材料和试剂

灌封容器（慧聪公司，目录号：IJT06060; Jumbo Insert）
盆栽混合物（Sun Gro园艺，目录号：Fafard 3B Mix;或类似物）
24孔培养板（Greiner Bio-One International，目录号：662160）
5毫升运输小瓶（斯托克韦尔科学，目录号码：3205）
尼龙窗纱（大多数五金商店都有）
氰基丙烯酸酯（超级胶水或相当的）
剃刀片（双刃PERSONNA）（电子显微镜科学，目录号：72000）
培养皿（100×25毫米）（Fisher Scientific，目录号：FB0875711）
滤纸（Fisher Scientific，目录号：09-795C）
玻璃珠4毫米（水S，目录号：100E）
道康宁高真空油脂
厚实，光滑的纸张（例如，布里斯托尔板或马尼拉文件夹）
闪烁瓶（Fisher Scientific，目录号：12383317）
蜡纸（Reynolds CUT-RITE）
铝箔信封（70 x 70毫米，由标准铝箔制成）
放射自显影胶片（Kodak BioMax MR Film，Eastman Kodak，产品目录号：870 1302）
植物材料（例如拟南芥Col-0，对照和实验材料），每种处理10-12个健康植物。
开发商和定影剂解决方案（伊士曼柯达，产品目录号：190 0984和190 2485）
次氯酸钠（NaClO）（商业漂白剂）
Ecolume闪烁液（MP Biomedicals，目录号：0188247004）
95％乙醇（Pharmco-AAPER，目录号：111000200）
2（N-吗啉代）乙磺酸[MES]（Fisher Scientific，目录号：BP300-100）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
氢氧化钾（KOH）（Merck，目录号：PX1480-1）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：BP220-212）
蔗糖（100μCiml-1，> 350mCi mmol-1）（MP Biomedicals，目录号：011113791）
粉状干冰（优选）或液氮
干燥剂干燥剂（W A Hammond Drierite，目录号：13001）
MES / CaCl 2 缓冲液（见食谱）
在MES / CaCl 2缓冲液中的1mM Suc（见食谱）
在1mM Suc和MES / CaCl 2缓冲液中的[14S] Suc（见食谱）

设备

个人安全设备：实验室外套，丁腈手套（或类似的）和护目镜
用于拟南芥的生长室，在〜100μmol光子下12小时光照/ 12小时黑暗下，mS / 2秒-1
软木钻（卡罗莱纳州生物学，目录号：712202）
盖玻璃镊子或类似的（精细科学工具，目录号：11073-10）
精细剪刀（Fisher Scientific，目录号：08-951-20）
真空钟罩（金布尔，目录号：31200-150）
真空泵（富兰克林电气，目录号：1112585400）
旋转摇床（Orbital Shaker Variable）（BioExpress，GeneMate，产品目录号：S-3200-LS）
平衡（梅特勒 - 托利多，型号：AE100）
盖革计数器（Ludlum测量，模型：模型3）
冻干机（VIRTIS公司，目录号：10-030）
用于冻干箱的网篮（由金属窗纱制成）
重型台钳（Kobalt 4“老虎钳）
两个平面金属板（〜15×3厘米）
放射自显影盒（Exposure Cassette Kodak）（Sigma-Aldrich，目录号：E9010）
放射自显影显影盘（商用塑料托盘〜35×25×8厘米）
闪烁计数器（贝克曼计数器，型号：LS 6000IC）

