材料和试剂

移液器吸头200μl吸头（USA Scientific，目录号：1111-1800）
10厘米培养皿（康宁，目录号：430167）
15毫升聚苯乙烯离心管（Corning，Falcon，目录号：352097）
5毫升圆底聚苯乙烯管与细胞过滤器盖（康宁，猎鹰®，目录号：352235），0.35微米尼龙网格
C57BL / 6 WT小鼠胚胎（13.5天）
MCF7乳腺癌细胞（ATCC，目录号：HTB-22）
小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300062）
2-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：N13195）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖（GE Healthcare，Hyclone，目录号：SH30243.01）
胎牛血清（FBS）（Gemini生物产品，目录号：100-106）
青霉素/链霉素（Pen / Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
2-巯基乙醇（2-Me）（Sigma-Aldrich，目录号：M6250-500ML）
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
DMEM培养基（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，1x）（见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）

设备

移液器（Gilson，型号：P200，目录号：F123601）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
血细胞计数器室（Hausser科学）
水浴（Fisher Scientific，型号：Isotemp TM 205）
倒置显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse Ts2-FL）
高压灭菌器
细胞培养罩（Thermo Fisher Scientific，Forma class II，A2）
细胞培养孵化器（Thermo Fisher Scientific，Forma系列II）
FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）

软件

FlowJo软件版本10.0.8或更高版本（FlowJo）

程序

用于MEF的2-NBDG摄取测定
1. 从C57BL / 6WT小鼠的胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（13.5天）（Dong等人，2015）。
2. 培养MEF细胞直至在加湿细胞培养箱（37℃，5％CO 2）中用DMEM生长培养基在10cm培养皿中达到80-90％汇合。
  注意：不要在第3代之后使用MEFs。MEFs通常在第4至5代时会衰老。
3. 取出培养基并用10ml 1x PBS洗涤细胞一次。
  注意：使用室温或从步骤A3到步骤A9的预热1x PBS。步骤A9后使用冷冻的1x PBS。
4. 使用4毫升0.05％胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化细胞3分钟
5. 将细胞转移到15毫升聚苯乙烯离心管中。
6. 通过离心将200gxg的细胞收获5分钟。
7. 一次用5 ml 1x PBS清洗沉淀的细胞
8. 使用血细胞计数器计数细胞。
9. 在37℃水浴中用1ml含有100μM2-NBDG的PBS孵育1×10 6个MEF细胞2小时。孵育相同数量的MEFs在水浴中使用1 ml PBS而不使用2-NBDG作为阴性对照。
10. 通过离心将细胞沉淀200g×g 5分钟。用冷冻的1x PBS洗涤细胞后，通过离心将细胞沉淀200g×5分钟。
11. 将细胞重悬于0.5 ml冰冷的含2％FBS的1x PBS中。
  注意：在此步骤之后，请始终将细胞放在冰上。
12. 过滤细胞通过35微米尼龙网（<5毫升圆底聚苯乙烯管的细胞过滤器帽），以获得均匀的单细胞悬浮液在5毫升管中。
13. 保持样品在冰上，直到在流式细胞仪上分析。
14. 在FACSCalibur流式细胞仪上进行流式细胞分析。每次反应可获得10,000个单细胞事件。
15. 使用FlowJo软件分析荧光强度。
乳腺癌细胞的2-NBDG摄取检测
使用与MEFs摄取测定相同的程序，除了在37℃水浴中将1×10 6 MCF7细胞与1ml含有100μlPBS的PBS一起孵育30分钟（而不是2小时用于MEFs） μM2-NBDG。
注意：即使氧气充足，癌细胞也会增加糖酵解。为了补偿由有氧糖酵解导致的能量收益降低，癌细胞中有大量的葡萄糖摄取。葡萄糖转运蛋白（GLUTs）负责葡萄糖向细胞的组成性运输。与小鼠成纤维细胞相比，乳腺肿瘤和其他肿瘤细胞系显示出更高的GLUT1至4的表达水平（Maddalena等，2015）。这是与正常成纤维细胞相比，癌细胞具有更高的保留葡萄糖能力的一个可能原因。其他原因包括线粒体缺陷和改变癌细胞中PI3K-Akt-mTOR信号通路。

