材料和试剂

移液器吸头
50 ml锥形管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
1.5和2ml Eppendorf管（Eppendorf，目录号分别为0030120086和0030120094）
微波特氟龙管，8毫升（VWR，目录号：525-0178）
尼龙膜过滤器，0.45微米（Frisenette，目录号：13NY045-100）
注射器，1毫升（Frisenette，目录号：9161406）
NanoVipers手拧配件，150μm（赛默飞世尔科技，产品目录号：6041.5820）
Synechocystis sp。 PCC6803 GT（耐受葡萄糖的菌株，来自美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学生物系Himadri Pakrasi实验室）
用于ICP-MS校准的多金属校准标准（CPI International，产品目录号：P / N4400-132565A和P / N4400-132565B）
EDTA，BioUltra（Sigma-Aldrich，目录号：E1644-100G）
Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T9784-25G）
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：62971-50G-F）
蔗糖，BioExtra（Sigma-Aldrich，目录号：S7903-1KG）
氯化钠（NaCl），BioExtra（Sigma-Aldrich，目录号：S7653-250G）
氯化镁（MgCl 2·7H 2 O），BioExtra（Sigma-Aldrich，目录号：M2670-1KG）
Na抗坏血酸盐，BioExtra（Sigma-Aldrich，目录号：11140-250G）
氟化钠（NaF），BioExtra（Sigma-Aldrich，目录号：S7920-100G）
液氮
Pierce BC BCA蛋白分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23225）
玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G4649）
Milli-Q水
PlasmaPURE 67-69％HNO 3（SCP SCIENCE，目录号：250-039-175）
30％H 2 O 2（用Milli-Q水制备15％H 2 O 2）（Sigma -Aldrich，目录号：31642）
正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷（β-DM）（Anatrace，目录号：D310LA）
Bis-Tris，BioExtra（Sigma-Aldrich，目录号：B7535-100G）
甘油，BioExtra（Sigma-Aldrich，目录号：G6279）
甜菜碱，BioUltra（Sigma-Aldrich，目录号：61962-250G）
Pefabloc SC（Roche Diagnostics，目录号：11429868001）
苹果叶，标准参考物质（Sigma-Aldrich，目录号：NIST1515）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-1KG）
Na 2 S 2 O 3·5H 2 O（Merck，目录号：1.06516.0500） />
FeNH 4柠檬酸盐（MP Biomedicals，目录号：02158040）
Na 2 CO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S7795-500G）
K 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
NaNO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S8170-250）
MgSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：M2643-500G）
CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C5670-500G）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：251275-100G）
Na 2 -EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E4884-500G）
H 3 BO 3（Sigma-Aldrich，目录号：B6768-500G）
MnCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：244589-50G）
ZnSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251-100G）
NaMoO 4（Sigma-Aldrich，目录号：M1003-100G）
CuSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：209198-100G）
Co（NO 3）2（Alfa Aesar，目录号：36418.22）
BG11-G（见食谱）
100x BG-FPC（见食谱）
1000x微量元素库存（请参阅食谱）
FeNH 4柠檬酸盐储备（见食谱）
Na 2 CO 3储备（见食谱）
K 2 HPO 4股票（见食谱）
EDTA洗涤缓冲液（见食谱）
Tricine缓冲液（见食谱）
溶菌酶溶液（见食谱）
匀浆缓冲液（见食谱）
Tricine-NaF缓冲液（见食谱）
存储缓冲区（请参阅食谱）
增溶缓冲液（见食谱）
洗涤剂解决方案（请参阅食谱）
流动相缓冲液（见食谱）

