材料和试剂

拟南芥野生型植物（生态型：Col-0）
拟南芥突变体植物（生态型：Col-0）
Stender Vermehrungssubstrat A210,70盆栽土（Stender AG）
种植盆（7 x 6 x 6厘米）
植物托盘和塑料包装
镊子（非无菌）

设备

冷室或冰箱（4℃）
生长室（12小时光/12小时黑暗，21℃/18℃，PFD为约100μmol/m 2/s）
用于测量叶绿素荧光的双-PAM-100（Heinz Walz GmbH，型号：Dual-PAM-100），连接到PC，并通过Dual-PAM软件（见注1）操作。
暗室

软件

双PAM软件

程序

种植拟南芥植物
1. 转移拟南芥属的种子野生型和突变体系以种植完全填充的盆（每盆约20粒种子）浸泡土壤。放置塑料包装覆盖植物以保持必要湿度
2. 将盆放在4℃的托盘中3天，以同步发芽
3. 将托盘转移到生长室中，塑料包装仍然覆盖
4. 通常种子在4-5天内发芽，2天后取出塑料包装。
5. 转移单个植物到新鲜的盆（每盆一个植物）用新鲜的，浸泡的土壤7天后使用轻微弯曲镊子
6. 在与之前相同的条件下培养拟南芥植物另外1或2周。见注2。
记录叶绿素荧光
1. 确保Dual-PAM-100设备已正确连接到PC，并置于黑暗的房间中。
2. 将3-4周龄的拟南芥野生型植物置于暗室中至少30分钟（这种孵育称为暗适应）。执行后续步骤在黑暗中。（可选）打开绿色指示灯处理植物
  
  图1.在Dual-Pam-100设备的测量头之间设置样品叶。对于这里给出的方案（如持续时间6分钟）固定在测量之间头（A）。对于修改的协议，保持植物可能是有用的通过使用测量头（B）之间的附着叶完好
3. 中间年龄（例如第七片叶子顶点通过倒计数）野生型玫瑰花叶和修复它之间双PAM-100测量头（图1A）。（可选）尝试修复叶，仍附着于剩余植物，在测量头之间（图1B）。
4. 打开Dual-PAM软件并定义设置。为了测量叶绿素荧光，选择< Fluo> < SP分析> 模式。典型的设置包括测量光在12μmol/m 2/s/s下，10000μmol/m 2/s/s的饱和脉冲（SP）持续800ms 和70μmol/m 2/s/s的光化性光。保存用户设置，因此允许快速启动。
5. 打开<慢动力学> 窗口并应用测量光约10秒，荧光水平是最小的（F <0> ）。
6. 饱和脉冲的应用将诱导最大荧光水平（F
7. 又一分钟后开启光化灯。调整灯光光化光对生长光的强度（见上文）。执行光化光处理5分钟，荧光水平点在< Report>窗口中称为F （= F ₀
8. 施加第二饱和脉冲，其允许测量光中的最大荧光（F m）。
9. 关闭光化灯，停止录制，导出<慢Kin。文件> 插入表计算程序（例如 Excel），然后重新创建图（图2A）。可选：可以对值进行平均以重新创建图形。用不同的野生型植物重复测量3次，但使用相应年龄的叶（例如来自顶点的第七叶）通过倒计时）。
10. 用暗适应突变植物的叶重复测量（图2B）。
光化学淬灭参数的计算
1. 打开< Report> 窗口。给出了F <0>和 m 的值。根据以下公式计算最大量子产额（Maxwell和Johnson，2000）： < f>< f>/f>/f</sub> =（F sub）/sub>
2. 值在< Report>中给出了在< Report>窗口中的 t （在窗口中的F < 计算PSII光化学的有效量子产率（Maxwell 和Johnson，2000）：

代表数据

图2.野生型（A）和参考PSII突变植物（B）的荧光图，参见注释3. 指示测量光（ML）和饱和光脉冲（SP）的应用。显示了暴露于光化性光，并且荧光参数F0，Fm，F↑和F m分别为表示。

笔记

对于第一次用户，建议从Junior PAM设备开始，因为它易于安装和使用（Heinz Walz GmbH， http://www.walz.com/products/chl_p700/junior-pam/introduction.html ）。

重要的是生长健康的拟南芥植物，因为任何胁迫条件将最终影响光合作用的性能。转移时不要损伤根系。水厂每周大约两次。

典型的野生型荧光图示于图2A中。参考光系统II突变体（psbo1/o2）的荧光图示于图2B中。通过将 psbo1 和 psbo2-2 杂交产生该突变体，其携带在PsbO1的外显子1中的T-DNA插入（图3A）的5'非翻译区（5'UTR）。中断Psb 和 PsbO2 会降低PsbO蛋白水平（图3B）。特别值得注意的是在接通光化性光之后荧光下降到低于F 0值。在PSII突变体中通常观察到伴随降低的F vv/F m值的这种现象（Peng等人，2006; Armbruster >等人，2010; Schneider等人，2014）。几乎任何具有这些特征的PSII突变体生长减少（图3C）

图3.通过使纯合的T-DNA插入系RATM12-1816-1和纯合的T-DNA插入系CSHL-ET9214杂交而产生参考PSII突变体植物（ psbo1/o2 。使用PsbO-和anLhcb2特异性抗体（B），从免疫印迹中推导出的psbo1/o2 突变体系中Psb0蛋白含量降低。野生型和psbo1/o2 突变体植物在生长室（C）中生长4周。

致谢

该协议根据Meurer等人（1995）的以前的工作进行了修改或修改。我们感谢ThiloRühle对协议的讨论和评论。这项工作在Dario Leister教授（Biozentrum der LMUMünchen，Department Biologie I，Munich，Germany）的实验室中进行，并由Deutsche Forschungsgemeinschaft（LE 1265/20-1）至D.L.的资金支持。

参考文献

Armbruster，U.，Zuhlke，J.，Rengstl，B.，Kreller，R.，Makarenko，E.，Ruhle，T.，Schunemann，D.，Jahns，P.，Weisshaar，B.，Nickelsen， Leister，D。（2010）。拟南芥类囊体蛋白PAM68是有效的D1生物发生和光系统II所必需的植物细胞 22（10）：3439-3460。

Maxwell，K。和Johnson，G.N。（2000）。叶绿素荧光 - 实用指南 J Exp Bot 51（345）：659-668。

Meurer，J.，Meierhoff，K.and Westhoff，P。（1995）。拟南芥的高叶绿素荧光突变体的分离及其通过光谱的表征，免疫印迹和Northern杂交。 Planta 198，385-396。

Peng，L.，Ma，J.，Chi，W.，Guo，J.，Zhu，S.，Lu，Q.，Lu，C.and Zhang，L。（2006）。低PSII ACCUMULATION1参与拟南芥中光系统II的有效装配。植物细胞18（4）：955-969。

Schneider，A.，Steinberger，I.，Strissel，H.，Kunz，HH，Manavski，N.，Meurer，J.，Burkhard，G.，Jarzombski，S.，Schunemann，D.，Geimer，，UI和Leister，D。（2014）。拟南芥 Tellurite抗性C蛋白与ALB3一起参与光系统II蛋白质合成。植物杂志78（2）：344-356。