材料和试剂

TLC硅胶60F254板（VWR International，目录号：1.05554.0001）
精密（直径5毫米，精密（Sigma-Aldrich，目录号：Z274275））的Wilmad？
Snap-cap小瓶（VWR International，目录号：548-0555）
原料蜂胶（Nature's Laboratory Ltd，目录号：P5）
乙醇96％v/v（超纯，指定实验室试剂）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10162252）
己烷（用于HPLC，约95％正己烷）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10703611）
乙酸乙酯，超纯，指定实验室试剂（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10080130）
无水硫酸钠，超纯（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10606082）
硅胶60（0.063-0.200mm）（VWR International，目录号：1.07734.1000）
硅胶60H（VWR International，目录号：1.07736.1000）
98％p - 茴香醛（Sigma-Aldrich，目录号：A88107）
酰化硫磺消烟剂（纯）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10222282）
乙酸冰（纯）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10375020）
甲醇（超纯，指定实验室试剂）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10214490）
Sephadex LH-20（Sigma-Aldrich，目录号：LH20100）
α-淀粉酶（Sigma-Aldrich，目录号：53017）
Cycloartenol（Sigma-Aldrich，目录号：08172）
Lupeol（Sigma-Aldrich，目录号：S957712）
二氯甲烷，超纯，用戊烯稳定，指定实验室试剂（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10458210）
氯仿-d（CDCl 3）（Sigma-Aldrich，目录号：10080130）
苯甲醛 - 硫酸试剂（参见配方）

设备

加热超声水浴（340W）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10215332）
Büchi旋转蒸发器，Rotavapor R-210（VWR International，目录号：531-0850）
UV观察箱CC10（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：11778201）
UV灯UVG-11 230V 50/60Hz 4W手持短波（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：11718241）
UV灯UVL-21 230V 50/60Hz 4W手持式长波（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：11728241）
分析天平（VWR International，目录号：611-2267）
精密天平（VWR International，目录号：611-2695）
真空水喷射泵（VWR International，目录号：181-9100）
梨形（分离）漏斗（1,000ml）（Scientific Glass Laboratories，目录号：SFP1L）
圆底烧瓶，250ml（总数12）（Scientific Glass Laboratories，目录号：FRS250/B19或FRS250/B24）
具有六边形底部，硼硅酸盐玻璃，"B"级（25ml和250ml）（Scientific Glass Laboratories，目录号：MCB/25和MCB/250）的玻璃足量筒
锥形锥形烧瓶（500ml）（Scientific Glass Laboratories，目录号：FC500/B24）
过滤漏斗，硼硅酸盐（Scientific Glass Laboratories，目录号：BFF75和BFF100）
橡胶真空管NW8（VWR international，目录号：189.3111）
玻璃巴斯德移液管150mm（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10006021）
玻璃巴斯德移液管230mm（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10209381）
玻璃微量移液管（使用Bunsen燃烧器从玻璃巴斯德移液管自行制备）
用于真空液相色谱（VLC）（Scientific Glass Laboratories，目录号：TBF/4/B24/POR3）的具有锥体和螺纹GL14的Büchner过滤器
用于TLC板的双槽室（VWR International，目录号：552-0011）
玻璃雾化试剂喷雾器（VWR International，目录号：552-0031）
具有烧结盘（Scientific Glass Laboratories，目录号：R2/40）的玻璃色谱柱（CC）
Duratool DO1600热风加热枪（亚马逊）
Whatman定性滤纸，1级（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1001125）
以正负电喷雾电离（ESI）切换模式（Thermo Fisher Scientific）操作的Exactive Orbitrap质谱仪（MS）
JEOL 505HA高分辨率电子轰击（HREI）质谱仪（MS）在70 eV（JEOL USA）的高温（110?160℃）下使用直接探头
JEOL Lambda Delta 400 NMR光谱仪（JEOL USA，型号：JEOL核磁共振光谱仪）

