材料和试剂

物料
1. 组织培养板（Greiner Bio One International，目录号分别为657160,662160,677180-6,24和48孔）
2. 组织培养瓶（Greiner Bio One International，目录号分别为658175和660175-75cm 2和175cm 2）。
3. Eppendorf管（1.5ml）（USA Scientific，目录号：1615-5510）
4. PVDF膜（Thermo Fisher Scientific，目录号：88518）
5. Lightcycler 480 96孔板（Roche Molecular Systems，目录号：04729692001）
6. Labtek载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录编号：154534）
7. 1.2毫升管（USA Scientific，目录号：1412-1000）
8. 放射自显影（McKesson Medical-Surgical，目录号：EBA45）
9. 盖帽（Fisher Scientific，目录号：12-545-88）
10. 试剂槽（VistaLab，目录号：3054-1001）
11. 细胞刮刀（Fisher Scientific，目录号：08-100-241）
12. 密封容器（Sterilite，目录号：1642）
13. XCell4 SureLock Midi SDS-PAGE系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：WR0100）
14. 20孔Tris-甘氨酸midi凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：WT0102BOX）
细胞
1. 人胚胎肾（HEK）-293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
2. HEK-293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）
3. 非洲绿猴肾细胞-Vero细胞（ATCC，目录号：CCL-81）
4. P上。 leucopus成人皮肤成纤维细胞（Coriell Institute，目录号：AG22353）
注：这些细胞哺乳动物细胞维持在含有10％胎牛血清（FBS，Nalgene，100国际单位青霉素，100μg/ ml链霉素（Thermo Fisher Scientific））的完全DMEM中。
1. One Shot TM TOP10化学能力（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C404010）。
病毒
朗格病毒（LGTV）菌株TP21（由Sonja M.Best博士，NIAID / NIH提供）
注：LGTV是在生物安全级别2（BSL2）实验室条件下使用的蜱传黄病毒血清型复合物的天然减毒成员。所有关于BSL2级遏制的安全措施都得到了遵守。
试剂
1. pLENTI X2-DEST载体（Campeau等人，2009）
2. 重组小鼠IFN-β（Pestka生物医学实验室，目录号：12405-1）
3. 寡核苷酸引物对（见表1）
4. RNAi BLOCK-iT U6 RNAi入门载体试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：K4945-00）
5. 琼脂糖（BioExpress，目录号：E-3120-500）
6. 100 bp DNA梯（新英格兰生物实验室，目录号：N3231L）
7. TAE（10x）缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15558042）
8. 10x Tris-甘氨酸SDS-PAGE运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：LC2675）
9. LR Clonase II酶混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：11791100）
10. ViraPower TM Lentiviral Packaging Mix（Thermo Fisher Scientific，目录号：K497500）
11. Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：L3000015）
12. 丁酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：B5887）
13. Lenti-X GoStix（Takara Bio，Clontech，目录编号：631244）
14. 聚凝胺（Sigma-Aldrich，目录号：107689）
15. 潮霉素B（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10687010）
16. 单独使用磷酸盐缓冲液（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：QVC0508）或使用0.5％Tween-20（PBST）
17. iBlot转移叠层（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：IB4010-01）
18. 抗体
  1. α-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A5441）
  2. α-STAT1（Cell Signaling Technology，目录号：9172S，以1：1,000使用）检测Tyr701处STAT1的磷酸化。
  3. （Cell Signaling Technology，目录号：9167S，以1：1,000使用）
  4. α-LGTV E（由C.Schmaljohn博士提供，USAMRIID以1：1,000使用）
  5. α-LGTV NS3（如泰勒（Taylor）等人2011所述，以1：2,000使用）。
  6. 山羊抗小鼠IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：A28177，以1:3,000进行免疫印迹，在1:1000病毒进行免疫灶实验）
  7. 兔抗鸡AlexaFluor 594（赛默飞世尔科技，产品目录号：A11042，1：1,000使用）
  8. 山羊抗小鼠AlexaFluor 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11029，以1：1,000使用）
19. ECL Plus（Thermo Fisher Scientific，Pierce TM，目录号：80196）
20. RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN，目录号：74104）
21. QuantiTect反转录试剂盒（QIAGEN，目录号：205310）
22. PCR级别的水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：AM9935）
23. 基因特异性qRT-PCR引物（见表2）
24. 快速启动基本的DNA绿色大师（罗氏分子系统，目录号：06402712001）
25. 多聚甲醛16％w / v（Alfa Aesar，目录号：43368）
26. 具有DAPI的ProLong Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：P36931）
27. 甲醇
28. Opti-MEM降低血清培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985062）
29. Tris（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
30. 氯化钠（NaCl）（Gentrox，目录号：60-037）
31. 脱氧胆酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
32. 10x Tris-甘氨酸缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：LC2672）
33. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166-500）
34. NP-40（IGEPAL CA-630）（Sigma-Aldrich，目录号：542334）
35. 氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Avantor Performance Materials，MACRON，目录号：5958）
36. 氯化钙（CaCl 2 2）（Acros Organics，目录号：192735000）
37. 3,3-二氨基联苯胺HCl（Sigma-Aldrich，目录号：D5637）
38. 过氧化氢（H 2 O 2）（Sigma-Aldrich，目录号：H3410）
39. 甘油（AMRESCO，目录号：0854）
40. 溴酚蓝（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610404）
41. β-巯基乙醇（Alfa Aesar，目录号：J61337）
42. 脱脂奶粉
43. DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12100061）
44. 甲基纤维素（Fisher Scientific，目录号：M352-500）
45. 胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物公司，目录号：S11550）
46. Triton X-100（Sigma Aldrich，目录号：X100）
47. 柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1416）
48. 牛血清白蛋白（BSA）
49. 山羊血清
50. Quibit DNA BR试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32850）
51. Quibit RNA HS试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32852）
52. 无RNA酶的DNA酶（QIAGEN，目录号：79254）
53. 完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，Pierce TM，目录号：A32955）
54. 完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
55. DC蛋白质测定试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000116）
56. 放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液（见食谱）
57. DNase I缓冲液（10x）（见食谱）
58. 过氧化物酶底物（新鲜制备）（见食谱）
59. 6x SDS-PAGE样品缓冲液（6x SB）（见食谱）
60. 蛋白质印迹阻断溶液（见食谱）
61. 文化覆盖媒体（见食谱）
62. 透化溶液（见食谱）
63. 免疫荧光试验封闭液（见食谱）

