材料和试剂

直径15μm的Monodur尼龙过滤器（Filtravibracion S.L.，目录号：尼龙-15）
2 ml Eppendorf管
无菌塑料漏斗（直径80mm）（Tecnylab，目录号：45000150）
5mm直径的玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：18406-500G）
微量滴定板（TermoFisher Scientific，目录号：2205）
<尖孢镰刀菌 f.sp.来自野生型和Δ con 7-1 突变株的 lycopersici
无菌dH 2 O 2/b
马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）（Scharlau，目录号：01483）
甘油（Merck，目录号：104092）
葡萄糖（Coger SAS，目录号：24379.363）
Na 2 CO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S2127）
葡萄糖（GO）测定试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：GAGO-20） GO测定包括：

葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂（Sigma-Aldrich，目录号：G3660）
邻联茴香胺试剂（Sigma-Aldrich，目录号：D2679）
葡萄糖标准溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G3285）

ACS试剂（Merck，目录号：108131.1000），H 2 SO 4 SO 4。
MgSO 4·7H 2 O（Merck，目录号：1058865.5000）
（Merck，目录号：104873.1000）</b>
KCl（Merck，目录号：104933.0500）
（Merck，目录号：101187.1000）
（Merck，目录号：103965.0500）
ZnSO 4·7H 2 O（Merck，目录号：108883）
MnSO 4 H 2 O（Merck，目录号：105941）
0.1％苯甲酸
提取缓冲液（参见配方）
合成介质（SM）（参见配方）
H sub 2 SO SO 4 sub（12 N）（参见配方）

设备

Mini-BeadBeater-16匀浆器（BioSpec Products）
轨道孵化器（Infors，Multitron Pro）
无菌刮刀（Fisher Scientific，目录号：S50821）
微量离心机（Fisher Scientific，Eppendorf ^TM MiniSpin plus ^TM）
血细胞计数器（Thoma）（Marienfeld，目录号：06 40710）
荧光计（TECAN，SpectraFluorPlus，型号：F129005）
冷冻干燥机（Virtis，型号：BT4KZL-105）
水浴（Selecta，型号：6000138）
Vortex（IKA，型号：MS2 Mini摇动器）

程序

F。尖孢镰孢野生型菌株4287（种族2）从J.Tello，Universidad de Almeria，Spain获得。 Δεcon7-1突变体缺乏对于形态发生和毒力必需的转录因子，如前所述（Ruiz-Roldan等人，2015）。将菌株在-80℃下与30％甘油一起储存为微小分枝悬浮液。
对于新鲜的小分生孢子生产，将冷冻的微小分生孢子的等分试样接种到100ml马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中，并在轨道培养箱中在150rpm和28℃下孵育3天。然后通过置于漏斗上的Monodur尼龙过滤器过滤培养物以分离菌丝体（图1A），并在3,020×g离心5分钟以收集微小分生孢子。最后，将含有新鲜微小分生孢子的沉淀重悬于1ml无菌dH 2 O中，并使用血细胞计数器计数。

图1.过滤和菌丝体收获程序。A.通过置于漏斗上的Monodur尼龙膜过滤真菌培养物。 B.随后通过使用刮刀刮尼龙膜收获菌丝体
将含有4×10 8个新鲜获得的小分生孢子的等分试样接种到含有0.05或2.5％葡萄糖的100ml SM中，并在170rpm和28℃下生长24小时。
通过Monodur过滤收获后，用无菌dH 2 O 2洗涤菌丝体两次，使用刮刀通过刮擦从过滤器分离（图1B），并最后冻干。
菌丝体干重是使用精密称重秤测定的注意：通常，从100ml培养物获得的干燥菌丝体的量在5和10μg之间变化。
在干重测定后，将样品引入含有5mm直径玻璃珠的2ml Eppendorf管中，并使用Mini-BeadBeater匀浆器分别通过3个循环的30个循环的30秒的搅拌进行破碎。然后将样品重悬于250μl的0.25M Na 2 CO 3中，并在95℃下在水浴上孵育4小时。
通过在5,000xg离心3分钟收获上清液。
还测定来自不同菌株的培养物上清液中残留的葡萄糖的量
从葡萄糖标准曲线计算葡萄糖水平，并参考每个菌株中的菌丝体干重。使用葡萄糖测定试剂盒GAGO（ https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/gago20bul.pdf ）这些说明的制造商有一些修改（下划线所示）。
注意：用独立的生物样品重复测定三次。

