材料和试剂

15 ml带圆锥底部的离心管
50ml锥形底部的离心管，
500 ml带圆锥底部的离心管
1.5 ml微量离心管
1 ml注射器
1 ml Bio-Scale mini Macro-Prep高Q离子交换柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：7324120）
Amicon Ultra-4离心过滤器（30,000 NMWL）（EMD Millipore，目录号：UFC803024）
Amicon Ultra-100离心过滤器（100,000 NWML）（EMD Millipore，目录号：UFC910024）
硅藻
液氮
聚乙烯吡咯烷酮（PVPP;不溶性）（Sigma-Aldrich，目录号：77627）
附加材料要测试Rubisco活动（可选）：
标记的CO 2（作为NaH 14 O 3（5mCi））（PerkinElmer，目录号：NEC086H005MC）
核酮糖-1,5-二磷酸盐（RuBP;如Kane等人，1998）所述合成，纯化和无菌储存）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9967或27225）
注意：产品乙酸（A9967）已停产。
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：M1770或494437）
注意：产品甲醇（M1770）已停产。
可溶性蛋白质（通过Bradford测定法测定）（考马斯加分析试剂盒）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：23236）}
使用天然和SDS-PAGE（可选）测试蛋白质的其他材料：
凝胶代码蓝色染色（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：24590）
4-12％Tris-甘氨酸微凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：XV04120PK20）
4-12％Bis-Tris凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：NP0321PK2）
SDS-PAGE的SDS还原缓冲液（参见食谱）
用于SDS-PAGE的TBS缓冲液（参见食谱）
AttoPhos试剂（Astral Scientific，Gymea，NSW，Australia）
Antisera针对三角褐指尖中Rubisco的大亚基全酶提取
碱性磷酸酶共轭二抗}}
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪丙磺酸（EPPS）（Sigma-Aldrich，目录号：E9502）
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
植物蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P9599）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
三乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：90279）
醋酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：M5661）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
提取缓冲液（见配方）
列缓冲区（见配方）
柱洗脱缓冲液（参见食谱）
特异性（S/C/O）缓冲区（见配方）

注意：所有化学品均为A.C.S.等级。

设备

法国压力容器（Thermo Fisher Scientific，型号：FA-078）
库尔特计数器Z系列（Beckman Coulter，型号：Z系列库尔特计数器）
离心机（大体积[1L]，2,000xg，小体积[<15ml]，17,600×g，4℃）
通风柜
Superdex 200（GE Healthcare，目录号：17517501）
FPLC（ÄktaPure 25）在4°C下使用Superdex 200/30进行尺寸排阻色谱（GE Healthcare，型号：ÄktaPure 25）
确认Rubisco的纯化和活性：

蛋白质转移装置和免疫印迹想象设备 - 检查提取的Rubisco的丰度和纯度
放射性同位素实验室和相关隔膜盖的小瓶和注射器

程序

总可溶性细胞（粗）蛋白质提取 - 适用于测量CO 2（KCl）的Michaelis常数，催化更换率（k o） ^c），而CO ₂/O _{2特异性测定（S C/O））。将硅藻在无菌海水中在20℃下在连续光（c.150μmol光子m ^{sec ^-1）在20℃下在2L批次培养物中生长，其中过滤0.2μM添加营养素，维生素和微量金属，以得到如Aquil培养基中所定义的最终浓度。有关制作Aquil食谱的完整食谱和指南，请参阅Sunda等人，2005年。通过使用库尔特计数器进行细胞计数来监测生长速率。在指数生长期间，在15℃下通过温和离心（2,000×g×10分钟）将细胞浓缩至沉淀，并弃去上清液。需要大约1g细胞沉淀来纯化Rubisco以测量S C/O 。为了限制储存空间，将细胞收集到1.5ml微量离心管中，然后在液氮中快速冷冻并储存在-80°C直到进一步分析。}
将细胞沉淀物重新悬浮在15ml聚丙烯管中的总共5ml冰冷萃取缓冲液中。使用预冷法国压力机在140MPa下破裂细胞（参见图1和法国印刷机的视频1），并将细胞裂解物收集到相同的管中。

