材料和试剂

Eppendorf epT.I.P.S.标准移液器吸头（Eppendorf，产品目录号：022492004,022492047,022492055）
Eppendorf安全锁管1.5毫升（Eppendorf，目录号：022363204）
Eppendorf Protein LoBind试管1.5 ml（Eppendorf，目录号：022431081）
Zeba Spin Desalting Columns，7K MWCO，0.5 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：89882）
Coplin染色罐（DWK Life Sciences，Wheaton，目录号：900470）
高精度盖玻片厚度1.5H（Paul Marienfeld GmbH，产品目录号：0107242）
RTS 100特定场地标签套件（生物技术兔，产品目录号：BR1402601）
定制无细胞 E。基于大肠杆菌的蛋白质合成系统（RF1耗尽，不含Cys）（生物技术）
SUPERase•In™RNase抑制剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2694）
完全无EDTA无蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11836170001）
Ni-NTA磁性琼脂糖珠，5％悬浮液（QIAGEN，目录号：36111）
Alexa Fluor 488 C5-马来酰亚胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：A10254）
Click-IT Alexa Fluor 647 DIBO炔（Thermo Fisher Scientific，目录号：C10408）
Atto633-AF-tRNA CUA ，琥珀色（ProteinExpress，目录号：CLD03）
BODIPY FL-Cys-tRNA Cys，半胱氨酸（biotechrabbit，定制）
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（Sigma-Aldrich，目录号：440140）
乌索醇丙酮（默克，目录号：100022）
Uvasol甲醇（Merck，目录号：106002）
光学胶Norland Optical Adhesive 81（Norland Products，目录号：NOA 81）
氮5.0气瓶纯度99.999％，50 Lt，200巴（林德气体）
用于分子生物学的碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
甲氧基聚乙二醇 - 琥珀酰亚胺基活性酯（PEG-NHS）（Rapp Polymere，目录号：125000-35）
用于分子生物学的磷酸盐缓冲盐水（PBS）10x pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9625）
三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP-HCl）（Thermo Fisher Scientific，Pierce TM，目录号：20490）
3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）缓冲剂等级（AppliChem，目录号：A1076,1000）
用于分子生物学的氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
咪唑缓冲级（AppliChem，目录号：A1073,1000）
Vaprox过氧化氢（H2O2）35％（STERIS，目录号：PB006）
硫酸（H 2 SO 4）ACS试剂（Sigma-Aldrich，目录号：258105）
裂解缓冲液（见食谱）
清洗缓冲液（见食谱）
洗脱缓冲液（见食谱）
最终缓冲区（请参阅食谱）
标记缓冲叠氮化物（见食谱）
标记缓冲液马来酰亚胺（见食谱）
食人鱼解决方案（见食谱）

设备

反作用镊子（IDEAL-TEK，目录号：2AX.SA）
杜兰250毫升烧杯（DWK生命科学，杜兰，目录号：21 106 36）
油管切割器（BOLA，目录号：S1852-28）
使用InLab微电极的pH计S20 SevenEasy（梅特勒 - 托利多国际，型号：S20，产品停产，可以使用新型号）
Eppendorf Thermomixer Compact（Eppendorf，目录号：5384000020）
Eppendorf冷冻微量离心机（Eppendorf，型号：5417R）
斯图尔特旋转器SB2（卡尔罗斯，目录号：Y549.1）
Vortex Genie 2（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，产品目录号：SI-0256）
NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 2000c，目录号：ND-2000C）
具有倒置奥林巴斯IX-81显微镜，脉冲激发，针孔直径30-75μm和同时双色检测的共焦显微镜MicroTime 200（PicoQuant，型号：MicroTime 200; Olympus，型号：IX81）
HydraHarp 400时间相关单光子计数（TCSPC）采集单元（PicoQuant，型号：HydraHarp 400）
荧光光谱仪QuantaMaster 7（国际光子技术现在Horiba，产品停产，可以使用新型号）
高输出真空压力泵（Merck，产品目录号：WP6222050）
UV光透照仪（Biometra，产品停产，可以使用新型号）

软件

MATLAB R2012a和更高版本（The MathWorks Inc.）
SymPhoTime 64（PicoQuant GmbH）
OriginPro 2018（OriginLab公司）

