材料和试剂

玻璃盖玻片（HiMedia实验室，目录号：CG108）
玻璃幻灯片（尺寸，76 x 26毫米）（HiMedia实验室，目录号：CG029）
石蜡模具和包埋盒（Simport，目录号：M490-2）
小鼠品系：C57BL / 6黑色（实验动物设施，ICMR-National Institute of Research in Reproductive Health）
蒸馏水（D / W）
甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
二甲苯（Merck，目录号：1086342500）
甲醇（Merck，目录号：1070182521）
乙醇（Merck，目录号：1085430250）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
石蜡（Merck，目录号：1073371000）
聚赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）
苦味酸（Fisher Scientific，目录号：13205）
直接红80（Sigma-Aldrich，目录号：365548）
冰醋酸（CH 3 3 COOH）（Merck，目录号：1.93002）
苏木精（C.I. 75290）（EMD Millipore，目录号：104302）
氯化铁（三氯化铁）（Merck，目录号：803945）
碳酸氢钠（默克，目录号：106329）
盐酸（37％）（Merck，目录号：1.93001）
D.P.X. （HiMedia实验室，目录号：GRM655）
Weigert的苏木精溶液（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（见食谱）
10％的甲醛（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
聚赖氨酸涂层载玻片（见食谱）
Picrosirius红色解决方案（见食谱）
酸化水（见食谱）

设备

科普林罐（Thermo Scientific，目录号：107）
明场显微镜（徕卡，型号：徕卡DMi8）
偏光显微镜（徕卡，型号：徕卡DMi8）
注意：项目2和3是相同的显微镜。对于偏振应用，将偏振器（Leica Microsystems，Germany）放置在明场显微镜的光路中。
热板（LED数字，实验室车库，型号：MS7-H550-S）
切片机（徕卡，型号：Leica RM2255）

程序

根据研究所的道德准则，通过颈椎脱臼牺牲小鼠，并解剖它们以收集各自的组织。简单地说，安乐死后，在下腹部做一个1.5厘米的中线切口，收集不同的生殖组织。要获得绒毛膜蜕膜，沿着肠系膜边缘纵向切开双角子宫角，收集胎膜。
在4°C的10％缓冲甲醛或4％PFA固定组织过夜
在PBS中清洗5次（见食谱），在甲醇梯度系列（30％，50％，70％，90％，100％30分钟）和二甲苯中脱水，直到组织变得半透明。
在二甲苯（v / v，1：1）中加入熔融石蜡（在热板上60℃加热）并在室温下孵育15分钟。
将熔融蜡添加到组织中，并在60℃下孵育15分钟。改变蜡，并在室温下将组织留在蜡中。
第二天融化含有组织的蜡，再给蜡一次，最后的孵化持续15分钟。对于大的组织，蜡中的孵育时间可以增加到30-45分钟。时间必须根据经验确定以适应组织类型。
将熔化的石蜡倒入模具中，并将组织放置在所需的方向（垂直放置），并用包埋盒覆盖。在室温下放置一夜，使其完全固化。
根据标准组织病理学方案，使用切片机，将石蜡包埋的组织与包埋盒和切片一起脱模。
收集聚赖氨酸涂层载玻片上的部分（见食谱），让它在37℃干燥过夜。
在热板上（60°C）温热部分，迅速浸泡在含有Coplin罐的二甲苯中。
在二甲苯中脱蜡两次，每次30分钟。确保这些部分几乎是半透明的。
通过甲醇或乙醇梯度系列（100％，90％，70％，50％，30％，D / W各5分钟）浸玻片。
用苏木精染色核（参见食谱）5-10分钟。
在流动的自来水中冲洗玻片2分钟
将载玻片放在含有Coplin罐的Picrosirius红色（见食谱）中1小时。
用新鲜的酸化水清洗滑梯两次（见食谱）（每次5分钟）。
用D / W清洗载玻片，通过甲醇或乙醇梯度（50％，70％，90％，每次5分钟）使切片脱水。
给100％乙醇（每个5分钟）三个变化。
在二甲苯中孵育30分钟（两次更换）。
挂在D.P.X.让它过夜。
观察明场或偏光显微镜下。
使用常规数码相机或CCD拍摄图像