试剂准备

葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂。将未开封的试剂盒试剂保存在2-8°C。每个胶囊含有500单位的葡萄糖氧化酶（黑曲霉），100个紫红荧露单位的过氧化物酶（辣根）和缓冲盐。将该胶囊的内容物溶解在带有39.2ml去离子水的琥珀色瓶中。该溶液在2-8℃下至多一个月是稳定的，并且在-20℃下冷冻至少6个月。如果浑浊发展，则舍弃。
- 联苯胺试剂。将未开封的试剂盒试剂保存在2-8°C。尽量减少暴露在光线下。预称重的小瓶含有5mg邻联茴香胺二盐酸盐。用1.0ml去离子水重构邻二氮甲啶小瓶的内容物。倒置小瓶几次溶解。避免将试剂暴露在光下。溶液在2-8℃下稳定3个月。
通过向含有39.2ml葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂的琥珀色瓶中加入0.8ml的偶联物试剂来制备测定试剂。倒置瓶几次混合。尽量减少暴露在光线下。溶液在2-8℃下稳定至1个月。如果浑浊发展或出现颜色变化，请舍弃
葡萄糖标准溶液。 D-葡萄糖，1.0mg/ml在0.1％苯甲酸中。本标准可溯源至NIST标准，并提供即用型。它在2-8℃下稳定至少6个月。如果发生浑浊，请丢弃。

标准曲线

通过将dH 2 O中的1.0mg/ml储备液稀释至0（试剂空白）至80μg/ml的最终浓度来制备低浓度D-葡萄糖标准溶液。
移取40微升等分的稀释的D-葡萄糖标准溶液到微量滴定板中
通过向每个孔中加入80μl测定试剂并混合来开始反应
在37°C孵育恰好30分钟。通过向每个孔中加入80μl12N H 2 SO 4 4终止反应。用移液器充分混匀几次。
在540nm处测量针对试剂空白的吸光度
绘制540nm处的吸光度（Y轴）对葡萄糖的μg（X轴）（图2）。如果标准曲线不是线性的，结果将不准确。通常使用该试剂盒获得约0.99的R值。

样品分析

按照标准曲线中给出的指示，用D-葡萄糖标准溶液代替稀释250倍的40μl真菌实验样品。
注意：根据样品，可能需要优化稀释因子。
从标准曲线计算实验样品中D-葡萄糖的量（图2）。
将上面测定的mg葡萄糖乘以样品制备中的稀释因子（×250）
以μg表示mg葡萄糖，在每种情况下以μg表示干燥菌丝体的量

代表数据

图2显示了用于计算葡萄糖浓度的代表性标准曲线

图2.用于计算葡萄糖浓度的代表性标准曲线 A.稀释的D-葡萄糖标准溶液在540nm处的代表性吸光度值。 B.吸光度值（Y轴）对标准品葡萄糖的μg的图形表示（X轴）
在本实施例中，540nm处的吸光度值为0.35表示我们的测试样品含有：
图3显示了遵循该协议获得的数据的代表性实例

图3.在使用葡萄糖测定试剂盒GAGO计算的含有2.5％葡萄糖的合成培养基中生长24小时后不同真菌菌株的培养物上清液中的细胞外葡萄糖。条带代表从三个独立实验计算的标准误差，三次重复每个

食谱

提取缓冲区
在去离子水中溶解0.25M Na 2 CO 3。
合成介质（SM）
0.2g/L MgSO 4·7H 2 O·h/v 0.2g/L KH 2 PO 4 sub/
0.2 g/L KCl
1g/L NH 4 NO 3 sub/
0.01g/L FeSO 4
0.01g/L ZnSO 4 7H·7H 2 O 0.01g/L MnSO 4·H 2 O·n / 10g/L葡萄糖溶解在去离子水中通过高压灭菌消毒
4 （12 N）将16.7ml 36N储备溶液加到33.3ml去离子水中

致谢

这项研究由Junta de Andalucia（Proyecto de Excelencia CVI-7319）和西班牙经济部长竞争委员会（授予BIO2013-47870和Ramon y Cajal计划）支持。该协议改编自Ruiz-Roldan等人，2015年。

参考文献

Bergmeyer，HU和Bernt，E。（1974）。酶分析。纽约，纽约：1205-1212

Di Pietro，A。和Roncero，MI（1998）。克隆，表达和在编码血管枯萎病原体尖孢镰刀菌的主要细胞外内聚半乳糖醛酸酶的pg1的致病性中的作用。 Mol Plant Microbe Interact 11（2）：91-98。

Ruiz-Roldan，C.，Pareja-Jaime，Y.，Gonzalez-Reyes，JA和Roncero MI（2015）。转录因子Con7-1是尖孢镰孢形态发生和毒力的主要调节剂 Mol Plant Microbe Interact 28（1）：55-68。

，，Fan，HW，Xu，Ye，Y，Pan，Pan，，，Pan，，，，，Zhu， Li，Q.，Bao，YY，Nijhout，HF和Zhang，CX（2015）。两种胰岛素受体决定在蚱蜢中的替代翼变体。 Nature 519（7544）：464-467。