程序

与任何放射性核素合作需要得到适当的机构办公室的特别考虑和批准。清关可能需要很长时间（几个月或更长时间），申请流程应该尽早开始，或者与已经批准的团体建立合作关系。
在短日照条件下用盆栽混合物（Fafard 3B混合物或类似物）培育拟南芥植物以获得分离良好，大而健康的玫瑰花结;较大的阴影叶比较小的阳光叶更容易处理：在〜100μmol光子m 2 -2秒-1的12h光/ 12h黑暗效果良好。选择来源于每个花环标记的来源完全展开但没有阴影或开始衰老的标记（例如，在〜25-d旧玫瑰花结上离开8到12）（图1A）。每次处理我们通常使用32片叶片（8个池，共4盘，见下文），每种处理准备10到12个植物，以确保足够的健康材料。
这个过程需要多次（3或4次）洗涤步骤，使用装在24孔培养板（图1C所示）的孔内的小篮子可以更容易地进行洗涤步骤。我们从聚丙烯小瓶（5毫升运输小瓶，斯托克韦尔科学）构建篮子。每个小瓶的顶部和底部被切断，留下3/4英寸的开放圆柱体。用氰基丙烯酸酯（超级胶水或等同物）将尼龙窗纱连接到底部开口，用剃刀刀片将多余的丝网切掉。这些篮子可以最大限度地利用培养板孔中的空间，同时在洗涤过程中仍能自由进出孔。其他形式的油管无疑是可行的，但调查人员注意到，外径5/8英寸，内径1/2英寸的标准商用油管可能不能在油井中自由移动。
切割茎附近的叶柄，并将叶转移到衬有三层滤纸和MES / CaCl 2缓冲液（20mM MES，2mM CaCl 2，，用KOH调pH至5.5）至几毫米的深度，以确保叶盘完全浸没。在缓冲液下，用＃5软木塞钻孔（〜8mm直径或更小，取决于来源叶的大小）切出叶盘（图1B）。将叶盘远轴侧向下转移到含有1ml MES / CaCl 2缓冲液（图1D）的24孔微量滴定板的孔中的篮中;在每个孔中的每个篮中共沉积4个盘并用4mm玻璃珠轻轻覆盖以保持其被淹没（图1E）。我们通常使用6个（最小）到8个（首选）4个池式磁盘的复制，因此每个处理需要24到32个磁盘。这些磁盘在池中被随机化。
注意：所有解决方案应该在接近叶片温度的温度下。寒冷的解决方案，如从冰箱，将抑制韧皮部负载。
一旦准备好所有的篮筐，将篮（带有叶片和玻璃珠）从培养皿中取出并转移到预先装有0.5ml MES / CaCl 2 2 / sub的新鲜板的孔中（1mM未标记Suc，补充有0.81μCi（3×10 4 Bq）ml -1 /14μM）的缓冲液中， C] Suc）（图1F）。由于玻璃珠，叶盘应该被浸没;
如果需要，可以在每个井中添加更多解决方案
用[14C] Suc溶液真空渗入MES / CaCl 2 2到叶盘中。在一个钟罩和一个真空泵，拉微量滴定板上的强真空，直到气泡不再从叶盘出来，然后释放真空（图1G）。这将空气从叶片空气空间中抽出，并用标签[14C] Suc溶液代替。吸入的叶片部分会比未吸入的部分看起来更暗;重复真空渗透，直到圆盘完全浸透饱和。
注意：使用[ > 14 C] Suc解决方案有效的渗透，否则，当真空被释放，而不是解决方案时，空气将被拉回到磁盘中。
盖上培养板，孵育真空渗透圆盘20分钟，在旋转平台（摇床）上温和摇动，室温下。
提起篮子（带有标记的圆盘和玻璃珠），让含有[14C] Suc溶液的MES / CaCl 2溶液排出，并将篮子转移到新鲜的培养板上用1ml MES / CaCl 2缓冲液填充（图1H）。
在旋转平台上温和旋转孵育10分钟
重复上述洗涤步骤两次。将所有洗涤溶液作为含有液体废物的含有放射性的14 C处理，因为它含有大量的[14 C] Suc。尽可能快地处理孔，以尽量减少样品间孵育时间的偏差。
注意：MES / CaCl 2 如果需要的话，可以重复使用Suc解决方案，因为只有Suc的一小部分是吸收到叶盘中。但是，这增加了酶如转化酶和微生物污染的风险。如果要重复使用，我们建议过滤器对溶液进行消毒并迅速冷冻，并加上适当的标签和同位素储存。
在吸水滤纸上印上叶片（图1I），并将它们放入穿孔的铝箔信封（70×70毫米）中，预先准备并贴上标签。要制作信封，请将一片铝箔折成两半，然后折叠两面，使其一面敞开;用大头钉对箔片打孔。我们把代表一个重复的四个磁盘放在一个信封里。将每个信封立即放在粉末状的干冰上，用更多动力的干冰覆盖信封，重复每个信封，使其保持冷冻状态，直到所有样本都被处理。
注意：也可以使用液氮，但将信封放入干粉冰粉是比较好的选择，因为与在液氮中浸没相比，它会引起更少的裂缝：在放射自显影过程中，完整的叶盘更容易处理。
在冷冻干燥器中冷冻干燥盘48小时。它们必须保持冷冻以防止高度可溶性[14 C] Suc的移动（图1J）。
注意：将样品室冷却到远低于组织冰点（〜-30°C）的冷冻干燥器效果最好;通过歧管连接的外部样品容器的冻干机工作得不好，因为圆盘充分融化以允许标签扩散。在图1J中，铝箔信封放置在自制的金属网篮（由金属窗纱制成）内，该网篮紧贴在我们的冻干机的卷绕盘管内。盘绕盘管本身是系统中最冷的部分，所以水从盘片上升华并凝结在盘管上，而整个小室保持在低于样品的冰点以下。
冷冻干燥后，将带叶盘的信封转移到带有干燥剂干燥剂的钟罩中：防止冷凝和暴露在潮湿条件下以防止[14C] Suc扩散是重要的。
放射自显影和闪烁计数