设备

移液器（美国科学）
Transilluminator（Omega Ultra-Lum）
台式离心机（Eppendorf）
iBlot干印迹转印机（赛默飞世尔科技）
摇杆（基准）
转子（Bellco生物技术）
放射自显影胶片处理器（柯达）
热循环仪（Roche Lightcycler）
组织培养培养箱（37°C，5％CO 2）（赛默飞世尔科技）
生物安全柜
水浴（VWR科学）
加热块（95°C）（Fisher Scientific）
SDS-PAGE装置（Pharmacia Biotech）
冰箱
涡旋（费希尔科学）
Qubit 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，目前的型号：Qubit 3.0）
共聚焦显微镜（奥林巴斯生命科学）

软件

GraphPad Prism 6： https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
罗氏Lightcycler 96软件： https://lifescience.roche.com/zh_CN/brands/realtime- pcr
Invitrogen引物设计软件： https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/
MacVector软件版本12.7： http://macvector.com/EcoRI/macvector12.7.5installer.html

程序

将短发夹RNA（shRNA）设计并克隆到慢病毒载体中
我们的小组最近解决并发布了编号为KY451962的储库物种物种（leucopus）（Izuogu等人，2017）的STAT1序列。基于基因序列，如下所述设计和克隆用于敲低的寡核苷酸;描述寡核苷酸处理和慢病毒载体产生过程的流程图如图1所示。

图1.慢病毒质粒的构建 A.
的图示。 leucopus STAT1显示击倒目标区域。 B.用shRNA产生慢病毒表达载体的程序工作流程。 leucopus STAT1。
1. 将完整序列上传到Invitrogen引物设计软件（或同等产品），并生成shRNA设计的寡核苷酸候选物。基因开始，中间和末端的区域被定位以确保完整的转录物覆盖并避免脱靶效应。选择的候选人见表1和图1A。
  
