材料和试剂

人肺腺癌细胞系PC9（RIKEN BioResource Center，目录号：RCB4455）
含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：A10491-01）
注意：对于细胞培养，培养基补充有10％FBS和1％青霉素链霉素（参见下面的细节FBS和Pen/Strep）。
青霉素链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15070-063）
胎牛血清（FBS）（PAA Laboratories GmbH，目录号：A15-101）
Opti-MEM I减少血清培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：31985-047）
384孔组织培养板，使用具有透明F底的黑色（4度，Anachem，目录号：4TI-0201）用于我们的筛选;目前使用来自Greiner bio-one（目录号：781091）的平板
粘合箔板密封（Brandle Plate Sealer，Alpha Biotech）
5x siRNA缓冲液（GE Healthcare，目录号：B-002000-UB-100）
人类siGENOME Smartpool siRNA文库（GE Healthcare，目录号：G-005005）
注意：我们使用的旧版本（从2005年开始）用于我们的研究（de Bruin et al。，2014），不再可用。更新的版本将包含其他siRNA序列以及注释，这将影响结果。因此，我们强烈建议使用其他方法验证鉴定的基因。
siRNA对照（见注1）
阴性对照：人siGENOME非靶向siRNA 2（GE Healthcare，目录号：D-001210-02），无RISC的对照siRNA（目录号：D-001220-01），ON-靶加上非定位（目录号：D-001810-10）
阳性对照：人siGENOME SMARTpool UBB（GE Healthcare，目录号：M-013382-01）和PLK1（Dharmacon，目录号：M-003290-01）
DharmaFECT 2 siRNA转染试剂（GE Healthcare，目录号：T-2002-01）（参见注释2）
DAPI（Roche Diagnostics，目录号：10236276001）
siGENOME LaminA/C对照siRNA（GE Healthcare，目录号：D-001050-01-05）（参见注释3）
人类LaminA/C抗体（目录号：SC-7292）（参见注释3）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.0，内部制造）
埃洛替尼（Enzo Life Sciences，目录号：BML-DL279）

设备

Acumen（TTP LABTECH，模式：eX3）
ArrayscanVTi HCS显微镜（Cellomics）
Biomek FX液体处理平台（Beckman Coulter）
伯爵夫人细胞计数器（Life Technologies）
液体分配器8通道[我们的屏幕使用WellMate（矩阵），目前使用FluidX（Xrd-384）]
Cytomat 24℃CO 2培养箱37℃和5％CO 2
注意：Cytomat是一个细胞培养箱，其中有支架可容纳约500块板，并且支架旋转以减少板边缘效应。
板洗涤器（BioTek Instruments，型号：ELx405 Select CW，图1）
板密封器（Brandel Plate Sealer，Alpha Biotech）

图1.洗版机图片

重要注意事项

在进行大规模siRNA筛选之前，有几个关键点要考虑和优化以获得最佳结果（Jiang等人，2011）。这些包括：

siRNA转染的优化：试剂，细胞数，siRNA浓度
优化药物剂量，治疗时间长度与用于耐药/敏化筛选的siRNA转染组合

这些优化步骤的详细信息在本协议末尾的Notes部分中提供。如果可能，我们建议进行一系列随机siRNA和选择的对照RNA的试验筛选，以确定在全基因组筛选前的可行性和屏幕读数。

程序

siRNA反转录
1. 在补充有10％FBS + 1％青霉素和链霉素的RPMI培养基中培养PC-9细胞。
2. 将siRNA SMARTpools文库重悬于1x siRNA缓冲液中（稀释 5x siRNA缓冲液使用RNase/DNase-free水）达到最终浓度为375nM 注意：抵达后，图书馆使用1x siRNA缓冲液重悬浮于3.75μM储备溶液和储存于-20°C长期储存。在协议的这一步，将库库进一步稀释到375nM。
3. 等分 siRNA SMARTpools从文库测定平板使用BiomekFX进入 384孔测定板中，终浓度为11nM /孔（负载2.5 μl/孔）。准备所有板一式三份为未处理和药物治疗的条件。使用每个板的前4列阳性和阴性siRNA对照（图2和注2），其可以在图书馆的同一时间或在的当天等分转染。
  注意：板可以事先制备，密封并储存在-20°C，使这是一个合适的停止点。
4. 在逆转染的当天，将板在RT下解冻20 min，并在移除之前以1,000rpm（180×g/g）短暂旋转1分钟封印。在前4列中添加siRNA对照，如果没有这样做在步骤A3
5. 在Opti-MEM培养基中稀释DharmaFECT2（参见注释2-4; 我们使用0.075微升DharmaFECT2/3微升），并添加3微升每孔使用 16通道Xrd-384分配器。点击板，以确保溶液混匀，并在RT下温育平板15分钟
6. 在同时，胰蛋白酶消化并计数一式四份使用的PC9细胞 Countess细胞计数器，并稀释细胞悬浮液适当地。对于PC9细胞，最终细胞数为500个细胞/每个井在80微升。因此，我们制备了15L RPMI（含FCS和Pen/Strep）含有93.75E06细胞（参见注释5），总共402 384孔平板，其是基因组siRNA文库的6个重复（201个平板和用于药物处理的201个平板条件）。
7. 每孔添加80微升细胞悬浮液使用 16通道Xrd-384分配器。
  注意：为了获得最佳反向转染，应将细胞加入siRNA混合物至少15分钟并且在步骤A4之后不超过45分钟。
8. 孵育细胞在孵育器中37℃在Cytomat孵化器中48小时，以确保有效的蛋白质敲除。
  