图1.使用法国印刷机进行细胞裂解法国压力计的照片可以有效地裂解微藻细胞，包括硅藻。将冰冷缓冲液中的藻细胞提取物置于冰冷的不锈钢法国压力池中并施加液压。一旦在140MPa，电池的出口被缓慢打开。当细胞从高到环境压力出现时，细胞裂解，并将细胞提取物收集到15ml或50ml聚丙烯管中。保持样品从细胞的缓慢流速（〜1〜2滴sec ^-1），以确保压力保持（见视频1，确认Bratati Mukherjee）。 >
<！ - flashid2191v195开始 - > 视频1.使用法国新闻界裂解细胞

<！ - flashid2191v195结束 - >

向细胞裂解物中加入聚乙烯吡咯烷酮（1％，w/v）以结合次级代谢物，然后通过离心（17,600×g，4℃，5分钟）除去。

离心后，Rubisco通过天然PAGE（参见数据分析，图2）证实完全完整，完全可溶，保留在细胞裂解上清液中，通过SDS-PAGE证实（参见数据分析，图3）。

）通过^{14 2 2 固定分析定量（参见数据分析）。}
可溶性蛋白质提取物中的Rubisco通过15mM NaH 14和30mM MgCl 2活化10至15分钟。

在7ml间隔盖玻璃闪烁瓶中，将20μl提取物在0.5ml 50mM EPPS-NaOH pH8.2,10mM MgCl 2，0.6mM RuBP，10μg/sup> -1 碳酸酐酶和不同的NaH浓度（1.2〜12mM，相当于〜15〜150μM±14％在25℃，pH 8.0下）（Sharwood等，2016）。将缓冲液和小瓶用适当的O 2 N 2 N 2气体混合物平衡，然后加入NaH 4 SO 3气体混合物， sub>和sample。