  表1.用于基因敲低的寡核苷酸序列设计用于靶向3个不同区域的shRNA顶部和底部链序列。 leucopus STAT1基因。
  在引物顺序中没有指定特殊条件
2. 作为对照，设计非特异性寡核苷酸以产生不会导致敲低的慢病毒载体。在我们的研究中使用了靶向GFP序列的shRNA用于此目的（参见表1）。由于GFP在感兴趣的细胞中不表达，所以对照细胞系应该与背景非转导细胞在转录上相当。
3. 通过混合等比例的寡核苷酸（各200μM）并根据制造商的BLOCK-iT U6 RNAi进入载体试剂盒（赛默飞世尔科学（Thermo Fisher Scientific）的退火程序，在高温（95℃）下进行4分钟退火，从而退火顶部和底部链）。加热过程结束后，立即将样品转移到工作台上，使其冷却缓慢。这个过程会产生双链shRNA。
4. 为了确认退火步骤，通过将等体积的每个样品（10μl）加入到单孔中并在100V下运行，将样品在4％琼脂糖凝胶（浸入1xTAE缓冲液）中以及100bp梯状物上解析。转移凝胶与单链样品相比较，透射仪显示双链寡核苷酸（见图1B）。
5. 双链通过琼脂糖凝胶电泳确认后，进行退火的样品，并将产生的shRNA连接到U6载体中以产生用于进一步克隆的进入载体。 U6载体包含在BLOCK-iT U6 RNAi入门载体试剂盒（赛默飞世尔科技）
6. 将入门载体重组到慢病毒目的载体中，可将载体送入哺乳动物细胞。在该研究中，根据制造商的方案，我们利用Gateway LR克隆酶II酶混合物进行Gateway克隆的pLENTI X2-DEST载体（Campeau等人，2009），除了允许重组过夜。
7. 化学胜任的One Shot TM TOP10化学胜任力E用重组DNA提取大肠杆菌细胞并选择菌落进行DNA提取以获得纯的质粒DNA。
慢病毒的产生
1. 在6孔培养皿中以每孔300万个细胞的量培养293T细胞，过夜培养。
2. 用纯化的慢病毒质粒转染靶向感兴趣基因的个别区域和非特异性（GFP）序列的细胞。重要的是，将包含1μg靶向每个区域的慢病毒载体的DNA池包含在单个转染管中。因此，准备一个shRNA针对每个感兴趣的区域和一个管所有的shRNA候选人汇集在一起的一个管。
3. 添加1微克ViraPower慢病毒包装混合物与质粒DNA，并使用Lipofectamine 3000转染试剂盒根据制造商的协议完成转染。慢慢地吸到细胞上以避免分离。
4. 在转染后24小时，用含有10mM丁酸钠的新鲜DMEM替换转染培养基，在我们的研究中，2ml总体积适用于6孔培养皿。
5. 将细胞再孵育48小时，不扰动培养皿。
6. 收集含有新产生的慢病毒的上清液。使用Lenti-X GoStix进行快速检测（使用20μl样品上清液，然后使用3滴试剂盒运行缓冲液并留出足够的条带），以确认慢病毒的存在。慢病毒上清液没有过滤。
7. 将慢病毒储存在-80°C直到需要。
P的转导leucopus细胞与表达STAT1 shRNA的慢病毒
1. 设置 P。 leucopus成纤维细胞每孔300,000个细胞在6孔培养皿中孵育过夜。
2. 用1ml慢病毒原液感染细胞，加入8μgpolybrene（用无菌水配制的原液稀释）。
3. 在转导后1小时，再加入1ml含有8μg聚凝胺的培养基。 24小时后，重新转导细胞，并用8μgpolybrene治疗。
4. 第2天，取出慢病毒接种物，并用新鲜培养基替换。
5. 在转导后第3天，加入适当的抗生素选择物（400μg/ ml潮霉素用于白色念珠菌成纤维细胞）。
6. 维持细胞选择1周，然后进行亚克隆，通过将单细胞分裂到48孔培养皿的每个孔中来获得克隆细胞，并在1-2周内观察单个细胞的细胞增殖情况。
7. 将克隆细胞扩大成大瓶（175 cm 2），然后进行基因敲低试验。
在转导的细胞系中评估基因敲低
我们的研究已经证明STAT1表达在上调。用IFN-β处理后的白血病（Izuogu等人，2017）。因此，为了确定感兴趣的基因是否被敲除，将细胞用IFN处理并探测基因诱导。
1. 设置STAT1击倒（KD）和NS KD leucopus成纤维细胞每孔1,000,000个细胞并孵育过夜。
2. 用1,000国际单位（IU）小鼠干扰素β（mIFN-β）处理细胞（或不），8小时，收获样品以测试敲低，如下所示：
  通过SDS-PAGE和蛋白质印迹
  1. 去除细胞上清液，并用PBS缓冲液洗涤细胞2次。
  2. 加入500μL的RIPA缓冲液（见食谱），并轻轻地刮细胞单层。吸取几次，并将样品转移到Eppendorf管。
  3. 用50μl1x DNA酶I缓冲液（见配方）在37°C孵育30分钟。
  4. 以最大速度离心10分钟，收集上清液并与6x SB混合以达到1x SB（参见食谱）。在10％SDS凝胶上加载等量的蛋白质，并在150V下解析1.5小时。
  5. 电泳步骤后，使用iBLOT转移装置将蛋白转移至PVDF膜7分钟。
  6. 用蛋白质印迹封闭液孵育膜（见食谱），同时在室温（RT）下摇动1小时。
  7. 在摇床上用4℃的特异性抗体对STAT1和磷酸化STAT1（STAT1-P）进行16小时探针印迹并在PBST中洗涤3次5分钟。
  8. 用与HRP结合的二抗孵育，同时在室温摇动1小时。在PBST中洗涤3次10分钟。
  9. 用PBS进行最后的洗涤5分钟，用ECL-plus试剂孵育膜另外5分钟，并利用自动化的膜处理器来显现蛋白质表达。图2A显示了STAT1KD的蛋白质印迹结果。
  通过qRT-PCR
  1. 除去细胞上清液，并在PBS中洗涤细胞2次。根据RNA提取方案收获细胞裂解物。在本研究中，将细胞收集在350μl细胞裂解缓冲液（RLT缓冲液包括RNeasy微型试剂盒）中，并使用RNeasy微型试剂盒根据制造商的方案进行RNA提取，包括使用不含RNA酶的DNA酶组的DNase处理步骤（QIAGEN）。
  2. 量化RNA并使浓度标准化以确保所有样品之间的RNA量相等。
  3. 使用等量的RNA模板进行cDNA合成（使用1μg）。我们的研究根据制造商的协议使用QuantiTect反转录试剂盒。
  4. 用PCR级别的水稀释1/8的样品，并将3μl的每个样品加到干净，不透明的96孔板的各个孔中。每个Fwd加1μl。和Rev.引物总共5μl;用于检测P的引物序列。 Leucopus STAT1显示在表2中。在该研究中，使用FastStart Essential Green Master酶混合物，将5μl加入到每个反应样品中。因此，总反应体积为10μl。
    