软件

用于MS数据处理的Xcalibur软件（版本2.2）（Thermo Fisher Scientific，型号：Xcalibur软件）
用于NMR处理的Mestre Nova（MNova）软件（版本8.0.0）（Mestrelab Research SL，型号：8.0.0版）

程序

以下描述的整个过程大约需要6周才能完成。除非另有说明，所有步骤在室温（20-25℃）下进行。将蜂胶（约50g）在锥形锥形烧瓶中称重，然后向烧瓶中加入70％乙醇的水溶液（500ml）。
将烧瓶置于高温超声水浴中1小时，60℃
将上清液回收到第二个锥形烧瓶中，如步骤2所述，使用新鲜的70％乙醇（500ml）再次提取原始烧瓶中剩余的原料。重复该过程10次，并合并所有上清液。 >
使用覆盖有滤纸的玻璃过滤漏斗将合并的上清液过滤到圆底烧瓶中。弃去滤纸上残留的不溶物（棕色固体）。过滤的提取物是澄清的琥珀色溶液。将过滤的提取物放在4°C的冰箱中。
在≤40℃下使用旋转蒸发器在减压下将过滤的提取物浓缩在圆底烧瓶中至干。为此，将水浴调节至60℃并施加175毫巴的真空。约30分钟内完全蒸发。
向干燥的提取物中加入蒸馏水（250ml）和纯（96％）乙醇（25ml）得到悬浮液。
将分液漏斗放在金属支架上（图1），关闭其活栓，并将悬浮液缓慢倒入分液漏斗中。
向分液漏斗中加入己烷（250ml），
轻轻摇动漏斗几次。取出顶部塞子，然后让溶剂沉降，直到两个不混溶相。在单独的锥形瓶中回收水相（底层）和己烷相（顶层）。通过缓慢打开活栓并在两种液体之间的弯曲的弯月面到达活栓之前关闭活塞。
将水相放回分液漏斗中。
使用新鲜己烷重复步骤8和10两次
向漏斗中加入乙酸乙酯（250ml），重复步骤9至10（水相为底层，乙酸乙酯相为顶层）。
用新鲜乙酸乙酯重复步骤12两次
将一些无水硫酸钠撒入回收的己烷和乙酸乙酯相中，轻轻地手动旋转锥形瓶以观察浊度（即残余水滴）是否消失。继续喷洒硫酸钠并旋转烧瓶直到液体完全清除
使用覆盖有滤纸的玻璃过滤漏斗将每个有机相过滤到圆底烧瓶中。丢弃残留在滤纸上的不溶物（硫酸钠）。过滤的提取物是澄清溶液;在≤40℃下使用旋转蒸发器在减压下浓缩至干。为此，将水浴调节至60℃，并施加335毫巴（己烷）或240毫巴（乙酸乙酯）的真空。约20分钟内完全蒸发。
在-20℃下储存己烷和乙酸乙酯萃取液
将一部分（5至10g）己烷提取物溶解在10ml合适的溶剂（例如二氯甲烷，乙酸乙酯和/或己烷）中，并与硅胶60（3g）混合。将混合物在20-25℃的工作台上干燥。通常在一夜之间获得自由流动且完全干燥的粉末
将VLC的Büchner过滤器连接到真空水喷射泵，并用硅胶60 H包装。在压实的二氧化硅层上方留出一个空间（约3厘米），以便容纳样品和适当体积的溶剂。使己烷在真空下通过柱以检查柱的均匀性。
将在步骤17中制备的粉末作为薄层（约1cm）缓慢且均匀地铺展到填充的VLC柱的顶部。用极性递增的己烷 - 乙酸乙酯混合物（用100％己烷，己烷/乙酸乙酯95：5,9：1,85：15,8：2,7：3,6： 1，4：6,25：75,3：7,2：8,1：9，最后是100％乙酸乙酯）。每次向VLC柱的顶部加入限定体积的溶剂（约300ml），并施加真空直到柱干燥（图2）（Coll和Bowden，1986; Pelletier等人 >，1986）。在圆底烧瓶中收集各级分，并在≤40℃下使用旋转蒸发器在减压下浓缩至干。为此，将水浴调节至60℃，并施加240毫巴的真空。约20分钟内完全蒸发。
将每个级分（约5-10mg）的等分试样溶解在二氯甲烷（约5ml）中。使用玻璃微量移液器将每个部分的5-10个点作为条带。在薄层色谱（TLC）硅胶板的底部边缘上方1cm处（图3A）。
将滤纸放置在TLC室内，并在室内倒入己烷/乙酸乙酯（8：2，v/v）的混合物（20ml）。在室温（20°C -25°C）下将溶剂留在室中30分钟，以帮助达到溶剂饱和。在第二TLC室中倒入己烷/乙酸乙酯（7:3，v/v）的混合物（20ml）。将点样的TLC板放置在室中，让它们以上升的方向发展，直到溶剂达到约。距离顶部1厘米（图3B）。
将展开的TLC板从室中取出，并使用短波长（λ= 254nm）和长波长（λ= 366nm）在UV光下观察。在板上喷洒茴香醛 - 硫酸试剂（参见配方），并用热风枪将板加热至105-110℃。 1分钟，直至出现色斑（图3C）（Waldi，1965）。计算单个斑点的Rf值，作为从溶剂线到基线的距离（cm）上从斑点中心到基线的距离（以cm计）的比值（Stahl和Mangold，1975; Stock and Rice， 1974）。在用茴香醛 - 硫酸试剂喷雾和加热后，三萜通常在TLC板上显示为亮粉色斑点（图3D）。