用0.2ml 0.5N甲酸停止反应，并在通风橱中通过加热85℃的小瓶来排出非固定的14"CO 2"。

将干燥的残余物溶解在0.5ml双蒸馏的H 2 O中，并在标记的3-磷酸甘油酸（^{14℃）之前用1ml Scintillant（Pakard，Ultima Gold XR）涡旋，在闪烁计数器中测量。这种粗提取适用于测定Rubisco最大羧化率（ max ）和对于CO 2的Rubisco Michaelis常数 C）和21：79％O 2 > ^air）（Sharwood等人，2008; Sharwood等人，2016）。要量化 sub> max 值除以测定中的Rubisco含量。使用¹⁴ C-CABP结合方法或通过免疫印迹分析测量Rubisco含量。这两种方法的准确性和实验限制在Whitney和Sharwood于2014年详述。Rubisco的纯化对于测量S/O 是必需的（见下一步）。}}
用于测量S/O
的Rubisco纯化在量化S C/O（CO 2/2/O 2特异性）之前需要进一步纯化可溶性细胞蛋白。
1. 通过注射器通过用柱缓冲液平衡的1ml Bio-Scale mini Macro-Prep高Q离子交换（IEX）柱手动通过来自上述步骤A3的可溶性细胞蛋白。所有步骤都在4°C进行。该方法包括：预先清洗IEX柱是用2ml柱缓冲液。可溶性细胞蛋白通过注射器通过柱（流速为〜3至5ml/min），然后用8ml柱缓冲液洗涤柱。结合的Rubisco在1.5ml柱洗脱缓冲液中洗脱，收集三个500μl洗脱级分。最后两个分数含有> 90％的Rubisco活性，因此通过使用Amicon Ultra-100离心过滤器（即<！ - SIPO - >）离心（4,000xg，10分钟，4℃）浓缩至约0.4ml之前，/em> 100kDa MW截止滤光片）
2. 将浓缩的Rubisco注射到Äkta纯化系统的200μl样品环中，在4℃下用S/C/O缓冲液预平衡的Superdex 200柱上。将样品加载到柱上，使用0.5ml/min（最大三柱柱压力报警设定为1.5MPA）的流速和在空隙体积（8ml）之后收集的级分（0.5ml）。连续监测280nm处的吸光度和电导率。测定级分中的RuBP依赖性 CO ₂ 2 2 2-活性，并将具有峰Rubisco活性（通常为5至7级）的那些合并，并通过离心浓缩至约0.1ml （4,000xg，20分钟，4℃），使用Amicon Ultra-100离心过滤器。
3. 浓缩和纯化的Rubisco现在已经准备好进行S/C/O检测。或者，甘油可以加入到20％（v/v）终浓度，然后酶在液氮中冷冻并储存在-80℃。
4. 可选：S/C/O检测（不是本协议中Rubisco提取的一部分）
  1. 在25℃（或其他温度）下，根据（Kane e）的方法进行S/O ，1994）。将纯化的Rubisco（10-50μl）注射到含有1ml测定缓冲液（参见食谱）的20ml玻璃，隔膜密封的玻璃小瓶中，该缓冲液已经用500ppm CO 2平衡了0.5至1小时使用Wostoff气体混合泵与O 2混合。 15分钟后进一步平衡，注入1nmol的2- ^{H-RuBP引发反应。在30分钟后注入碱性磷酸酶，将3-磷酸甘油酸（羧化产物）和2-叔丁氧羰基乙酸酯（氧合产物）转化成3' H-3-甘油酸酯和H 3 - 羟基乙酸酯。}
  2. 将反应物通过0.4ml AGI-X8（10％甲酸盐）阴离子交换柱，然后将结合的3-H-3-甘油酸酯和3-sup-3-H-2-乙醇酸在0.5ml 20％（v/v）H 2 SO 4中洗脱，然后通过HPLC分离它们，使用0.012Mg 2 /通过Aminex HPX-87H柱在65℃下以0.4ml /分钟的流速通入SO 4。
  3. 然后根据3-H 3 H-甘油酸酯和3-H-3-甘油酸酯的放射性计算25℃下的S/C/O，乙醇酸使用公式：
    
    哪里，
    表示O 2和CO ₂（99.95％和0.05％[v/v]），
    0.037是在25℃下H 2 O 2中的CO 2 <2>的溶解度的比例（Kane等，/em>。，1994）。

数据分析

提取过程中完整的Rubisco保留在可溶性部分中确定使用法国压力池常规获得全细胞裂解，并且Rubisco在粗提取期间保持完整并在可溶性级分内（步骤A1-A3）。天然PAGE（图2）显示Rubisco保留为完整的L 8 S 8 N酶（包含8个大的[L]和8个小[S]亚基）），即使在电泳在4℃和60V下16小时。由于亚基序列差异和四分体结构性质的微妙变化，物种之间Rubiesico带的不同迁移率发生，氨基酸序列的轻微差异和长度）。 SDS-PAGE（图3）表明，在全细胞裂解（机械破裂后但离心前，步骤A2）和可溶性细胞蛋白（离心后步骤A3）中检测到相当水平的Rubisco L和S-亚单位，表明提取的Rubisco是完全可溶的
Rubisco在提取后保留活动
在11种硅藻种类的粗提物（步骤A1-A3）中Rubisco的活性进行了测试和公布（Young等人，2016）。在25℃提取10分钟后获得Rubisco的完全活化，并且在进一步的10分钟测试期间活性保持稳定。 c 硅藻Rubiscos发表于（Young等人，2016）。
量化S C/O（步骤B1-B4）。图4显示了用于计算S的HPLC分离的3-H-甘油酸酯和3-OH-羟基乙酸酯峰的³ H-洗脱曲线如上文步骤B4c所述。

