材料和试剂

塑料50毫升离心管（Greiner Bio One International，目录号：227270）
用于转化的1.5ml试管
细菌培养皿（FL MEDICAL，目录号：29052）
接种环，10μl（Greiner Bio One International，目录号：731171）
带冰的冰箱
滑动瓶子进行清洗
Superfrost Plus玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：J1800AMNT）
Coverslip（Bar Naor，产品目录号：BNBB024050A1）
移液器吸头（20-200μl，100-1,000μl）
感兴趣的大肠杆菌菌株（例如CFT073）
用于荧光蛋白报告子表达的质粒（参见实例）
氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
无水甘油（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：2136）
磷酸盐缓冲盐水（PBS 10x）（HyLabs，目录号：BP-507 / 1Ld）
多聚甲醛（PFA）（Bar Naor，目录号：BN15711）
二甲苯（Sigma-Aldrich，目录号：534056）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
ProLong TM Glass Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：P36980）
Hoechst 33258（Sigma-Aldrich，目录号：94403）
脱水培养基，LB肉汤（BD，Difco TM，目录号：244620）
纯化用于微生物学的琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：05038）
红霉素（Sigma-Aldrich，目录号：E6376）
氨苄青霉素（Bio Basic，目录号：AB0028）
Tris（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：4109-1）
氯化钠（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：3624-19）
聚氧乙烯20失水山梨糖醇单月桂酸酯（吐温20）（Sigma-Aldrich，目录号：93774）
牛血清白蛋白（BSA）（VWR，Ameresco，目录号：97061-420）
胎牛血清（FBS）（Biological Industries，目录号：04-0071A）
Triton X-100（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：X198-07）
LB培养基（见食谱）
LB琼脂平板与抗生素（见食谱）
TBSS解决方案（10倍）（请参阅食谱）
阻止解决方案（请参阅食谱）

设备

移液器
高压灭菌器
分光光度计（600 nm波长）
摇床
微型离心机
孵化器
Thermoblock
化学罩
荧光显微镜（TL-Nikon）

软件

ImagePro Analyzer 7.0软件
用于统计分析的软件（例如GraphPad Prism软件版本6.0或更高版本）

程序

程序大纲如图1所示。

图1.方案大纲。该方案的总体概述描述了该实验的三个主要阶段。左图显示表达E的荧光蛋白的制备。大肠杆菌。中间的面板概述了组织粘连测试，右面的面板显示了成像过程中获得的数据分析输出。

主管细菌的制备
1. 成长E。大肠杆菌菌株在5ml无菌LB培养基中（参见食谱）在50ml试管中过夜（12-18小时），在37℃下以220rpm振荡。
2. 将500μl的过夜发酵剂培养物接种到50ml预热的LB（37℃）中并在37℃下以220rpm振荡生长2小时直至OD 600在0.3-0.4之间。 />
3. 在4℃下离心3,220×g 10分钟。
4. 丢弃上清液，将颗粒放在冰上10分钟。
5. 将沉淀悬浮在20ml 0.1M冷CaCl 2中。
6. 在冰上放置25分钟
7. 如步骤A3所示再次离心，弃上清并悬浮沉淀在2ml 0.1M CaCl 2 + 15％甘油中。
  注意：甘油应高压灭菌，使用前应先过滤CaCl2溶液。
8. 在冰上孵育90分钟。
细菌转化
1. 取100μl感受态细菌放入1.5ml试管中，加入30ng编码GFP（Hansen等，2001）或mCherry（Sason等，2001）的质粒。，2009）。
2. 在冰上孵育20分钟
3. 将管子转移到加热到42°C的热块上90秒。
4. 将试管移至冰上5分钟。
5. 加入1毫升无菌LB并在37℃，220转/分振荡1小时。
6. 在4,830克xg离心5分钟。
7. 根据选择的质粒（这里为氨苄青霉素和红霉素，参见食谱）编码的抗性，将沉淀重悬于150μl新鲜LB中，并将种子在补充有适当抗生素的LB琼脂平板上进行选择。
8. 在37°C孵育过夜。
9. 第二天，挑选单个菌落，在37℃下以220rpm摇动过夜（12-18小时），在5ml LB（补充适当的抗生素，参见食谱部分）中生长。
  注意：为避免荧光信号丢失，强烈建议应始终保护表达荧光蛋白的细菌免受光照。
10. 使细菌培养物达到OD 600的1（在无菌1x PBS中稀释）。
组织结合分析
该测定法使用4μm厚的石蜡包埋的固定在PFA中的组织固定在载玻片上（参见材料和试剂）。
1. 用这三种溶液填充三个染色瓶并按照描述进行脱蜡（图2A）：
  1. 二甲苯-5分钟，5分钟，2分钟
  2. 乙醇100％-5分钟，5分钟，2分钟。
  3. 乙醇96％-3分钟，2分钟，2分钟。
  注意：脱蜡是在化学罩内完成的。
2. 使用阻断溶液覆盖切片（见食谱）并在室温下孵育6小时。
3. 在弃去封闭溶液后，在950μl阻断溶液中，在OD 600 = 1中悬浮50μl细菌，将细菌悬液轻轻放在载玻片上。
4. 在4°C的湿室（带湿纸巾的线室）中孵育过夜，避光。
第二天洗：
1. 准备2个装满1x PBS的染色瓶和另一个含有0.05％吐温20的PBS（PBST，图2B）的染色罐。
2. 用PBS清洗两次，每次5分钟。将玻片转移至PBST并清洗10分钟（图2B）。
  