通过放射自显影将韧皮部装载到叶脉中
1. 通过放射自显影来可视化韧皮部负载是基于脉管从质外体积聚[14C] Suc，同时将其从球体中洗出。由于14 C发射微弱的β粒子，并且信号随离开源的距离而分散，所以获得最佳的放射自显影图，其中平坦，薄的叶片直接放置在单一乳剂，高分辨率膜如Kodak BioMax MR电影。
2. 将两片金属板（15×3厘米）之间的叶片平放在重型台钳中。在一块金属板（图1K）的顶部，放置一块纸板（布里斯托尔纸或马尼拉折叠纸）和一块蜡纸（〜12.5×2.5厘米）。将冻干的叶盘背面朝上放在蜡纸上，通过标记蜡纸或底层纸板来跟踪哪些盘属于每次重复。用另一块纸板覆盖磁盘，然后用第二块金属板覆盖磁盘。将“三明治”插入重型台钳中并尽可能压平（图1L）。拆开三明治，但不要将蜡纸与蜡纸分开;在压缩之后，蜡纸提供稍微发粘的表面以在放射自显影期间帮助保持光盘在适当的位置。重复，直到所有的磁盘压平。
3. 将底纸片，蜡纸和松散粘附的叶片（背面朝上）放置在放射自显影盒中（图1M）。在获准使用同位素工作的暗室中，在安全的灯光下，将一片柯达BioMax MR胶片（或类似物）与感光乳剂朝下放置，以使其接触到叶片。
4. 根据[14C] Suc标记的强度，将放射自显影胶片暴露于叶圆片24至48小时。我们通常从48小时的曝光开始，在开发之后，如果第二次曝光时间较短或较长，则需要做出决定。
5. 在黑暗的房间里，从磁带上取下放射自显影胶片，注意叶盘要粘在蜡纸上。如果第二次曝光将被完成，保持磁盘组织是重要的。根据制造商的指示，用新鲜制备的显影剂和定影剂（Kodak GBX）手动显影自动拍摄胶片。简而言之，将胶片放入带有显影剂溶液的托盘中，在室温下温和振荡5分钟。将胶片转移到带有水的托盘中30秒，然后转移到带有固定剂溶液的托盘中5分钟。
  用自来水冲洗15分钟，然后悬挂在膜上滴下，风干。
6. 配有数码相机的立体显微镜可以很好地拍摄放射自显影照片。
通过闪烁计数量化韧皮部装载到叶脉中

放射自显影后，从蜡纸上取下叶片，并将每个重复样品的光盘置于闪烁瓶中（图1N）。
提取颜料和溶质，加入500μl80％乙醇，轻轻摇动20分钟。加500μL的商业漂白剂，轻轻摇晃20分钟，以消灭颜料。
加入5毫升适用于水溶液的可生物降解的闪烁鸡尾酒。通过摇动小瓶彻底混合，以确保闪烁鸡尾酒渗透叶盘，并创建一个单相的解决方案。包括一个阴性对照小瓶含有乙醇，漂白剂和闪烁鸡尾酒，但没有叶盘。
用闪烁计数器用适合于14 C的程序进行闪烁计数。

