材料和试剂

RDSA缓冲区（Pitzschke等人，，2009）（参见Recipes）

表1. RDSA 的寡核苷酸

用于RDSA的寡核苷酸
RDSA_1	TAGTTGAGTCTCACAAACGAACAC（N20）CATTCCAAAATCCATGGCTGATA
RDSA_1 fo	TAGTTGAGTCTCACAAACGAACAC
RDSA_1 re	TATCAGCCATGGATTTTGGAATG
RDSA_2	AATGGATCCAAGCTTAAGC（N18）CGTTGAATTCCCATGGACA
RDSA_2 fo	AATGGATCCAAGCTTAAGC
RDSA_2 re	TGTCCATGGGAATTCAACG

设备

程序

随机DNA制备
1. PCR扩增。
  双链DNA片段RDSA1和RDSA2 具有侧翼为独立集的20和18-bp随机序列区通过PCR在RDSA_1和RDSA_2的模板上扩增适配子，分别使用RDSA_1/2fo和RDSA_1/2re引物（表1）。 PCR扩增条件为：94℃5分钟; 30个循环的30 94℃，50℃30秒，72℃30秒; 72℃10分钟。
2. PCR产物的纯化
  1. 取至少200μlPCR产物; 加入等体积的24：1 （氯仿：异戊醇）至样品管; 摇管大力手持至少30秒，以15,000×g离心样品10分钟 min在4℃
  2. 将水相转移到新鲜管中; 加入等体积的异丙醇并混合; 置于-20°C冰箱1小时
  3. 在4℃下，将样品以15,000×g离心10分钟
  4. 弃去上清液，用70％酒精洗涤沉淀。
  5. 空气干燥沉淀至少10分钟; 将沉淀物溶解在无菌ddH 2 O中并在-20℃下储存直至使用。
用GST或CBD（壳多糖结合结构域）标记的靶蛋白的原核表达
1. 构建表达载体。
  靶基因的编码区是框内连接到表达载体pGEX-6P-1（用于GST融合）蛋白质）或pTXB3（用于CBD融合蛋白）
2. 将构建体转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中以表达融合蛋白。

RDSA周期

收获细胞（100ml细菌培养物），并将其重悬在PBS中缓冲液（用于GST融合蛋白）或柱缓冲液（用于CBD融合）蛋白质）。
通过超声破碎细胞（950W×20％，2-10分钟根据表达蛋白的溶解度和2秒每2秒超声处理后中断。带样品的管应该在操作期间置于冰水中）并在1,000℃下在4℃下离心10分钟。
准备珠柱（加载至少3毫升珠）; 平衡谷胱甘肽 Sepharose珠柱（用于GST融合蛋白）倍的珠体积）和几丁质珠柱（用于CBD融合）蛋白质）与柱缓冲液（珠体积的10倍）。在里面接下来的步骤中，珠子柱应该放在冰上
将澄清的裂解液缓慢加载到色谱柱上。
用至少20倍床体积PBS缓冲液洗涤柱子 GST融合蛋白或用于CBD融合蛋白的柱缓冲液彻底去除未结合的蛋白; 洗珠至少三次次; 将珠子重悬于3ml RDSA缓冲液中。现在重组靶蛋白固定在珠上。
将珠子分成5-10管（1.5 ml管）。
加入随机DNA片段RDSA1或RDSA2（10μl，约5-10μg）成一管; 在4℃下温和滚动孵育2小时以上
在4℃下以500×g离心5分钟，完全丢弃上清液。
用RDSA缓冲液洗涤珠至少四次以除去未结合的DNA片段; 加入500μl无菌ddH 2 O并煮沸珠5 min以释放结合的DNA; 在4℃下以500×g离心5分钟
将上清液转移到新管; 净化和沉淀释放的DNA如步骤A2中所述（不需要溶解脱氧核糖核酸）。

向试管中加入PCR试剂：

使用以下参数进行PCR扩增：94℃5分钟 C; 在94℃下30秒，在50℃下30秒和在72℃下30秒的30个循环; 72℃10分钟。

笔记

通过增加非特异性竞争剂聚（dIdC）（0,50,100,150,200,250,300和350ng）的量并减少结合反应中的蛋白质的量（700μl，650μl，600μl） 500μl，550μl，500μl，400μl，300μl，200μl蛋白结合珠），可以在每个RDSA循环中增加严格性（Pitzschke等人，2009; Wang等人。，2014）。
为了排除来自非随机侧翼衔接子的影响，RDSA必须以两个不同组的输入随机DNA片段（RDSA1和RDSA2）重复进行（Pitzschke等人，2009）。
对于不同的蛋白质，总循环数可以不同。根据我们的经验，应该进行至少5个循环以排除非特异性结合
RDSAs的结果应该通过其他方法，如电泳迁移率变动分析（EMSA）和酵母单杂交系统验证。
退火温度应通过不同的随机引物调整

食谱

PBS缓冲液（pH 7.3）
140mM NaCl 2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4 sub/
5 mM DTT
1mM PMSF
列缓冲区
20mM Tris-HCl（pH8.5） 500 mM NaCl
1mM EDTA
RDSA缓冲区
5mM Tris（pH8.0） 75mM NaCl 2.5mM MgCl 2 v/v 0.5mM EDTA 5％甘油 1％Tween
1 mM DTT

致谢

我们感谢Heribert Hirt医生对本实验的建议。这项工作是由中国自然科学基金会（拨款号30971748）支持。

参考文献

Pitzschke，A.，Djamei，A.，Teige，M。和Hirt，H。（2009）。 VIP1反应元件介导促分裂原活化蛋白激酶3诱导的应激基因表达。美国国家科学院院报106（43）：18414-18419。
Wang，Y.，Peng，W.，Zhou，X.，Huang，F.，Shao，L.and Luo，M.（2014）。推定的土壤杆菌转录激活子样毒力蛋白VirD5可能靶向T复合物以防止外壳降解蛋白质在植物细胞核中。新植物 203（4）：1266-1281。