第一个粉红色的斑点出现在用己烷中的15％乙酸乙酯洗脱的VLC级分中。将该级分与硅胶60（3g）在二氯甲烷中混合。将混合物在20-25℃的工作台上干燥。通常在一夜之间获得自由流动且完全干燥的粉末
在玻璃烧杯中，在己烷中混合足够的硅胶60以获得具有适当稠度的浆料，以便倾倒以填充CC玻璃柱。在填充浆料时让柱塞旋转打开，以使浆料在柱内沉降。继续将浆料倾倒在柱内，直到二氧化硅颗粒沉降并从柱顶部形成约5cm的水平层。确保在二氧化硅层顶部有足够体积（约5ml）的溶剂，因此包装材料不会变干。注意防止包含任何气泡（注1）（Braithwaite和Smith，1996; Ravindranath，1989）。将粉末部分加到填充柱的顶部。
使用极性增加的己烷和乙酸乙酯混合物进行洗脱（从100％己烷，己烷/乙酸乙酯9:1,8:2,7:3,6:4,1:1,4:6,3:7 ，2:8,1:9，最后是100％乙酸乙酯）（图4）。收集小瓶中的所有洗脱液，并通过TLC分析其内容物（步骤20-22）。
在用茴香醛硫酸试剂（Rf = 0.40，在己烷/乙酸乙酯8：2中）喷雾后，洗脱液之一表现为单个粉红色斑点。在≤40℃下将该洗脱液在减压下浓缩至干，将其溶于氯仿-d（2.5ml）中，并转移至NMR管中。进行1 H，13 C NMR和MS分析以揭示存在四种三萜烯，即α-淀粉酶（HernándezVázquezet al。，2012; Basyuni等人，2006），β-淀粉酶（Basyuni等人，2006; Mahato和Kundu，1994），lupeol（Basyuni等人， et al。，2006; Thanakijcharoenpath和Theanphong，2007）和环木菠萝烯醇（Kamisako等人，1987; Zhu等人，2012）。 >
合并分别用25％和30％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱的VLC级分。使用旋转蒸发器在≤40°C下减压浓缩至干
在玻璃烧杯中，在5％己烷/二氯甲烷中混合足够的Sephadex LH-20（注释2），得到具有适当稠度的浆料，以便倒入填充CC玻璃柱。在填充浆料时让柱塞旋转打开，以使浆料在柱内沉降。继续将浆料倾倒在柱内，直到Sephadex LH-20颗粒沉淀并且从柱顶部形成约5cm的水平层。确保在包装材料表面上只剩下最小量的溶剂，以便不会变干。注意防止含有气泡（注1）。（Determann和Brewer，1975; Kremmer和Boross，1979）。
将合并的级分重新溶解于在二氯甲烷中的5％己烷中，在柱的顶部。
用5％己烷/二氯甲烷洗脱，得到洗脱液，在用茴香醛 - 硫酸试剂喷雾并加热（Rf = 0.23，在己烷/乙酸乙酯8:2中）后，其在TLC上表现为单个粉红色点。在≤40℃下将该洗脱液在减压下浓缩至干，将其溶于氯仿-d（2.5ml）中，并转移至NMR管中。进行1 H，13 C NMR和MS分析以揭示存在两种三萜烯，即甘草酸（Escobedo-Martinez et al。，2012）和氨基酸（Da Silva等人，2005）。
合并分别用40％和50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱的VLC级分。使用旋转蒸发器在≤40℃下减压浓缩至干，并进行凝胶过滤（参见步骤28）。
用5％己烷/二氯甲烷洗脱，得到含亮粉色斑点的洗脱液。
通过CC（参见步骤24）进一步分离该洗脱液，使用增加极性的己烷/乙酸乙酯混合物（从100％己烷，己烷/乙酸乙酯9:1,8:2,7:3,6:4,1:1， 4：6,3：7,2：8,1：9，最后是100％乙酸乙酯）。在用茴香醛硫酸试剂（Rf = 0.40，在己烷/乙酸乙酯7:3中）喷雾后，洗脱液之一在TLC上表现为单个粉红点。使用旋转蒸发器在≤40℃下减压浓缩该洗脱液至干，将其溶解在氯仿-d（2.5ml）中，并转移至NMR管中。进行1 H，13 C NMR和MS分析，显示存在两种三萜，即泛酸酸（Escobedo-Martinez et al。，2012）和双氢酸（Escobedo-Martinez等人，2012）。
将乙酸乙酯萃取物的一部分（5至10g）用极性递增的己烷：乙酸乙酯混合物洗脱（用100％己烷，己烷/2,7：3,6：4,1：1,4：6,3：7,25：75,2：8,1：9，最后是100％乙酸乙酯）（步骤13-15）。 >
分馏用40％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱的VLC级分，通过凝胶过滤（步骤28），用5％己烷的二氯甲烷溶液洗脱，然后用二氯甲烷洗脱，得到双环酸和异富勒酸的混合物（Escobedo-Martinez等al。，2012）以及作为纯化合物的甘草酸和芒果叶酸