  图2. 384孔板的布局示例。前四个柱用于对照siRNA，每行含有siRNA 表示在左边。前两列在处理中未经处理药物治疗的条件以确认药物的作用。的剩余的20列用于全基因组文库孔含有不同的siRNA。
药物治疗
1. 使用Biotek PlateWasher清除介质（图1）; 确保活细胞保持附着在孔底部
2. 每孔加入80μlRMPI（补充有FBS和Pen/Strep）或无药物（见注6）使用Xrd-384分配器以中速。
  注意：对于处理的条件，我们离开前两列含有不含药物的对照siRNA以确定杀死实验中药物的效率（图2）。
3. 孵育细胞另外96小时（见注6）。
单元格数量
1. 删除介质。
2. 通过加入90μl的80％冰冷的EtOH固定细胞使用Xrd-384分配器低速。存储板至少1小时 -20℃。
  注意：在-20°C的夜间存储是完全正常的，并在协议中提供了合适的停止点。
3. 以50张为一组执行步骤C15-18。
4. 用板洗涤器用100μlPBS洗涤板3x。
5. 向每个孔中加入20μl的1μg/ml DAPI溶液，并在室温下孵育细胞1小时
6. 用洗板机用PBS洗涤板。
7. 用粘性箔密封件密封板。
  注意：在量化之前，平板可以储存在4°C。
8. 使用Acumen用405nm激光扫描板以定量每个板中的细胞数（参见注7和图3）。
  
  图3.在未处理的条件下板的Acumen输出的示例 A.一旦使用激光405nm通过Acumen扫描板，的染色细胞以绿色阴影表示。注意前四个柱含有对照siRNA（参见图2）。乙。每个孔可以在Acumen软件中单独显示包。这里，呈现两个示例;左井代表a 与阳性对照siRNA相当，这表明 siRNA不影响，细胞活力（> 5,000个细胞）右孔显示影响细胞活力的siRNA的效应（<500个细胞）。
数据分析
1. 使用鲁棒的Z分数计算来标准化每个板内的数据（Birmingham et al。，2009）。对于每个板，确定的中值所有样品（排除包含对照iRNA的前四行）和从每个井中减去该值。用井分隔每口井中值绝对偏差（MAD）以获得鲁棒Z评分。例如，板A中的中值样品值为 1,000个细胞，MAD为200.如果D10含有800个细胞，板A中孔D10的鲁棒Z评分将为（800-1,000）/200 = -1，这表明该孔含有比1的偏差更少的细胞中位数归一化板上的数据，分别为未治疗和药物治疗的条件。确定每个位置a 使用在每个孔位置处的中值和MAD来平滑Z分数所有板，以与前述步骤类似的方式。如上所述，分别计算未处理和的平滑Z分数药物治疗的条件。
2. 绘制平滑的Z分数药物处理的条件对来自未处理条件的那些每个重复（两个条件一式三份给出九个比较总计）。
3. 使用线性回归确定"最佳拟合线"。
4. 计算每个数据点（药物）之间的残差处理与未处理）作为每个之间的垂直距离数据点和'最佳拟合线'。残差<0 表明siRNA在药物条件下的存活率较低比基于未处理的条件的预期，而a 剩余差异> 0表示siRNA是其中的活力药物状况高于基于未治疗的预期可行性。因此，具有正残留差异的siRNA表明在基因敲低时降低药物敏感性的基因注意：结果我们的全基因组siRNA筛选使用这个协议包括在原始手稿中作为补充表（de Bruin et al。，2014）。
5. 为了进一步验证，我们选择了siRNA 在未处理的条件下平滑的Z评分≥2（在细胞中没有细胞杀伤不存在药物）并且中值残差≥2 （脱敏）或≤-2（敏化）。如所描述的（de Bruin等人，2014），通过进行以下步骤来进一步验证该siRNA选择：解卷积siRNA屏幕使用Dharmacon Set 4升级siGENOME siRNA。