    表2.用于探测STAT中的STAT1和β-肌动蛋白的qRT-PCR引物。 leucopus 细胞
  5. 在Lightcycler上运行50个周期并分析结果数据。将NS对照中STAT1的倍数诱导设定为100％，并且与NS细胞相比，评估KD细胞中的倍数诱导。所有的数据都标准化为β-肌动蛋白。图2B显示了相对的STAT1 mRNA表达。
    
    图2.在转导的细胞系中评估基因敲低A. Western印迹的流程图和数据显示在STAT中STAT1的表达减少。表达shRNA至位置261（STAT1KD＃1），630（STAT1KD＃2）和全部3个位置-261,630和1,742（STAT1KD全部）的Leucopus KD细胞。所有进一步的实验用“STAT1 KD All”细胞进行，并且以后称为STAT1 KD细胞。用抗STAT1，STAT1-P和β-肌动蛋白的抗体探测样品。 B.qRT-PCR的流程图和数据显示与NS对照相比，STATIKD细胞中相对STAT1 mRNA表达的百分比。星号表示：**** = P 0.00001。
在STAT1 KD细胞中进行干扰素应答的功能检测
观察到敲低后，我们测试了STAT1KD对ISG上调的影响。我们实验室的数据已经鉴定了TBFV限制性因子 - 三联基序蛋白79（TRIM79）的同系物，并且也证明它是一种ISG。（Leucopus）细胞（Taylor等人，2011）。我们测定了P的诱导倍数。根据以下方案在IFN处理后的STAT1KD细胞中的TRIM79（plTRIM79）
1. 按照程序D设置STAT1KD和NS对照细胞，用mIFN-β处理8小时，然后按照qRT-PCR部分所述进行收获RNA。
2. 使用等量的RNA作为cDNA合成的模板，并使用基因特异性引物进行qRT-PCR反应。相对于未处理的细胞评估倍数诱导。我们还比较了pTRIM79在
  中的诱导。使用与上述相同的技术产生的具有特异性慢病毒敲低的I型干扰素受体（IFNAR1）的白细胞介素（leucopus）细胞。数据显示在图3中。
  