数据分析

苏木素染色细胞核紫罗兰色。然而，细胞核可能会出现黑色或棕色或灰色。在亮视野显微镜下，天狼星红染料染色后，胶原蛋白在浅黄色的细胞质背景上呈现粉红色至红色。 Picrosirius红色染色不仅提供关于组织样品中胶原蛋白分布的信息，而且还检测组织切片中的胶原纤维束。如果正在研究胶原纤维的破坏导致纤维束形成的中断，用这种方法对胶原蛋白染色可能是有价值的。
使用Picrosirius红色染色，我们可以证明在小鼠生殖组织中胶原的不同分布（图1）。为了证明该技术如何用于检测胶原蛋白降解，将小鼠绒毛膜蜕膜/羊膜用来自具有胶原酶活性的B群链球菌（GBS）的膜囊泡（MV）处理（Surve等，2016）。在正常组织中，在绒毛膜和羊膜中可见胶原束。然而，这在用GBS MV治疗时是分散的。在GBS MV处理的组织中清晰可见（图2）。

图1. Picrosirius红色染料在各种小鼠生殖组织和胎膜中的胶原染色。红到粉红色是胶原蛋白染色。黄色是细胞质。比例尺= 50微米。

图2.小鼠羊膜（A）和绒毛膜（C）中响应于来自GBS的膜囊泡（MV）的胶原降解。体内数据来自小鼠注射GBS MV在E16.5的羊膜囊中。离体绒毛羊膜与GBS MV孵育16小时。箭头显示胶原蛋白降解。比例尺= 50微米。
我们利用不同形式的胶原的双折射性质，通过偏振显微镜来证明它们在各种小鼠生殖组织中的分布（图3）。在偏光显微镜下，胶原蛋白I呈黄 - 红色（白色箭头），胶原蛋白III呈绿色（蓝色箭头），胶原蛋白IV呈弱至无双折射（白色轮廓的黑色箭头）（Montes and Junqueira，1991）。表1显示了这些发现的总结。

图3.通过Picrosirius红色染料染色的小鼠组织的偏振显微镜检测胶原亚型。胶原蛋白I为黄红色（白色箭头），胶原蛋白III为绿色（蓝色箭头），胶原蛋白IV弱至无双折射（白色轮廓的黑色箭头）。比例尺= 50微米。

表1.小鼠生殖组织和妊娠中胶原蛋白的分布，如Picrosirius红色染料染色和偏光显微镜检测

笔记

胶原纤维的染色及其分布在日常基础上是相当恒定的。
使用相同的协议，染色可以用不同的组织重现
即使组织在较短时间内看起来染色，也不应在1小时之前取出。
在新鲜组织切片中观察到与在室温下储存超过2-3个月的那些相比，胶原染色没有差异。
部分染色较早（2个月）与Picrosirirus红色显示相似的颜色和强度
双折射没有改变存储染色的部分。新鲜切片的双折射强度与在室温下染色和储存超过2-3个月的强度相似。

食谱

维格特的苏木精溶液
1. 准备苏木素储备液
  1.0克苏木素
  100.0毫升96％乙醇
  正确混合并保持混合物1周，使其在室温下熟化
2. 准备氯化铁（III）原液
  1.16克氯化铁（III）
  1.0毫升HCl（25％）
  99.0毫升蒸馏水
  充分溶解
3. 将苏木精储备溶液与氯化铁（III）储液按1：1的比例混合，得到Weigert's苏木精染料溶液。使用前彻底混合
10％中性福尔马林缓冲液 0.4克NaH 2 PO 4 4 0.65克Na 2 HPO 4 4 90毫升蒸馏水
10毫升甲醛
4％多聚甲醛
4克多聚甲醛
100毫升1x PBS
65°C加热5分钟直至PFA溶解
PBS的组成 0.8克NaCl
0.144克Na 2 HPO 4 4 200毫克氯化钾
240mg KH 2 PO 4 4 加100毫升D / W
聚赖氨酸涂层载玻片
聚赖氨酸：10微升/盖玻片

均匀地涂在干净的载玻片上表面使其在室温下风干，并将其储存在室温下供进一步使用。没有必要洗
Picrosirius红色解决方案
0.1克直接红色80
饱和苦味酸水溶液（1.3克，在100毫升蒸馏水中）
轻轻搅拌至完全溶解
酸化水
1毫升冰醋酸200毫升蒸馏水

致谢

MV Surve和S Bhutda承认UGC，Govt的奖学金。印度，阿尼尔也承认从CSIR，Govt。的印度。 N Singh承认政府生物技术部的初级研究奖学金。的印度。印度医学研究理事会（ICMR）和印度孟买种子基金会分别向D Modi和A Banerjee提供了财政援助。作者没有利益冲突。

参考

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Junqueira，L. C.，Bignolas，G.和Brentani，R. R.（1979）。 Picrosirius染色加偏振显微镜，组织切片中检测胶原蛋白的具体方法 < em Histochem J 11（4）：447-455。
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