笔记

需要确定每个细胞系的阳性和阴性对照。对于PC9细胞，我们使用靶向UBB（泛素B）和靶向PLK1（polo样激酶1）的siRNA的siGENOME siRNA作为阳性杀伤对照;使用siGENOME非靶向siRNA2（SC2），无RISC的对照siRNA（RF）和ON-Target加非靶向siRNA（ON-NT）作为阴性对照。此外，我们留下两列在药物处理板中未处理的对照siRNA，并使用这些柱作为处理对照（图2）。
应该为每个细胞系确定最佳的转染试剂，并且取决于正向或反向转染。我们在96孔板的反向转染中测试了23种不同的转染试剂，每种试剂使用0.1和0.3μl。我们使用LaminA/C siRNA并且定量细胞数目和LaminA/C强度，并且在用LaminA抗体染色后显示低于设定阈值的LaminA/C染色的细胞分数，以评估每种试剂的毒性和击倒效率，如注3.
Lamin A/C染色方案：使用96孔板：如上文在步骤A1-7中所述的转染细胞，继续步骤C12-14。然后加入30μlLaminA/C抗体在含3％BSA的PBS中1：1,000稀释，并在室温孵育平板1-2小时。用PBS洗涤板3x并用30μlAlexa Fluor488驴抗小鼠（在含有PBS的3％BSA中1：1,500稀释）孵育平板。用PBS洗涤板3x并按照步骤C14-17中所述的DAPI染色。使用Acumen eX3和Arrayscan VTi显微镜扫描DAPI（细胞数）和LaminA/C强度（击倒效率）。
鉴定转染试剂（注2）后，需要确定在384孔板中使用的最佳浓度。对于PC9细胞，我们在384孔格式中每孔测试0.025,0.035,0.045,0.055,0.065和0.075μlDharmaFECT 2。
应为每个细胞系确定最佳细胞接种密度。对于PC9细胞，我们在384孔板中每孔测试500,750,1,000和1,250个细胞。我们的目标是在未处理的条件下在实验结束时80-90％汇合
应为每种药物和每种细胞系确定最佳浓度和孵育时间。对于厄洛替尼，我们使用30nM，对PC9细胞的略高于实验测定的IC 50值的浓度偏向导致抗性的siRNA的检测。
优选地，单个细胞应当是可区分的，以允许通过Acumen进行扫描。细胞系应当作为单细胞层生长并且不形成冷凝的团块。每个细胞系应该在进行筛选之前进行测试，以确定细胞数量是否可以通过Acumen或Arrayscan成功量化。我们使用405 nm激光器，6 mW输出，500 V PMT和灵敏度为2.这些设置取决于激光器的寿命，应针对每个细胞系进行优化。

致谢

该方案开发用于鉴定厄洛替尼抗性的新机制的研究（de Bruin等人，2014）。 E. B由荷兰癌症协会的奖学金资助，英国癌症研究所的高通量筛选设施由英国癌症研究所资助。

参考文献

Birmingham，A.，Selfors，LM，Forster，T.，Wrobel，D.，Kennedy，CJ，Shanks，E.，Santoyo-Lopez，J.，Dunican，DJ，Long，A.，Kelleher，，Q.，Beijersbergen，RL，Ghazal，P。和Shamu，CE（2009）。高通量RNA干扰屏幕分析的统计方法国家方法 6（8）：569-575。
DE，Melnick，MA，Gettinger，S.，Walther，Z.，Wurtz，A.，Heynen，GJ，Heideman，DA， Gomenz-Roman，J.，Garcia-Castano，A.，Gong，Y.，Ladanyi，M.，Varmus，H.，Bernards，R.，Smit，EF，Politi，K.and Downward，。减少NF1表达赋予对肺癌中EGFR抑制的抗性。癌症发现 4（5）：606-619。
Hannon，G.J。和Rossi，J.J。（2004）。使用RNA干扰解锁人类基因组的潜力。自然< em> 431（7006）：371-378。
Jiang，M.，Instrell，R.，Saunders，B.，Berven，H。和Howell，M。（2011）。来自学术性RNAi筛选设施的故事; Brief Funct Genomics 10（4）：227-237。