设备

移液器
2升锥形瓶（Fisher Scientific，目录号：11961566）
制造商：Pyrex，目录号：1130 / 30D。
定轨摇床（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Innova 2150，目录号：M1194-0010）
Eppendorf离心机5418 R，冷藏（Eppendorf，型号：5418 R，目录号：5401000013）
Eppendorf离心机5430 R，冷藏（Eppendorf，型号：5430 R，目录号5428000210）
Beckman Coulter离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-25），带19型转子，固定角度。
250毫升瓶（Beckman Coulter，产品目录号：325620）
Microfluidizer处理器（Microfluidics，型号：M-110L）
光学显微镜（蔡司，型号：Axiovert 135电视）
珠磨机TissueLyser II（QIAGEN，目录号：85300）
TissueLyser II适配器套件（QIAGEN，目录号：69982）
Heraeus Fresco 21冷冻微量离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75002425）
HPLC微量管PP，300μl和螺帽PP，PFTE（VWR，目录号：548-0440和548-0787）
尺寸排阻柱，Biobasic SEC-1000分析柱（300×7.8mm）和保护柱（30×7.8mm），5μm粒径，1000孔径（Thermo Fisher Scientific，目录号：73605-307846和73605-037821）
加压Ultrawave系统（Ultrawave系统，Milestone Srl，Sorisole，意大利）
HPLC系统，生物惰性（即流动相和样品不与金属部件接触）（Thermo Fisher Scientific，Dionex，型号：UltiMate 3000）
Dionex TM ICS-5000 + DP双泵（Thermo Fisher Scientific，型号：ICS-5000 + DP）
ICP-MS / MS（Agilent Technologies，型号：8800三重串联四极杆ICP-MS）
雾化器，Ari Mist HP（Burgener Research，目录号：AM HP 5500）
用于ICP的气体：5.0级液氩和反应气体：20％氩气中的氧气（AGA，目录号：107407和714039）

软件

MassHunter 4.2工作站软件8800 ICP-MS / MS数据分析（安捷伦科技）

程序

图1给出了整个协议的概述。

图1.说明测定全细胞和类囊体中总金属浓度的示意性工作流程，以及更详细地分析金属分配入集胞藻的光合复合体。大写字母（AE）表示协议中的相应程序。

全细胞制备
1. 在2L锥形瓶中，在0.5L BG11-G生长培养基中接种集胞蓝细菌菌株（参见食谱）。按照标准微生物学实践，将每种菌株（生物学重复）的至少三个独立培养物接种至最终0.05OD 750。
2. 在50μmol光子m-2秒-1的光强度下培养培养物，并在定轨摇床上摇动摇瓶，转速为100 rpm，直到培养物达到指数晚期相（0.8-0.9 OD 750分钟）。应用这些生长条件，培养物应在5天左右达到所需的密度。
3. 在收集培养物之前，测量每种培养物的OD 750。
4. 对于每种培养物，在整个细胞样品中保留50ml培养物用于蛋白质浓度测定（步骤A8-A13）。
5. 沉淀剩余的培养物，使用适用于Beckman Coulter离心机的19型转子的250ml瓶子，在5000gxg离心10分钟（在室温下）。重复离心步骤，沉淀其余的培养体积。
6. 用50ml EDTA洗涤缓冲液洗涤细胞沉淀（参见食谱），在室温下将细胞在5,000gxg下沉淀10分钟，丢弃上清液并重复该洗涤步骤两次（注1 ）。第一次洗涤后的上清液会显得有些颜色（带有黄橙色的阴影），而第三次洗涤的上清液应该清澈（图2）。
7. 用50ml Tricine缓冲液洗涤沉淀（参见食谱），将细胞以5,000μg×g沉淀10分钟，弃去上清液并重复该洗涤步骤两次。在最后一次离心步骤之前，将细胞悬浮液分成两部分，并通过在室温下以5,000μg×g离心10分钟来沉淀两种细胞组分。一个细胞沉淀物构成准备分析的整个细胞制备物（参见程序C）。用于整个细胞制剂的小球可以在液氮中冷冻并储存在冰箱中直至分析。直接对第二个细胞沉淀进一步处理以获得类囊体膜（步骤B1-B6）。
  注：金属浓度将根据蛋白质浓度进行标准化。因此，需要确定每个细胞数量的蛋白质浓度。为了准确测定全细胞样品中的蛋白质浓度，完整的细胞破裂是必不可少的。
8. 根据步骤A6-A7处理在步骤A4收集的细胞，并在Tricine缓冲液中重悬细胞沉淀至OD 750（参见食谱）。
9. 加入1毫升溶菌酶溶液（见食谱）到细胞悬液中，并在室温下轻轻摇动30分钟。在我们的手中，这一步有助于随后的破裂。
10. 按照制造商的说明反复使微流化器处理器中的细胞破裂。
  。七到八个周期通常足以获得完整的细胞破裂。
11. 在光学显微镜下检查细胞破裂以确认细胞完全破裂。
12. 使用Pierce bicinchoninic acid（BCA）蛋白测定试剂盒（见材料和试剂）测定样品的蛋白质浓度，用于总蛋白的比色检测和定量。确定的蛋白质浓度指示1ml细胞裂解物中蛋白质的μg，并且因此表示在1OD 750℃下1ml培养物中的μg蛋白质。
13. 通过将步骤A12中获得的蛋白质浓度乘以步骤A3中测量的OD 750值和收集的细胞的初始培养体积来计算步骤A7中收集的全部细胞级分的蛋白质浓度，其中在这种情况下是225ml（步骤A1中的500ml初始培养物减去步骤A4中放置的50ml，并根据步骤A7除以2）。
  