程序

无细胞表达和并入非天然氨基酸
1. 在冰上解冻DNA（包含目标基因的质粒，其序列中具有琥珀终止密码子和半胱氨酸密码子）（见注1）。
2. 解冻无细胞蛋白质合成（CFPS）试剂盒的组件
下面介绍两种不同的选项。要么在蛋白质中掺入独特的化学基团，可以在翻译后特异性标记（参见程序A1），要么直接掺入荧光团（参见程序A2）。也可以使用两种方法的组合，其中一种荧光团直接掺入，第二种荧光团在翻译后与独特的化学基团反应。

＆的＆NBSP; <强> A1。掺入对叠氮基苯丙氨酸（AzF）
1. 将所有反应组分混合在Eppendorf蛋白低结合管中。
  在批处理模式下使用RTS 100站点专用标签工具包（表1）（见注2）。
  
  表1. RTS 100站点特定标签套件反应组合
2. 将带有反应混合物的管放入Eppendorf热混合器中。
3. 将混匀器置于32°C和900 rpm的速度下反应2 h。
的 A2。使用预先加入的tRNA掺入荧光
1. 将所有反应组分混合在Eppendorf蛋白低结合管中。
  在批处理模式下使用定制的无细胞系统（表2）（见注3）。
  
  表2.定制的无细胞系统反应混合物
2. 添加荧光团带电的琥珀抑制子tRNA CUA和带荧光团的tRNA Cys 。两个荧光团应构成FRET对。例如Atto633-AF-tRNA CUA和BODIPY FL-Cys-tRNA Cys（见注4）。
3. 将反应混合物放入Eppendorf温度混合器。
4. 将温度调节器设置在32°C和900 rpm，让反应2小时。
用Ni-NTA和缓冲液交换纯化蛋白质（参见注释5）
1. 加入50μl磁性Ni-NTA珠粒到蛋白质低结合管中。
2. 通过加入200μl裂解缓冲液平衡Ni-NTA珠（见注6和食谱）。
3. 使用磁铁来固定珠子并去除上清液。
4. 重复2或3次。
5. 加入50μl反应液和150μl裂解缓冲液至平衡的Ni-NTA珠
6. 在转子（斯图尔特旋转器）上4℃放置2小时。
7. 使用磁铁来固定珠子并将上清液转移到Eppendorf管（流通式）中。
8. 向Ni-NTA珠粒中加入200μl洗涤缓冲液（见注6和配方）并短暂涡旋（2-3秒）。
9. 在4°C放置10分钟
10. 使用磁铁来固定珠子并将上清液转移到Eppendorf管（Wash 1）中。
11. 重复2次（洗涤2和3）。
12. 向Ni-NTA珠子中加入70μl洗脱缓冲液（见配方）并短暂涡旋（2-3秒）。
13. 在4°C放置10分钟
14. 使用磁铁来保存珠子并将上清液转移到Eppendorf蛋白低结合管（Elution）。
15. 拿一个Zeba脱盐柱。
16. 取下色谱柱底部并松开盖子。
17. 将色谱柱放入收集管中。
18. 在Eppendorf微量离心机中以1,500gxg离心1分钟并丢弃流出液。
19. 添加200μl最终缓冲液（请参阅食谱）或PBS（请参阅食谱）以进一步标记样本
20. 在Eppendorf微量离心机中以1,500gxg离心1分钟并丢弃流出液。
21. 再重复2次。
22. 将色谱柱转移至Eppendorf蛋白低结合管。
23. 应用从Ni-NTA珠粒洗脱的70μl样品。
24. 在Eppendorf微量离心机中以1,500xg克离心2分钟，并保持含有蛋白质的流通量。该蛋白质或者已经被双重标记（见程序A2），在这种情况下可直接用于smFRET测量（直接参见程序D）或其含有两个正交化学基团，即叠氮基（来自AzF）和巯基（来自Cys）（见程序A1），在这种情况下，他们需要在下一步中进行标记（见程序C）。
25. 在第二种情况下，使用Nanodrop测量蛋白质浓度以计算标记所需的染料浓度。
用荧光染料标记
1. 向蛋白质样品（在PBS缓冲液中）加入25倍过量的叠氮基反应性染料（例如Alexa647-DIBO）。
2. 将反应混合物放入Eppendorf温度混合器。
3. 在25°C和300转/分的条件下设置混合器，并在黑暗中反应15小时。
4. 准备PBS-TCEP，pH 7.5（见食谱）。
5. 在真空泵中脱气PBS-TCEP缓冲液2小时。
6. 按照与之前相同的程序（参见程序B），用磁性Ni-NTA珠粒和尺寸排阻纯化单标记的蛋白质。使用脱气的PBS缓冲液进行蛋白质的纯化和洗脱。
7. 加入20倍过量的巯基反应性染料（例如，Alexa488-马来酰亚胺）。
8. 将反应混合物的管放置在4°C黑暗中15小时。
9. 用磁性Ni-NTA磁珠纯化双标记蛋白，并按照相同的步骤进行尺寸排阻（参见程序B）。
10. 用最终缓冲液洗脱双标记的蛋白质。
制备钝化显微镜载玻片以便在溶液中进行测量
1. 将显微镜载玻片放入Coplin染色罐中。
2. 准备食人鱼解决方案（见食谱）（见注7）。
3. 小心地将Coplin染色罐装满Piranha溶液。
4. 将其置于引擎盖下至少1小时（请参阅视频1）。
  