数据分析

使用允许分析活细胞的门控策略确定2-NBDG标记的细胞的真实摄取。收集10,000个单细胞。我们在FSC-SSC图上设置一个门（R1）来选择感兴趣的细胞群但排除细胞碎片。然后，我们显示x轴上的门控细胞的相对荧光和y轴上的细胞数量。
2-NBDG阳性细胞通过绘制直方图与FITC作图来分析。

图1. MEF和MCF7乳腺癌细胞对葡萄糖的摄取A.通过掺入荧光葡萄糖类似物2-NBDG 2小时评估WT WT MEF的葡萄糖摄取。 B.通过2-NBDG评估MCF7细胞葡萄糖摄取30分钟。使用FACSCalibur在FL-1（绿色荧光）通道中检测荧光，结果显示为直方图。对于定量和统计分析，我们通常计算一式三份实验中FL2荧光强度的平均值。

笔记

为防止2-NBDG从细胞膜渗漏，停止2-NBDG摄取反应后，应始终将样品保存在冰上。在流式细胞仪上进行分析之前，不要将样品放在冰上超过2小时。

食谱

DMEM培养基
DMEM
10％热灭活FBS
1％的青霉素/链霉素
50μM2-巯基乙醇（2-Me）
注意：4°C储存;使用前温热至37°C。
磷酸盐缓冲盐水（PBS，1x）

调整pH值至7.4，然后注入蒸馏水至1L的最终体积。高压灭菌15分钟，室温保存
FACS缓冲液
1 x PBS
2％FBS
注意：在使用前准备好并保持冰冻状态。

致谢

我们感谢路易斯安那州立大学健康科学中心（LSUHSC）Flow Cytometry Shared Resource技术总监Constance Porretta帮助进行FACS实验。作者宣称没有利益冲突。这项工作得到了LSUSHC医学院和Fred G，Brazda基金会的资助。这是一个基于Dong等人发表的工作的详细方法。（2017）。

参考

Dong，S.，Baranwal，S.，Garcia，A.，Serrano-Gomez，S.J.，Eastlack，S.，Iwakuma，T.，Mercante，D.，Mauvais-Jarvis，F.和Alahari，S.K。（2017）。 Nischarin抑制剂通过激活AMP激活的蛋白激酶改变能量代谢。 J Biol Chem 292（41）：16833-16846。
Dong，S.，Maziveyi，M.and Alahari，S.K。（2015）。原发性肿瘤和MEF细胞分离以研究肺部转移。 J Vis Exp （99）：e52609。
Kohn，A. D.，Summers，S.A.，Birnbaum，M.J。和Roth，R.A。（1996）。 3T3-L1脂肪细胞中组成型活化的Akt Ser / Thr激酶的表达刺激葡萄糖摄取和葡萄糖转运蛋白4易位。 J Biol Chem 271（49）：31372-31378。
Maddalena，F.，Lettini，G.，Gallicchio，R.，Sisinni，L.，Simeon，V.，Nardelli，A.，Venetucci，A. A.，Storto，G.和Landriscina，M.（2015年）。通过正电子发射断层扫描评估正常和癌细胞系的葡萄糖摄取 Mol Imaging 14：490-8。
Nitin，N.，Carlson，A.L.，Muldoon，T.，El-Naggar，A.K。，Gillenwater，A。和Richards-Kortum，R。（2009）。在局部应用荧光标记的脱氧葡萄糖后口腔肿瘤中葡萄糖摄取的分子成像 Int J Cancer 124（11）：2634-2642。
O'Neil，R. G.，Wu，L.和Mullani，N。（2005）。摄取肿瘤细胞中的荧光脱氧葡萄糖类似物（2-NBDG） Mol Imaging Biol 7（6）：388-392。
Vander Heiden，M. G.，Cantley，L. C.和Thompson，C. B.（2009）。了解Warburg效应：细胞增殖的代谢需求科学 324（5930）：1029-1033。
Yamamoto，N.，Ueda，M.，Sato，T.，Kawasaki，K.，Sawada，K.，Kawabata，K。和Ashida，H。（2011）。单元12.14培养细胞中葡萄糖摄取的测量 Enna，SJ（Ed。） Curr Protoc Pharmacol ，第12，11-22。
Zou，C.，Wang，Y.和Shen，Z。（2005）。 2-NBDG作为直接葡萄糖摄取测量的荧光指示剂。 J Biochem Biophys Methods 64（3）：207-215。