  图3. STAT1 KD细胞中的ISG plTRIM79相对于NS对照的qRT-PCR。具有改变的STAT1（和IFNAR1）表达的细胞显示出显着更少的ISG诱导，表明敲减对IFN信号传导具有功能性影响。平均值±SD。星号表示：** = 0.01，*** = 0.001。
测试STAT1 KD对LGTV复制的影响
<免疫荧光显微镜
1. 在8孔Labtek载玻片上以每孔50000个细胞建立STAT1 KD和NS细胞并孵育过夜。
2. 用LGTV以100的MOI感染STAT1 KD和NS细胞。允许1小时的吸收期并用500μl新鲜培养基代替接种物。
3. 在感染72小时后，取出上清液，用PBS洗涤细胞2次，并在4％多聚甲醛溶液中固定20分钟。添加刚刚足以覆盖幻灯片（约5毫升）。
4. 用PBST洗2次，透化细胞5分钟。去除透化溶液（见食谱），并在室温下加入3毫升免疫荧光测定封闭液（见食谱）1小时。本研究使用LGTV包膜（E）和LGTV非结构蛋白3（NS3）蛋白的特异性抗体，稀释度为1：2,000。
5. 用PBS洗涤3次，并在室温下在黑暗中与用3ml封闭溶液稀释的合适的荧光二次抗体孵育1小时。将细胞清洗3次，置于不透光的容器中避光。
6. 添加含有DAPI的封片 - 本研究使用了1ml含有DAPI的ProLong金防褪色剂，并在Olympus共聚焦显微镜上成像。图4A包括显示STAT1KD细胞中增加的病毒蛋白染色的共焦图像数据。
通过病毒滴定和免疫焦点测定
1. 在24孔培养皿中以每孔10万个细胞建立STAT1 KD和NS细胞并孵育过夜
2. LGTV以10的感染复数（MOI）感染细胞，使得单层中的每个细胞将有10个病毒粒子。这是作为细胞密度，期望的MOI和孔数量除以病毒滴度的乘积来计算的，以确定感染所需的病毒储存量。用250μl的病毒溶液接种细胞，并允许1小时的吸收期，并用500μl的新鲜培养基代替接种物。
3. 收集感染后24,48和72小时的病毒上清液一式三份，并储存在-80°C。
4. 在24孔培养皿中以每孔200,000个细胞建立Vero细胞并孵育过夜。
5. 使用1.2ml试管，在无FBS的DMEM培养基中制备6个1/10系列稀释的每种病毒上清液样品，并将250μl稀释至新鲜的Vero细胞。允许1小时的吸收期，并用500μl含有2％FBS和0.8％甲基纤维素（培养覆盖培养基）的新鲜培养基代替接种物。
6. 在感染后4天，进行如前所述的免疫焦点测定（Taylor等人，2011; Baker等人，2013）。简而言之，删除文化覆盖媒体（见食谱），并用PBS洗细胞2次。用100％甲醇固定30分钟，再用PBS清洗。
7. 在Opti-MEM培养基中孵育20分钟，并随后使用病毒特异性抗体。在这项研究中，用于检测LGTV包膜（E）蛋白的抗体以1：1,000使用。在密封容器中37°C孵育1小时。
8. 用PBS清洗细胞2次，并与适当的二抗孵育。本研究中使用山羊抗小鼠IgG抗体为1：1,000。在第一抗体中孵育，然后用2次PBS洗涤。
9. 添加底物，让15分钟的焦点发展。确定每毫升病毒上清液中聚焦形成单位（FFU）的数量，并比较每种细胞类型和条件下的病毒释放。
  对LGTV感染的STAT1 KD结果如图4B所示
  