  视频1
5. 用MilliQ水填充三个烧杯。
6. 用镊子夹住玻片并将它们从一个烧杯浸入下一个玻璃杯清洗
7. 将它们放在第三个烧杯中（见图1）。
  
  图1.利用MilliQ水将相继浸入三个烧杯中的食人鱼处理后的清洁显微镜载玻片
8. 用镊子取出载玻片，用甲醇冲洗并用氮气流干燥。
9. 将干燥的幻灯片放入洁净干燥的Coplin染色罐中。
10. 在Uvasol丙酮中配制2％APTES溶液用于载玻片的硅烷化。
11. 填充Coplin染色罐和APTES溶液。
12. 孵育10分钟。
13. 用镊子取出玻片，先用丙酮然后用甲醇冲洗
14. 用氮气流干燥载玻片，并将它们放在干净的表面上。
15. 切下Eppendorf蛋白低结合管，低于1 ml生产线（参见注释8）。
16. 使用砂纸对切边进行平滑处理（参见图2和视频2）。
  
  图2.使用切管器在1 ml生产线下方切割试管
  
  视频2
17. 在切割管的边缘上涂上光学胶，并将一个管放在一张玻片上。用不同的幻灯片上的其他管重复。
18. 在紫外灯下放置玻片。管子应该接触紫外透射仪，而不是滑板。
19. 打开紫外线1-2分钟以聚合胶水（见图3和视频3）。
  
  图3.使用粘在其上的管滑动
  
  视频3
20. 准备100mM的NaHCO 3溶液，pH 8.3。
21. 将50mg PEG-NHS酯溶解在400μlNaHCO 3溶液中。
22. 每个试管涂80μl以覆盖表面。
23. 仔细关闭试管并将滑块保持在4°C直至使用。
24. 使用前用MilliQ水冲洗载玻片，然后用甲醇和氮气流干燥。
共聚焦显微镜上的smFRET测量
1. 在粘在载玻片上的半切管内放置浓度约为2 nM的100μl双标记蛋白样品。
2. 在共聚焦显微镜上安装载玻片
3. 通过使用485 nm（对于蓝色染料）或640 nm激光（对于红色染料）激发，分别对每个荧光团进行荧光相关光谱（FCS）分析。
4. 确定存在于供体和受体染料的共焦体积中的分子N的数量，验证单体/非聚集蛋白质，确定量子产率（Kempe等人，2015）。
5. 将单个分子测量的样品分别稀释至N = 0.03，以确保在任何给定时间最多一个分子存在于共焦体积中。
6. 使用两种激光器（485 nm和640 nm激光器）交替激发两种荧光团（Müller等人，2005年）进行smFRET测量。

数据分析

使用SymPhoTime 64软件对FCS数据进行分析。
smFRET数据的分析使用自写的Matlab例程进行。欲了解更多详情，请参阅Gabba 等（2014）。