  图2.用EDTA洗涤缓冲液洗涤细胞沉淀三次如步骤A5所述收获的细胞沉淀用EDTA洗涤缓冲液洗涤三次（步骤A6）。第一次洗涤的上清液具有明显的黄橙色（1sst），在第二次洗涤（第2次）和第3次洗涤（第3次）洗）。显示含有EDTA洗涤缓冲液（B）的透明锥形管用于比较。
类囊体制剂（注2）
注意：在以下步骤中，样品必须保存在冰上，建议在暗绿色光下执行所有步骤以保护光合作用复合物。所有离心步骤在4℃进行。
1. 将步骤A1-A7中制备的细胞沉淀重新悬浮在1ml匀浆缓冲液中（见配方），并将细胞悬浮液转移到装有1ml玻璃珠的2ml Eppendorf管中。
2. 珠磨机中的破裂细胞，使用冷却的架子（在-20℃保持架15分钟）。珠磨机通过用玻璃珠高速振荡破碎细胞。细胞破碎是在六个循环的珠子跳动过程中进行的，每个循环包括1分钟的珠子跳动，然后在冰上培养1分钟。
3. 通过在16,000×gg离心2分钟分离未破碎的细胞和玻璃珠。
4. 将上清液转移到1.5ml Eppendorf管中，并在16,000×gg下沉淀类囊体膜1小时。
5. 在500μlTricine-NaF缓冲液（离心20分钟，16,000×g g）中洗涤两次类囊体并使用BCA测定试剂盒测定蛋白质浓度。
6. 将类囊体离心20分钟，16,000×g，小心弃去上清液。将沉淀或者消化以测定总金属分析（程序C）（注3）或者重新悬浮在储存缓冲液中，在液体N 2中冷冻并且在-80℃下储存至多达3个月，直到准备SEC-ICP-MS / MS分析（程序D）。
全细胞和类囊体膜中总金属浓度的测定
注：清洁消耗品和清洁实验室程序必须在以下所有步骤中使用。建议至少包括一个认证参考（苹果[Malus domestica]叶，NIST 1515;美国国家标准与技术研究院），每次消化过程中只有一个真正的空白。
1. 解冻整个细胞和类囊体膜的颗粒（分别如步骤A和B中所述制备），并将70％（v / v）HNO 3（参见注释4）直接添加到Eppendorf管。样品预先消化2小时（将Eppendorf管打开，松散地用塑料袋盖住以减少污染）。
2. 小心地将预消化的样品转移（通过吸取）到8ml特氟龙消化管中。
3. 在HNO 3中加入15％（v / v）H 2 O 2 O 2（H 2 O 3）根据步骤C1），2.5比1的比率（参见注释5）。
4. 使用加压微波系统（根据Hansen等人报道的详细描述，，Milestone， [2013]）消化样品。
5. 将样品转移到干净的管中，用Milli-Q水冲洗Teflon消化管至少三次。
6. 使用Milli-Q水将样品稀释至终浓度为3.5％HNO 3（v / v）（参见注释6）。准备用于感兴趣金属的外部校准的校准标准（覆盖至少三个数量级和8到10个校准点的线性范围）。
7. 通过ICP-MS分析样品包括校准标样。
用于SEC-ICP-MS / MS测量的类囊体制剂
注意：在以下步骤中，样品必须保存在冰上，建议在暗绿色光下执行所有步骤以保护光合作用复合物。所有离心步骤在4℃进行。
1. 在冰上和黑暗中解冻类囊体膜样品
2. 取一个均匀的子样品（在本例中：相当于300μg蛋白质，参见步骤B5）（轻轻地上下移液管，避免涡旋）。
3. 通过在7,000×gg离心2分钟使微量离心机中的类囊体膜颗粒化。
4. 弃去上清液并重悬于150μl冰冷的溶解缓冲液（新鲜制备，参见食谱）中使类囊体膜重新悬浮（通过轻轻吹打上下）至最终蛋白质浓度为2μg/μl。
5. 加入等体积的洗涤剂溶液（150μl，参见食谱）至1μg/μl的最终蛋白质浓度，并将类囊体膜在冰上和黑暗中溶解10分钟。
6. 通过以16,000×gg离心10分钟将溶解的蛋白质（上清液）与不溶物质（沉淀物）分离。
7. 立即收集溶解的蛋白质（上清液），并使用1ml注射器通过0.45μm尼龙膜过滤器进入HPLC微量瓶。
8. 保持样品在冰上和黑暗中，直到后续的形态分析（程序E）。
SEC-ICP-MS / MS测量：光合成络合物中金属结合的测定（形态分析）
注意：在形态分析过程中，HPLC自动进样器和柱室在6°C保持冷却。该协议的这一部分基于Schmidt等人开发的方法。（2015）
1. 用流动相缓冲液平衡HPLC系统和大小排阻柱（参见食谱）至少1小时。
2. 使用HPLC系统将50μg新溶解的类囊体蛋白注射到大小排阻柱上。
3. 使用流动相缓冲液进行等度蛋白分离和洗脱，流速为1 ml / min，时间为35分钟
4. 对于光合蛋白复合物中结合的金属的在线检测，色谱柱出口直接与ICP-MS / MS（注7）相连。
5. 记录具有多元素检测的时间分辨色谱图（图3）。
图3：多金属色谱图。对于非氧化物离子24Mg + 55和55nm记录的尺寸排阻分布曲线Mn + +和氧化物离子72 + FeO + +。根据Gandini等人（2017年）分配了单独的Mn和Fe亚组分，Mg分布图被证明是叶绿素的代用品。

