材料和试剂

塑料箔（Saran Wrap）
无菌正方形12cm×12cm培养皿（CML HealthCare，目录号：BP 120SJ）
Sterile-R Filtropur S（0.2μM）（SARSTEDT AG，目录号：83.1826.001）
20ml无针无菌注射器（Medline Scientific，目录号：BS-20ES）
50ml无菌管（SARSTEDT AG，目录号：62.547.254）
高压灭菌的1.5ml Eppendorf管（SARSTEDT AG，目录号：72.690）
无菌接种环（Greiner Bio One International GmbH，目录号：731175）
无菌移液器吸头
亲本BY4741酿酒酵母菌株（Winston等人，1995; Brachmann等人，1998）具有基因型MATa， his3Δ1，leu2Δ0，met15Δ0，ura3Δ0）表达：pFL38H载体（Bonneaud等，1991），补充his3Δ1/em>营养缺陷
含有补充his3Δ1营养缺陷型的pFL38H载体和补充ura3Δ0突变的pYX212载体（Ingenius，R& D systems）包括信号肽（Shahzad等人，2013）的拟南芥，即
不含氨基酸且不含硫酸铵的酵母氮碱（YNB）（BD，Difco，目录号：233520）
硝酸铵（NH 4 NO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：A9642）
D（+）无水葡萄糖（C 6 H 12 SO 6）（EUROMEDEX，目录号：UG3050）
琥珀酸（C 4 H 6 6 O 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7501）
氢氧化钾（KOH）（Bio Basic Canada Inc.，目录号：PB0441）
琼脂糖D-5型（EUROMEDEX，目录号：D5）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z4750）
L-亮氨酸（C 6 H 13 NO 3 NO 2）（Sigma-Aldrich，目录号：L8912）
L-甲硫氨酸（C 15 H 11 NO 2 S）（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）
无菌超纯水
0.5 M硫酸锌
10 N KOH（见配方）
0.075 M L-亮氨酸（参见配方）
0.1 M L-甲硫氨酸（参见配方）
无菌液体和固体选择性酵母氮源（YNB）培养基（参见配方）

设备

无菌250ml硼硅酸盐玻璃锥瓶
1000 ml瓶
典型的20μl移液器
高压灭菌器
加热炉（Universal Memmert，型号：400）
新不伦瑞克^TM搅拌器（Eppendorf，moldel：Innova 44）
正常细胞密度计（Thermo Fisher Scientific，型号：40）
层流罩（ADS，型号：VP120）
离心机（Eppendorf，型号：5804R）
整体式水净化系统（Merck Millipore Corporation，型号：Milli-Q +）
扫描仪（爱普生，型号：124OU）

程序

注意：对于每个要分析的酵母克隆。
第-1天

使用无菌接种环接种待测试的每个酵母克隆在20ml无菌250ml玻璃瓶中的液体选择性YNB培养基中注意：对每个构建体（含有重组质粒或对照质粒）测试至少三个独立的酵母克隆。
在30℃下在200rpm搅拌下培养酵母细胞过夜（O/N）。

第0天
准备培养皿滴试验。

制备无菌选择性YNB固体培养基，含有适当的氨基酸和适当的硫酸锌浓度进行测试
在层流通量罩下，在每个正方形12cm×12cm培养皿中倒入50ml无菌选择性YNB固体培养基。
注意：对锌过量的耐受性通常在最后测试浓度为23,25,27.5,30和32.5mM。控制条件为 ?不含锌（≈1.4μM）。亮氨酸和甲硫氨酸营养缺陷型是 ?通过向其中添加相应的氨基酸来补充最终浓度分别为0.75mM和0.33mM。
让介质固化，盖子打开，在15分钟。关闭和存放方形的培养皿在敞篷下。
准备酵母进行液滴测定。
注意：所有随后用酵母的操作在无菌条件下在层流罩中进行。
在无菌的50ml Falcon管中转移O/N酵母培养物
在室温下以5,000xg离心5分钟。
弃去上清液。
用相同体积的无菌水（20ml）悬浮酵母培养物
重复步骤7到9.
在合适的稀释度（通常为1/10）后测量600nm处的光密度，以获得约0.4的OD <600> nm 。
在1.5ml无菌Eppendorf管中，进行适当的酵母培养用无菌水稀释，以便在500μl中达到OD 600nm 1分之一体积，然后进行连续稀释，以便达到10μM-1的OD 600nm sub。 ?10 ^-2，10 ^-3
使用移液器和无菌过滤嘴将每种酵母稀释液10μl滴到选择性YNB上补充有各种最终浓度的ZnSO 4的培养基 ?1）。
注意：
1. 对于步骤10至12：酵母细胞沉积特别快;因此确保充分搅拌酵母菌培养物 ?在采集样品之前和/或在测量a的光密度之前悬浮和/或滴液测定之前。
2. 对于液滴测定，将每个液滴的中心分开≈1cm。
允许滴在层流通量罩下干燥
关闭培养皿，并包装他们的塑料箔（类型Saran Wrap）。
在30°C孵育箱中倒置孵育
每天监测酵母生长，并通过扫描记录结果培养皿在黑色屏幕下以每英寸600点（dpi）分辨率（通常每次扫描少于一分钟）。对于每个锌浓度，将表达目的蛋白质的酵母与酵母进行比较拥有空的pYX212 注意：对照板，即不含锌添加，通常在孵育后2天读取。这是必要的验证目标蛋白的表达不会干扰酵母在非常低的锌浓度下生长。镀锌板测定（在加入锌时）通常在4至7天后读取孵化。