笔记

利用定点诱变在基因中突变感兴趣的蛋白质的位置，从而插入琥珀终止密码子（TAG）和半胱氨酸密码子（TGC）代替现有密码子。
重要提示：基因中不应存在其他半胱氨酸密码子。
RTS 100网站专用标签工具包是一个 E。大肠杆菌来源的无细胞转录/翻译系统从释放因子1（RF1）中耗尽并补充富集的正交琥珀抑制子tRNA Tyr CUA和AzF-特别用于对叠氮基 - 苯丙氨酸的tRNA合成酶（Gerrits等人，2007; Serwa等人，2009）。这样，携带AzF的琥珀抑制基因tRNA与RF1之间的竞争就会减少，从而更有效地掺入非天然氨基酸。该试剂盒由两种溶液组成：包含低分子量化合物（例如缓冲液，能量，氨基酸包括AzF，等等）的反应缓冲液和 E.其包含具有过表达的琥珀抑制子tRNA Tyr CUA和纯化的翻译机器（核糖体，翻译因子等等）的大肠杆菌提取物AzF-tRNA合成酶。该试剂盒保存在-80°C。
定制无细胞的 E。基于大肠杆菌的蛋白质合成系统应该被RF1耗尽以更有效地掺入琥珀抑制子tRNA并且也没有半胱氨酸以更有效地掺入cys RNA。我们的试剂盒由两种溶液组成：含有低分子量化合物（例如缓冲液，能量，除半胱氨酸之外的氨基酸等）的T / E混合物和S - 包含翻译机器（核糖体，翻译因子，等）的混合物。该套件存放在-80°C。
可以直接掺入蛋白质中的荧光团的选择是有限的。
大或带电荷的荧光团不能与核糖体隧道适应或强烈相互作用。
缓冲溶液需要适应感兴趣蛋白的要求。
当用共翻译引入的荧光团纯化样品时（参见程序A2），可以降低裂解和洗涤缓冲液中咪唑的浓度以避免与低浓缩蛋白竞争。在这种情况下，建议增加洗涤步骤数量。
小心：食人鱼解决方案具有很强的腐蚀性，会导致严重的灼伤。在发动机罩下工作并穿上全面保护（即，实验室外套，安全护目镜和合适的耐化学手套）。总是先放过氧化氢，然后慢慢加入硫酸。
我们通过将半切Eppendorf蛋白低结合管粘合到载玻片上来构建封闭室，以避免在显微镜测量期间样品蒸发。

食谱

裂解缓冲液，pH 7.5
50毫克MOPS
300 mM NaCl
5毫米咪唑
洗涤缓冲液，pH 7.5
50毫克MOPS
300 mM NaCl
10 mM咪唑
洗脱缓冲液，pH 7.5
50毫克MOPS
300 mM NaCl
500 mM咪唑
最终缓冲液，pH 7.5
50毫克MOPS
100 mM NaCl
标记缓冲叠氮化物，pH 7.5
1x PBS
标记缓冲液马来酰亚胺，pH 7.5
1x PBS
TCEP（10倍蛋白质中半胱氨酸的浓度）
食人鱼解决方案
1/3（v / v）30％H 2 O 2/2 2/3（v / v）H 2 SO 4 4/2

致谢

这项工作得到了ForschungszentrumJülich资源的支持。该协议是根据Sadoine et al。（2017）和Sadoine et。（2018）发布的程序改编的。作者声明没有竞争的财务利益。

参考

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Gerrits，M.，Strey，J.，Claußnitzer，I.，von Groll，U.，Schäfer，F.，Rimmele，M。和Stiege，W。（2007）。通过定点共翻译标记的无细胞合成定义的蛋白质结合物在：Kudlicki，WA，Katzen，F。和Bennett，RP（编辑）。无细胞蛋白质表达 166-180，Landes Bioscience，Austin，Tex。
Kempe，D.，Schone，A.，Fitter，J.and Gabba，M。（2015）。通过荧光相关光谱确定荧光量子产率的准确性 J Phys Chem B 119（13）：4668-4672。
Michalet，X.，Weiss，S.和Jager，M.（2006）。蛋白质折叠和构象动力学的单分子荧光研究 Chem Rev 106（5）：1785-1813。
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Sadoine，M.，Cerminara，M.，Gerrits，M.，Fitter，J。和Katranidis，A。（2018）。适用于smFRET研究的荧光团蛋白翻译合成 ACS Synth Biol 7（2）：405-411。
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