材料和试剂

原代小鼠肝细胞
Medium199（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：11150-059）
胎牛血清（FBS）
二辛可宁酸（BCA）
青霉素 - 链霉素，Liquid（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15140-122）
PBS （Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM），不含葡萄糖，L-谷氨酰胺，酚红，丙酮酸钠和碳酸氢钠，粉末（Sigma-Aldrich，目录号：D5030）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
L-乳酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：L7022）
丙酮酸钠（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：11360-070）
100mM MEM丙酮酸钠溶液（100x），液体（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：11360-070）
200mM L-谷氨酰胺（100x），液体（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：25030-081）
1 H HEPES缓冲溶液（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15630-080）
pCPT-cAMP（Sigma-Aldrich，目录号：C3912）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I9278）
Autokit葡萄糖（Wako，目录号：439-90901）
BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）
HEPES
葡萄糖生产缓冲液（参见配方）

设备

程序

将原代小鼠肝细胞在补充有5％FBS，青霉素（100单位）的培养基199中在BD BioCoat胶原I 6孔板（每孔1×10 6个细胞）/ml）和链霉素（100μg/ml）
接种后6-48小时，在补充有青霉素（100单位/ml）和不含FBS的链霉素（100μg/ml）的Medium199的2ml /孔中血清饥饿过夜。
用2ml /孔的温热（37℃）PBS（+/+）清洗细胞两次。
用1ml由无酚红的补充有20mM乳酸钠，2mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺和2mM L-谷氨酰胺的不含葡萄糖的DMEM（pH7.4）组成的葡萄糖生产缓冲液替换PBS +/+ 15 mM HEPES。
在37℃下用或不用0.1mM pCPT-cAMP和/或100mM胰岛素培养细胞6小时，收集0.2ml培养基，并用比色葡萄糖测定试剂盒测量葡萄糖浓度。
从每个孔收集0.2ml培养基
使用比色葡萄糖测定试剂盒根据制造商的说明测量葡萄糖浓度
通过二辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒根据制造商的说明书将读数归一化为由全细胞裂解物测定的总蛋白含量。

食谱

致谢

该方案改编自Sakai等人（2012）。该协议的开发由创新科学研究助理（授予M.K.）和科学研究助学金（C）（21591155至 MM），日本教育，文化，体育，科学和技术部，国家全球卫生和医学中心（21S116到MM）的资助，武田科学基金会（MM）和Novo Nordisk制药胰岛素奖（MM）。

参考文献

Matsumoto，M.，Pocai，A.，Rossetti，L.，Depinho，R.A。和Accili，D。（2007）。缺乏肝脏中叉头转录因子Foxo1的小鼠肝脏葡萄糖生成受损的调节。 Cell Metab 6（3）：208-216。
Sakai，M.，Matsumoto，M.，Tujimura，T.，Yongheng，C.，Noguchi，T.，Inagaki，K.，Inoue，H.，Hosooka，T.，Takazawa，K.，Kido， Yasuda，K.，Hiramatsu，R.，Matsuki，Y.and Kasuga，M。（2012）。 CITED2将激素信号传递至PGC-1alpha乙酰化，调节糖异生作用。 Nat Med 18（4）：612-617。
Yoon，J.C.，Puigserver，P.，Chen，G.，Donovan，J.，Wu，Z.，Rhee， Adelmant，G.，Stafford，J.，Kahn，C.R.，Granner，D.K.，Newgard，C.B。和Spiegelman，B.M。（2001）。通过转录共激活因子PGC-1控制肝脏糖异生。 413（6852）：131-138。