  图2.清洗/脱蜡示意图准备三个装满图中罐子上所示溶液的清洗瓶，并将瓶中的滑块保持指定的时间。图2A说明准备结合测定的第一轮载玻片脱蜡。图2B显示了过夜温育以洗去未结合的细菌后的洗涤，深紫色的罐子含有补充了吐温（PBS）的PBS。
3. 在1x PBS中稀释Hoechst 33258 1：5,000，每张玻片约200μl，在室温下孵育20分钟。避光。
4. 使用安装介质滑动并用盖玻片盖住。
5. 想象可以在60倍放大的荧光显微镜下完成。
  注意：每张幻灯片至少扫描四个字段。

数据分析

从荧光显微镜获得的图像通过荧光显微镜图像分析软件转换成8位图像（例如参见图3）。
应由两个不同的实验人员对荧光细菌进行量化（对于每个场），总组织面积为1,600μm2 。
将字段转换为mm 2 。计数的每个荧光细菌代表菌落形成单位（CFU），数据表示为Log 10 CFU / mm 2 2。
示例：为了方便起见，本示例将涉及100μm的字段。

＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP ;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP; （CFU in100μm 2 ）=（CFU in 0.1mm 2 2 / sup> ）
＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP ;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP;＆NBSP; 10x（CFU在100μm中）= CFU在1mm中 2 2 2 / sup>

如果计数的CFU在100μm 2 是1,000，则CFU以mm为单位 2 2 sub> 10 CFU / mm 2 是4。 < br />
单个细菌的每个点称为CFU。

图3. GFP表达的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）粘附石蜡包埋的膀胱组织切片的荧光显微镜图像比例尺=50μm。

食谱

LB媒介
1升双蒸馏水（DDW）
20克LB脱水培养基
混合直到溶解
在121°C高压灭菌30分钟并分装
含有抗生素的LB琼脂平板
1升DDW
20克LB脱水培养基
15克纯化琼脂
混合并高压灭菌。
高压釜加热过程中，琼脂会溶解冷却至LB琼脂可以处理，然后固化
加入抗生素（6毫克/毫升的红霉素和1毫克/毫升的氨苄青霉素）并倒入平板。
TBSS解决方案（10x）
500毫升0.5 M Tris（pH 7.4）
800毫升2M NaCl
2毫升吐温20

添加DDW至2升充分搅拌
阻止解决方案
100毫升1x TBSS
15克BSA
15毫升FBS
5.75毫升5％Triton X-100

致谢

欧洲研究理事会（ERC）根据欧盟第七框架计划（FP / 2007-2013）ERC拨款320473-BacNK支持该研究。计划和预算委员会的I-CORE计划和以色列科学基金会以及基因调控中的染色质和RNA I-Core，GIF基金会，刘易斯家庭基金会，ICRF教授职位资助，Helmholtz以色列赠款，Kamin赠款和Rosetrees信托（全部给OM）。 O.M是分子免疫学的皇冠教授。作者声明不存在利益冲突。

参考

Abed，J.，Emgard，JE，Zamir，G.，Faroja，M.，Almogy，G.，Grenov，A.，Sol，A.，Naor，R.，Pikarsky，E.，Atlan，KA，Mellul， A.，Chaushu，S.，Manson，AL，Earl，AM，Ou，N.，Brennan，CA，Garrett，WS和Bachrach，G.（2016）。 Fap2通过与肿瘤表达的Gal-GalNAc结合来介导富含梭状杆菌的结肠直肠腺癌。 Cell Host Microbe 20（2）：215-225。
Gur，C.，Ibrahim，Y.，Isaacson，B.，Yamin，R.，Abed，J.，Gaml iel，M.，Enk，J.，Bar-On，Y.，Stanietsky-Kaynan，N.， Coppenhagen-Glazer，S.，Shussman，N.，Almogy，G.，Cuapio，A.，Hofer，E.，Mevorach，D.，Tabib，A.，Ortenberg，R.，Markel，G.，Miklic，K Jonjic，S.，Brennan，CA，Garrett，WS，Bachrach，G。和Mandelboim，O。（2015）。具核梭杆菌Fap2蛋白与人类抑制性受体TIGIT的结合保护肿瘤免受免疫细胞攻击。 / a> Immunity 42（2）：344-355。
Hansen，M.C.，Palmer，R.J.，Jr.，Udsen，C.，White，D.C。和Molin，S。（2001）。在低pH和低氧浓度的条件下评估戈登链球菌细胞中的GFP荧光。 >微生物学 147（Pt 5）：1383-1391。
Isaacson，B.，Hadad，T.，Glasner，A.，Gur，C.，Granot，Z.，Bachrach，G。和Mandelboim，O。（2017）。基质细胞衍生因子1介导尿路感染引起的免疫细胞吸引。 Cell Rep 20（1）：40-47。
Sason，H.，Milgrom，M.，Weiss，A.M.，Melamed-Book，N.，Balla，T.，Grinstein，S.，Backert，S.，Rosenshine，I。和Aroeti，B。（2009）。 Enteropathogenic大肠杆菌颠覆磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯和磷脂酰肌醇3， 4,5-trisphosphate on epithelial cell infection。 Mol Mol Biol Cell 20（1）：544-555。
Schilling，J. D.，Mulvey，M.A。和Hultgren，S.J。（2001）。大肠杆菌的结构和功能 1型菌毛：新的洞察尿路感染的发病机制。