图2.原始提取物的天然PAGE印迹显示完全完整的Rubisco蛋白总可溶性细胞提取物（通过Bradford测定法测定的5μg，考马斯加）通过预制物4在4℃下分离-12％Tris-甘氨酸凝胶在60V下过夜（16小时）。用去离子水漂洗凝胶，用45％（v/v）H 2 O，5％（v/v）乙酸和50％（v/v）甲醇，如果去离子水，则多次漂洗。使用Gelcode blue考马斯染色（Invitrogen）显现蛋白质。箭头表示〜520kDa的Rubisco复合物（L 8 S 8 S 8）位于凝胶上。泳道数字表示来自不同硅藻种类的提取物：（1）海水沙门氏菌CCMP 1336，（2）海洋细胞沙门氏菌CS-427，（3）骷髅马蹄毒 CCMP 1332，（4）ae os rans rans>> CC 16 16 16 16>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> ，（7）Ph> um um>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>贝勒诺卡 sp。 CS-874/01，（11）等sis sis>>。。 CS-177，（12） CS-287。最后三条通道含有5,10和20μl来自烟草的粗细胞提取物作为对照。显示了通过¹⁴ C-CABP结合定量的每个样品的Rubisco活性位点内容（Whitney和Sharwood，2014; Sharwood等人，2008）。

Fi gure 3。通过法国压力池裂解产生Rubisco溶解度，完整性和完全提取的SDS-PAGE分析。A.考马斯染色和B.硅藻Rubisco抗体印迹（参见Whitney总细胞溶胞产物（L，以下法国压力细胞裂解法）的细胞裂解物（L，）和可溶性细胞蛋白（S，离心后），从硅藻种类：（1） ricornutum >
（5）Cylindroheca fusiform 我 CS-13，（6） CS> 427和（7） CSL 1336.加载5μl烟草可溶性叶蛋白进行比较。在L和S蛋白级分中，L亚单位的强度相等，表明所有的Rubisco都被提取（完全细胞裂解），并且在Western印迹中没有明显的L-亚基降解而完全溶解。样品制备和电泳：将蛋白质（L或S）提取物（150μl）加入到4×SDS-缓冲液（50μl）中并煮沸5分钟，然后离心（16,000×g Rubisco（参见惠特尼，2001，进一步的实验细节）。

图 4。 3用于 计算S 的HPLC部分的H-洗脱曲线从³ H的量 3 和^3根据 中描述的H-乙醇酸（峰 1和2分别 ）步骤B4c。这里显示了使用来自硅藻的纯化Rubisco的测定结果，所述测定使用来自硅藻的纯化的Rubisco（例如，Halassiosira weissflogii Tw，red）和 P haeodactylum tricornutu （Pt，blue），显示每个技术复制（rep）。

食谱

提取缓冲区
50mM EPPS-NaOH，pH 8.0
1 mM EDTA
2mM二硫苏糖醇（DTT）
1％（v/v）植物蛋白酶抑制剂混合物
将EPPS和EDTA溶于去离子水中至最终所需浓度用NaOH将pH调至8.0 注意：
1. 在开始提取之前添加DTT。
2. 在使用之前，将蛋白酶抑制剂混合物加入用于提取的缓冲液等分试样。
列缓冲区
50mM EPPS-NaOH，pH 8.0
1 mM EDTA
10 mM NaCl
将去离子水中的所有盐溶解至最终所需浓度
用NaOH将pH调至8.0
柱洗脱缓冲液
50mM EPPS-NaOH，pH 8.0
1mM EDTA
0.8 M NaCl
将去离子水中的所有盐溶解至最终所需浓度
用NaOH将pH调至8.0
特异性（S/C/O）缓冲区
30mM三乙醇胺
15mM乙酸镁，pH8.3
将去离子水中的所有盐溶解至最终所需浓度
用乙酸将pH调至8.3 储存于4°C
测定缓冲液（1 ml）
30mM三乙醇胺
15mM乙酸镁，pH8.3
10μgml 碳酸酐酶
用于SDS-PAGE的4x SDS还原缓冲液（可选）
125mM Tris-HCl pH 6.8
4％（w/v）SDS
0.01％（w/v）溴酚蓝
20％（v/v）甘油 75mM 2-巯基乙醇
将去离子水中的所有盐溶解至最终所需浓度
使用前加入甘油和2-巯基乙醇
用于SDS-PAGE的BS缓冲液（可选）
10mM Tris-HCl，pH7.5
150 mM NaCl
将去离子水中的所有盐溶解至最终所需浓度的