数据分析

总金属浓度
使用Masshunter软件（该软件能够自动计算样品浓度），从每种金属的外部校准曲线确定全细胞和类囊体膜中的金属浓度。数据被输出并且金属浓度针对每个样品的蛋白质浓度被标准化。建议对至少两个独立实验进行金属浓度的双因素方差分析（ANOVA），每个独立实验由每种感兴趣菌株的三种独立制剂组成，以考虑实验之间的任何差异。在这方面，我们观察到一个菌株的金属计数在两个独立实验中比在相同实验的独立培养物中差异更大。这种差异可能是由于各种原因造成的，例如文化收集时略有不同的对数期。
形态分析
通过SEC-ICP-MS分析每个菌株至少三个独立的样品。至于总金属浓度分析，我们强烈建议分析至少两个独立实验。 SEC-ICP-MS色谱图可针对每种感兴趣的金属单独制备，或通过覆盖更多金属构建单一多金属色谱图。准备一个代表性样品的色谱图。数据以每秒离子计数作为保留时间的函数呈现。金属型材可以进行背景校正或作为原始数据显示（图3）。
根据Gandini et。（2017）分配各个峰值。

笔记

EDTA被用于去除位于外膜和周质间隙中的Mn存储池（Keren等，2002）。
这里描述的类囊体制剂实际上由外膜，质膜和类囊体组成。然而，到目前为止，类囊体是样品中主要的膜。制备过程中类囊体的丰度从得到的生球丸中特别明显，并且当膜制备物装载到蔗糖阶梯上时（如Omata和Murata，1985中所述，见图4）。

图4.程序B中所述的类囊体制剂的膜组成类囊体是最丰富的膜类型，但其他膜也包括在制剂中（质膜和外膜）。蔗糖阶梯梯度根据Omata和Murata，1985年制备。
如果优选的话，可将类囊体小球冷冻在液体N 2中（以确保沉淀保留在Eppendorf管的底部）并储存在冰箱中直到消化完全金属分析。
在目前的方案中，将625或50μl的70％（v / v）HNO 3加入全细胞样品（25ml OD 7501集胞蓝细菌大约相当于73mg蛋白质）和类囊体小球（相当于0.73mg蛋白质）。重要的是要注意，给定的蛋白质含量可能会调整（最可能进一步降低）。但是，在预消化过程中，确保全细胞和类囊体颗粒完全被HNO 3覆盖。
添加H 2 O 2 2有利于在较低温度下完全消化。
为确保准确稀释，每个样品的稀释均使用分析天平进行。记录每个样品在稀释后的每个样品的重量（稀释因子），用于随后的计算和数据分析。
ICP-MS / MS在MS / MS扫描模式下以氧气作为反应气体进行操作，可以灵敏地同时分析氧化物和非氧化物离子：+ 24 Mg + + 55 Mn + +和+ 72 FeO + +组成。积分时间设置为每个金属0.1秒。建议每天调整ICP-MS / MS的等离子和离子透镜条件，以确保等离子体稳定性和最大灵敏度。
在含有葡萄糖的BG11生长培养基（BG11-G，参见食谱）中培养集胞葡萄糖耐受性菌株（参见材料和试剂）以促进光合突变体的研究（Gandini等人。 2017）。然而，也可以使用其他集胞蓝细菌菌株与BG11培养基但不含葡萄糖的组合（Rippka等，1979）。