代表数据

图1. 体外氨基酸取代影响AhPDF1.4和AtPDF1.4锌耐受能力的功能特征。系列稀释的酿酒酵母BY4741菌株，其表达携带AhPDF1.4，AtPDF1.4或其突变形式的pYX212空载体（EV）或pYX212。产生A28至G（A28G）或S54至R（S54R）或两者（A28G-S54R）的替换。将各种酵母转化体点样在补充有1.4μM（对照）或27.5mM ZnSO 4的培养基上，如上图所示。每个点用10μl在下面提到的OD 600nm处稀释的酵母培养物制备。在第2天拍照用于对照，第11天用于Zn处理;它们是用三个独立的酵母转化体进行的三个实验的代表。转载自（Shahzad等人，2013;补充图4）。

笔记

BY4741 S。酿酒酵母菌株具有几种营养缺陷型，特别是用于产生氨基酸组氨酸（his3Δ1）。游离组氨酸是有效的金属螯合剂，并且如果该金属存在于培养基中，则可以特别地螯合锌。因此，组氨酸（ε3Δ1）营养缺陷型必须通过相应的HIS 基因（这里从pFL38质粒表达）的表达互补，而不是通过加入游离组氨酸，这将偏差锌耐受性试验。

食谱

10 N KOH
使用Sterile-R Filtropur S（0.2μM）过滤灭菌保持在+4°C
0.075μML-亮氨酸使用Sterile-R Filtropur S（0.2μM）过滤灭菌保持在+4°C
0.1M L-甲硫氨酸使用Sterile-R Filtropur S（0.2μM）过滤灭菌保持在+4°C
无菌液体和固体选择性YNB培养基（1 L）
1. 混合在超纯水中
  不含氨基酸而不含硫酸铵的YNB：1.7g
  NH 4 NO 3：6.4g
  D-葡萄糖：20g
  琥珀酸：5.9g
2. 用10 N KOH将pH调节至4.5
3. 调整体积并在1000 ml瓶中分装500 ml
4. 对于固体媒体添加：
  琼脂糖：20g/L
5. 在120℃下高压灭菌20分钟
6. 冷却固体培养基后，加入必要的无菌氨基酸补充营养缺陷型（这里是亮氨酸和甲硫氨酸）的溶液无菌锌，以达到将要测试的浓度注意：应注意加入必要的无菌氨基酸溶液 ?和固体培养基冷却至约40至45℃时的无菌锌。这将防止加入的氨基酸的降解和金属沉淀。

致谢

这项工作得到了蒙彼利埃大学（LM），法国巴黎高等教育委员会（PB），巴基斯坦高等教育委员会（ZS）和国家科学研究中心（FG）的支持。

参考文献

Bonneaud，N.，Ozier-Kalogeropoulos，O.，Li，G.Y.，Labouesse，M.，Minvielle-Sebastia，L。和Lacroute，F。（1991）。低和高拷贝复制，整合和单链的家族。酿酒酵母。大肠杆菌穿梭载体。酵母 7（6）：609-615。
Brachmann，C.B.，Davies，A.，Cost，G.J.，Caputo，E.，Li，J.，Hieter，P.and Boeke，J.D。（1998）。来源于酿酒酵母的设计者缺失菌株S288C：一组有用的菌株酵母 14（2）：115-132。
Mirouze，M。，Sels，J.，Richard，O.，Czernic，P.，Loubet，S.，Jacquier，A.，Francois，IE，Cammue，BP，Lebrun，M.，Berthomieu，P.andMarquès， L.（2006）。植物防御素的假定新颖作用：来自锌超累积植物的防御素，拟南芥halleri ，赋予锌耐受性。植物J 47（3）：329-342。
Shahzad，Z.，Ranwez，V.，Fizames，C.，Marquès，L.，Le Martret，B.，Alassimone，J.，Gode，C.，Lacombe，E.，Castillo，T.，Saumitou-Laprade， P.，Berthomieu，P。和Gosti，F。（2013）。植物防御素1型（PDF1）：拟南芥属中的蛋白质混杂和表达变异揭示在拟南芥中的锌耐受性获取。新植物 200（3）：820-833。
Winston，F.，Dollard，C.and Ricupero-Hovasse，S.L。（1995）。构建一组方便的与S288C同基因的酿酒酵母菌株。酵母 11（1）：53-55。