  图4.确定STAT1KD对于白纹伊蚊LGTV感染的影响A.可视化LG1蛋白在STAT1 KD白斑白斑中的染色细胞系通过免疫荧光显微镜检查。在放大40倍的Olympus显微镜上捕获图像，显示LGTV E（绿色），NS3（红色）和细胞核用DAPI（蓝色）染色。 B.在 P中量化LGTV复制。通过进行免疫焦点测定评估白血病STAT1 KD细胞。该测定包括将感染的克隆细胞的上清液滴定到新鲜的Vero细胞上，并定量所得到的病灶。病毒滴度表示为每ml的焦点形成单位（ffu）。平均值±SD;数据来自三次独立实验，一式三份。星号表示：* = P 0.05，*** = 0.001，**** = P 0.00001。

数据分析

所有滴定实验一式三份进行三次。使用GraphPad Prism 6软件通过非配对t检验或Mann-Whitney U检验对数据进行分析，如Izuogu et al。，2017（ http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone 0.0179781 ）。

笔记

取决于应用，cDNA样品可以以更高的稀释度用于qRT-PCR。
当退火寡核苷酸，而不是将样品管转移到工作台，从加热系统转移整个热块 - 这将允许以非常低的速度进行冷却。
Vero细胞是具有干扰素分泌缺陷的非洲绿猴细胞，因此适合通过滴定计数病毒。
他们也形成了焦点和斑块

食谱

放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液
50mM Tris pH 7.5（100ml 1M）
150 mM NaCl（60 ml 5 M）
0.5％脱氧胆酸（20克）
0.1％SDS（10ml 20％）
1％NP-40（20毫升IGEPAL CA-630）
dH 2 O（最多2升）
DNase I缓冲液（10x）
100mM Tris-HCl pH 7.5
25mM MgCl 2•/ 2 5mM CaCl 2 2/2
过氧化物酶底物（新鲜制备）
0.4毫克/毫升3,3-二氨基联苯胺盐酸盐
0.45μl/ ml 30％H 2 O 2/2 1x PBS
6x SDS-PAGE样品缓冲液（6x SB）
375mM Tris-HCl，pH 6.8 9％SDS
50％甘油
0.03％溴酚蓝
9％β-巯基乙醇，新鲜
Western blot阻断解决方案
PBST的5％脱脂奶粉
文化覆盖媒体
补充有0.8％甲基纤维素和2％FBS的完全DMEM
透化解决方案
0.1％Triton X-100和0.1％柠檬酸钠在PBS中
免疫荧光试验封闭液
PBS中的0.5％BSA和1％山羊血清

致谢

这项工作得到了莱姆病协会和托莱多大学医学与生命科学启动基金（RTT）的试点资助。本文所示的方案和代表性结果是根据我们公开的工作（Taylor等人，2011; Izuogu等人，2017）改编的。我们感谢Jason Munshi-South博士和Stephen Harris博士在产生用于解析leucopus 中STAT1序列的初始核苷酸命中的帮助。我们宣布没有冲突或竞争的利益。

参考

Baker，D.G.，Woods T.A.，Butchi，N.B。，Morgan，T.M.，Taylor，R.T.，Sunyakumthorn，P.，Mukherjee，P.，Lubick，K.J.，Best，S.M。和Peterson K.E.（2013）。 Toll-如受体7抑制病毒在神经元中的复制，但不影响病毒感染的小鼠模型中的病毒发病机理。
Best，S.M。（2016）。黄病毒NS5蛋白在I型干扰素信号传导的拮抗作用中的许多面孔 < J Virol 91（3）。
Campeau，E.，Ruhl，V.E.，Rodier，F.，Smith，C.L.，Rahmberg，B.L.，Fuss，J.O.，Campisi，J.，Yaswen，P.，Cooper，P.K。和Kaufman，P.D。（2009）。哺乳动物细胞中表达和消耗蛋白质的多功能病毒系统 PLoS One 4（8）：e6529。
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