食谱

BG11-G液体生长培养基，1L（见注8）
5毫升1 M葡萄糖
Na2.5g / L Na 2 S 2 O 3 0.5H 2 O
10毫升100x BG-FPC
1ml FeNH 4柠檬酸盐原料
1毫升Na 2 CO 3储备
1毫升K 2 HPO 4股票
用超纯水加1升，用高压灭菌器灭菌
100x BG-FPC
1.76M NaNO 3
30.4mM MgSO 4
24.5mM CaCl 2 2/2 3.12 mM柠檬酸
0.279mM Na 2 -EDTA
1/10（v / v）1,000x微量元素库存
1000x微量元素库存
46.3mM H 3 BO 3 3 9.15mM MnCl 2·/ 2 0.77mM ZnSO 4。
1.61mM NaMoO 4 / sub>
0.32mM CuSO 4
0.17mM Co（NO 3）2：
FeNH 4柠檬酸盐原料
6毫克/毫升FeNH 4柠檬酸盐
通过高压灭菌器消毒
Na 2 CO 3储备
198mM Na 2 CO 3 3 通过高压灭菌器消毒
K <2> HPO <4>股票
175mM K 2 HPO 4 4 通过高压灭菌器消毒
EDTA洗涤缓冲液
5 mM EDTA
20 mM Tricine，pH 7.9
Tricine缓冲液
20 mM Tricine，pH 7.9
溶菌酶溶液
10毫克/毫升溶菌酶
均化缓冲液
0.4 M蔗糖
10 mM NaCl
5mM MgCl 2·/ 2 20 mM Tricine，pH 7.9
新鲜加入：10mM Na-抗坏血酸盐，10mM NaF
Tricine-NaF缓冲液
5 mM Tricine，pH 7.9
新鲜加入：10 mM NaF
存储缓冲区
0.4 M蔗糖
10 mM NaCl
5mM MgCl 2·/ 2 20 mM Tricine，pH 7.9
20％甘油
新鲜加入：10 mM NaF
增溶缓冲液
25 mM Bis-Tris（pH 7 / HCl）
12.5％（v / v）甘油
2 M甜菜碱
0.25 mg / ml pefabloc SC
洗涤剂解决方案
注意：洗涤剂溶液由储存在-20℃的10％β-DM储备液制备。
在增溶缓冲液中制备2％（w / v）β-DM
流动相缓冲区
25 mM Bis-Tris（pH 7 / TFA）
0.03％β-DM

致谢

这项研究得到丹麦独立研究基金 - 技术和生产科学（批准号：DFF-5054-00042至S.B.S.）的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

勃兰登堡，F.，Schoffman，H.，Keren，N。和Eisenhut，M.（2017）。集胞藻中锰浓度的测定 sp。 PCC6803使用ICP-MS。 Bio-protocol 7（23）：e2623。
Gandini，C.，Schmidt，S.B.，Husted，S.，Schneider，A.和Leister，D。（2017）。转运蛋白SynPAM71位于质膜和类囊体中，并介导集胞藻中的锰耐受性 PCC6803。 New Phytol 215（1）：256-268。
Hansen，T.H.，de Bang，T.C.，Laursen，K.H.，Pedas，P.，Husted，S.and Schjoerring，J.K。（2013）。使用ICP光谱测定的多元素植物组织分析。 Methods Mol Biol 953：121-141。
Keren，N.，Kidd，M.J.，Penner-Hahn，J.E。和Pakrasi，H.B。（2002）。在光合细菌集胞藻中大量积累锰的光依赖性机制 > sp。 PCC 6803. Biochemistry 41（50）：15085-15092。
Omata，T.和Murata，N。（1985）。由蓝细菌（蓝绿藻）制备的细胞质和类囊体膜中的电子传递反应Anacystis nidulans和 Synechocystis PCC 6714. Biochim Biophys Acta 810（3）：354-361。
Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，J.B.，Herdman，M.和Stanier，R.Y。（1979）。蓝藻纯培养物的一般分配，菌株历史和特性。微生物学 111（1）：1-61。
Schmidt，S.B.，Persson，D.P.，Powikrowska，M.，Frydenvang，J.，Schjoerring，J.K。，Jensen，P.E。和Husted，S。（2015）。金属结合于大麦类囊体的光系统II超级复合体和亚复合体植物Physiol 168（4）：1490-1502。