究计划的资助2011-67012-30715资助该方案改编自以前的工作（Wilkinson等人，2006; Mortimer和Weeks，2007）。

参考文献

Kraft，J.J.，Treder，K.，Peterson，M.S.and Miller，W.A。（2013）。 3'帽独立翻译元件的阳离子依赖性折叠促进17核苷酸保守序列的相互作用with eIF4G。 Nucleic Acids Res 41（5）：3398-3413。
Miras，M.，Sempere，R.N.，Kraft，J.J.，Miller，W.A.，Aranda，M.A.and Truniger，V。（2014）。病毒间的家族间重组导致获得了一种新的翻译增强RNA元件，允许抗性破坏。 New Phytol 202（1）：233-246。
Mortimer，S.A。和Weeks，K.M。（2007）。用于通过SHAPE化学准确分析RNA二级和三级结构的快速作用试剂。 J Am Chem Soc 129（14）：4144-4145。
Wang，Z.，Kraft，J.J.，Hui，A.Y。和Miller，W.A。（2010）。四种植物病毒RNA中大麦黄矮星病毒样帽子非依赖性翻译元件的结构可塑性。 Virology 402（1）：177-186。
Wang，Z.，Parisien，M.，Scheets，K.and Miller，W.A。（2011）。帽结合性翻译起始因子eIF4E结合病毒帽独立翻译元件中的假性结节。结构 19（6）：868-880。
Wilkinson，K.A.，Merino，E.J.and Weeks，K.M。（2006）。通过引物延伸（SHAPE）分析的选择性2'-羟基酰化：单核苷酸的定量RNA结构分析 Nat Protoc 1（3）：1610-1616。