图1.研究拟南芥叶片中[14C] Suc的韧皮部负载的实验程序A.生长拟南芥 Col-0对照和实验植物在适合于实验的条件下对盆栽混合物进行处理。 B.在叶柄基部切下健康的成熟叶片，将叶片转移到衬有滤纸的培养皿中，并且当叶片浸没在MES / CaCl 2缓冲液中时，使用＃5mm软木塞蛀虫以分离叶盘。 C.在每个孔中准备了装有1ml MES / CaCl 2缓冲液的24孔微量滴定板，以及网眼底部的篮子，以便在后面的步骤中便于洗涤。 D.在每个孔中沉积4个盘并（E）用玻璃珠轻轻地覆盖以浸没叶盘。 F.一旦制备了具有叶盘和玻璃珠的所有篮，将篮转移到预先填充有补充有1mM Suc溶液（1mM）的MES / CaCl 2缓冲液的新鲜板的孔中未标记的Suc，补充有0.81μCi（3×10 4 Bq）ml -1 [14 C] Suc）。 G.在钟罩中，真空渗入MES / CaCl 2 / [14 C] Suc溶液到叶盘中，确保用溶液吸入空气空间。 H.在旋转平台上温和振荡孵育20分钟，并用MES / CaCl 2溶液（不含Suc）洗碟3次。 I.在吸水纸（I）上印刷叶片，并将它们放入预先制好的和预贴标签的穿孔铝箔信封中。用干粉冰（优选方法）将信封层覆盖或浸没在液氮中;铝箔封套中的穿孔允许液体N 2进入并允许N 2气逸出。 J.将圆盘冻干48小时，使其在干燥时保持冷冻（如图所示，金属网篮内的铝箔信封装在我们使用的冻干机的卷曲盘内，温度保持在〜-30℃）。冷冻干燥后，将铝箔信封移至干燥器中升温至室温，不进行冷凝成型。 K.小心地将信封从信封中取出，并将其背面朝上放置在平面金属板上的布里斯托纸上的蜡纸上。把第二张布里斯托尔纸（没有蜡纸）放在叶盘和第二个平坦的表面金属板上。 L.将三明治转移到重型台虎钳上，并尽可能平坦地按压叶盘。 M.叶片松散地粘附在蜡纸上，并可转移到放射自显影盒中以暴露于单一乳剂，高分辨率放射自显影胶片。 N.在令人满意的放射自显影后，从蜡纸上取下叶盘并通过闪烁计数定量14 C标记。

数据分析

放射自显影是负荷的定性视觉评估，而闪烁计数提供了定量数据。图2中显示了拟南芥，烟草和小麦的代表性放射自显影图。闪烁计数的结果表示为每单位叶面积的分解速率（dpm）（mm 2 / s））或作为相对于对照的百分比:(实验dpm /对照dpm）×100（Khadilkar et al。，2016）。对于定量分析，对于4个池化盘的8个重复中的每一个重复计算平均值。通过标准计算如Student's t-检验或用post-hoc分析的方差分析（ANOVA）来确定治疗中负荷的统计学显着差异。

图2.用这种方法制备的（A）拟南芥，烟草和（C）小麦叶片的代表性放射自显影协议

食谱

MES / CaCl 2缓冲液（500毫升）
无水MES 1.9524克（FW195.24）（20mM）
CaCl 2•2H 2 O 0.147g（FW 147.01）（2mM）
用KOH（5 N）调节pH 5.5
在MES / CaCl 2缓冲液（100ml）中的1mM Suc
在100ml MES / CaCl 2缓冲液中的蔗糖0.034g（FW 342.30）（1mM），或从更浓缩的Suc储液中适当地稀释
在1mM Suc和MES / CaCl 2缓冲液中（10ml，制备新鲜的，计算需要多少特定实验并制备〜10 ％额外）
商业[14 C] Suc储备液，100μCiml -1， 350mCi mmol-1
向MES / CaCl 2缓冲液中的9.92ml 1mM Suc中加入0.081ml（3×10 4 Bq）市售储备液。
注：[ 14 C] Suc具体活动可能因不同的批次和供应商而异。所描述的0.081ml所述原料对每10ml 1mM Suc和MES / CaCl 2缓冲液贡献0.023μmolSuc，并且将最终的Suc浓度提高到1.002mM，我们认为这可以忽略不计。
（0.081ml）×（100μCiml -1）/（350mCi mmol -1）=0.023μmol
0.023微摩尔/ 10ml = 0.0023mM

致谢

该协议基于Dasgupta et al 中发布的方法。（2014年）和Khadilkar 等人。（2016）。我们感谢John Evers提供了图2所示的植物。B.G.在韧皮部装载和长途运输方面的工作Ayre的实验室由美国国家科学基金会0344088,0922546,1121819和1558012支持。作者报告没有利益冲突或利益冲突。

参考

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