代表数据

图1.使用分液漏斗的液 - 液分区的典型设置

图2.真空液相色谱法（VLC）的典型设置

A

B

C

D

图3.薄层色谱（TLC）分析 A.在TLC板上点样样品; B.点样板置于TLC罐中用于洗脱; C.板的加热; D.三萜（粉红色）斑点的Rf值的计算。

图4.柱层析的典型设置

笔记

为了防止气泡的形成，将浆料缓慢倒入塔的内壁上，并且不应该使填充塔干燥。任何气泡都可以轻轻地用手指点击柱子来除去。
也可以使用一些再生的Sephadex ^？ LH-20。后者通过将任何使用的Sephadex LH-20浆液浸入与真空水喷射泵连接的Büchner过滤器中的二氯甲烷和甲醇的混合物中而获得。一旦施加真空，将Sephadex？sup-LH-20在20-25℃下在工作台上风干。

食谱

苯甲醛 - 硫酸试剂（Waldi，1965）
将0.5ml的对 - 茴香醛与10ml冰乙酸和85ml甲醇混合
向该混合物中缓慢加入硫酸（5mL）混合均匀，放入玻璃雾化器（琥珀色）瓶中，并在2-8℃下保存

致谢

该方案改编自以前发表的研究，Kardar等人（2014）。这项工作得到了英国Leverhulme信托基金（研究项目赠款RPG-150）的支持。我们感谢T. Zhang的技术援助和Nature's Laboratory Ltd供应蜂胶。

参考文献

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