致谢

我们感谢审稿人提供有用的意见，改进了文章。通过ANU访问学者（CE140100015）和NSF Grant 1040965为J. N.Y.提供资金。A.H.通过Clarendon奖学金，牛津大学和澳大利亚国立大学访问学者（CE140100015）资助。 R.E.S是通过ARC DECRA计划（DE13010760）资助的。 R.E.M.R.通过ERC起始授权（SP2-GA-2008-200915），F.M.M.M.通过NSF Grant 104095资助，S.M.W由澳大利亚研究委员会授予的CE14010001资助。我们要感谢Bratati Mukherjee在法国新闻录像带上的协助。

参考文献

Andrews，TJ（1988）。通过蓝细菌核酮糖 - 完全不存在小亚基的二磷酸羧化酶大亚基。生物 263（25）：12213-12219。 br />
Falkowski，PG和Raven，JA（2007）。水生光合作用 em>大学按。
Galeries，J.，Kapralov，MV，Andralojc，PJ，Conesa，MA，Keys，AJ，Parry，MA和Flexas，J。（2014）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24689692"target ="_ blank">扩大植物物种Rubisco动力学变化的知识：环境和进化趋势。计划细胞环境37（9）：1989-2001。
Kane，HJ，Viil，J.，Entsch，B.，Paul，K.，Morell，MK and Andrews，TJ（1994）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： publish.csiro.au/fp/PP9940449"target ="_ blank">用于测量核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶的CO 2/2/2/2特异性的改进方法。 a> Au 4）：449-461。
Kane，HJ，Wilkin，JM，Portis，AR和John Andrews，T.（1998）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9662549"target ="_ blank">通过核酮糖-1,5-二磷酸盐中的氧化杂质对核酮糖 - 二磷酸羧化酶的有效抑制。 em> Physiol 117（3）：1059-1069。
Losh，JL，Young，JN and Morel，FMM（2013）。 Rubisco是海洋浮游植物总蛋白的一小部分。 198（1）： 52-58。
Sharwood，RE，von Caemmerer，S.，Maliga，P.和Whitney，SM（2008）。包含烟草小和向日葵大亚基的混合Rubisco的催化性能反映了动力学上等效的来源Rubiscos并可以支持烟草生长。 lant Physiol 146（1）：83-96。
Sunda，WG，Price，NM and Morel，FMM（2005）。痕量金属离子缓冲液及其在文化研究中的应用在：Anderson，RA（Ed。）。藻类培养技术。学术出版社，pp：35-63。
Tcherkez，GG，Farquhar，GD and Andrews，TJ（2006）。 em> 103（19）：7246-7251。
Whitney，SM，Baldet，P.，Hudson，GS and Andrews，TJ（2001）。 Form I来自非绿藻的Rubiscos在烟草叶绿体中表达丰富但不组装。 lant J 26（5）：535-547。
Whitney，SM and Sharwood，RE（2014）。用于Rubisco工程的质体转化和用于评估表达的方案。在Maliga，P.（Ed。）。叶绿体生物技术。 > s ，第245-262页。
Whitney，SM，Houtz，RL和Alonso，H。（2011）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.plantphysiol.org/content/155/1/27.short"目标="_ blank">提高我们的理解和能力，以设计大自然的CO 2亚基 - 重组酶Rubisco。植物生理学 155 （1）：27-35。
Whitney，SM and Sharwood，RE（2007）。 Linked Rubisco亚基可以组装成功能性低聚物而不阻碍催化性能。生物化学 282（6）：3809-3818。
Young，JN，Heureux，AM，Sharwood，RE，Rickaby，RE，Morel，FMM和Whitney，SM（2016）。硅藻的Rubisco动力学的巨大变化揭示了它们的碳浓缩机制之间的多样性。 Exp Bot 67（11）：3445-3456。