材料和试剂

手套
碳钢手术刀24号（Swann-Morton，目录号：0211）
双刃不锈钢剃须刀片（Electron Microscopy Sciences，目录号：72000）
Nunc TM 细胞培养/培养皿（35 mm，Thermo Fisher Scientific，目录号：150318）
10毫升注射器（Terumo Medical，目录号：SS-10ES）
康宁®真空过滤系统500 ml，无菌，孔径：0.22μm（Corning，目录号：431097）
无菌取样罐：无菌40毫升带螺旋盖的聚丙烯直筒容器（Dominique DUTSCHER，Corning GOSSELIN TM ，目录号：688252）
Falcon Corning ® 15 ml PP离心管（Corning，目录号：430791）
Falcon Corning ® 50 ml PP离心管（Corning，目录号：430829）
Fisherbrand TM SureOne TM 0.1-10μl气溶胶屏障移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：11903466）
Fisherbrand TM SureOne TM 20-200μl气溶胶屏障移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：11963466）
Fisherbrand TM SureOne TM 100-1,000μl气溶胶屏障移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：11973466）
Costar ® 5 ml Stripette ®血清移液管，无菌（Corning，目录号：4487）
Costar ® 10 ml Stripette ®血清移液管，无菌（Corning，目录号：4488）
Costar ® 25 ml Stripette ®血清移液管，无菌（Corning，目录号：4489）
Axygen ® 0.2 ml带平盖的薄壁PCR管（Corning，目录号：PCR-02-C）
Axygen ® 0.6毫升Maxy Clear SnaplockMicrocentrifuge Tube（康宁，目录号：MCT-060-C）
Millicell ®细胞培养插入物（Merck，目录号：PICMORG50）
Per2 ::荧光素酶纯合子敲入（KI） Musmusculus（Per 2tm1Jt ）
注意：小鼠最初来自杰克逊实验室。通常，我们使用来自我们自己的繁殖群体（Chronobiotron平台，斯特拉斯堡的UMS-3415）的年轻成人（2-6个月大）小鼠，雄性和雌性。除了特定的方案外，将小鼠分成三组或四组，每组随意提供食物和水 - 在防风通风的室内，12小时白光和12小时暗红灯（在笼水平<5勒克斯））循环（LD12：12;上午7:00点亮）。
抗生素（青霉素 - 链霉素10,000 U / ml; 10,000 mg / ml，Sigma-Aldrich，目录号：P4333）储存于-20°C
B27（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044）储存在-20°C
Hank的平衡盐溶液与红酚（HBSS; 10x，Sigma-Aldrich，目录号：H1641）在室温下储存
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）储存在4°C
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8761）储存在4°C
杀菌剂/杀菌剂：ANIOSYME DD1（Laboratoires ANIOS，Lille-Hellemmes，France）
片剂中的商品氯制成10x漂白剂
Dulbecco的改良Eagle's培养基10x（DMEM），低葡萄糖，无红酚（Sigma-Aldrich，目录号：D2902），储存于4°C
D（+）葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021），在室温下储存
甲壳虫荧光素（Promega，目录号：E1602），储存于-80°C
高真空润滑脂（Dow Corning ®，Wiesbaden，德国），室温下储存
MilliQ Water
EtOH 70％
0.1 M荧光素（见食谱），储存于-20°C
HBSS 1x（见食谱），储存在4°C
DMEM 1x（见食谱），储存在4°C
工具清洁解决方案（见食谱）

设备

注意：所有未经参考的商品都可以从任何合格的公司订购。

不锈钢鼠脑矩阵（成人鼠脑切片机矩阵，Zivic仪器，目录号：BSMAS005-1）
注意：存在其他脑基质（对于仓鼠或大鼠）。
不锈钢镊子，细尖，直。
注意：为了更好地了解解剖工具，请参见图1.

图1.协议期间使用的手术器械。 1）第24号碳钢手术刀.2）双刃不锈钢剃刀刀片。 3）不锈钢鼠标脑基质。 4-5）不锈钢镊子，细尖，笔直。 6）弗里德曼骨钳。 7）弯曲的剪刀，细尖。 8）不锈钢手术剪，直。
不锈钢操作剪刀，直。
弯曲的剪刀，精细的提示
弗里德曼骨头咬骨钳
真空泵（KNF，目录号：N86KN.18）
红灯（约620-650纳米）
光纤光源（肖特，目录号：KL 1500LCD）
立体显微镜（尼康，目录号：536087）
灭菌BRAND ®培养皿，玻璃，尺寸100 mm x 15 mm（品牌，目录号：455742）
1升灭菌瓶
500毫升灭菌瓶
100毫升灭菌量筒
1升灭菌量筒
1升灭菌烧杯
磁铁
磁板（尺寸：足够1升烧杯;强度：足以将粉末溶解成液体）
P10 pipetman ® classic（Gilson，目录号：F144802）
P20 pipetman ® classic（Gilson，目录号：F123600）
P200 pipetman ® classic（Gilson，目录号：F123601）
P1000 pipetman ® classic（Gilson，目录号：F123602）
Pipetboy acu 2（INTEGRA Biosciences，目录号：155019）
Milli-Q ®水系统
制冰机
冰箱（4°C）
通风柜（水平流动）
通风柜（垂直流动）
高压灭菌器
在36.5°C培养箱内作为LumiCycle 32（Actimetrics，Wilmette，IL，USA）的计数仪器
37°C培养箱
注意：培养皿将被密封。我们不需要5％CO 2 ;一个仅将培养基或培养皿保持在37°C的培养箱就足够了。

软件

LumiCycle分析数据提取
表格软件如Microsoft Office Excel用于数据提取
SigmaPlot统计数据
GraphPad图表

程序

在实验之前

准备抗生素和B27等分试样，并保持在-20°C。准备1 mM的荧光素（参见食谱）。
注意：等分试样应避免重复冻/融循环，最好少于5次。
根据其基因型对您的动物进行分类，以选择纯合子敲入（KI）小鼠的转基因 Per2 :: Luc ;请记住，由于只存在一个等位基因，异质KI / +应该有一半的信号。
注意：我们用于PCR基因分型的探针与Yoo等，（2004）中描述的相同。
在干净的通风橱下准备HBSS 1x和DMEM 1x（参见食谱）。
注意：可以在实验当天准备新鲜的HBSS 1x和DMEM 1x，但HBSS必须足够冷。

在实验当天

制备
1. 通过添加B27，抗生素和荧光素来准备即用型DMEM培养基（参见食谱）。
  注意：没有必要再次过滤介质。
2. 为每只动物准备取样罐，装满HBSS 1x足以让大脑洗澡（约10毫升）。
3. 准备培养皿和样品一样多。在封面上给它们编号。每个中加入1毫升即用型DMEM，并用真空润滑脂覆盖顶部。润滑脂避免介质在37°C蒸发：样品不会干燥，设备会保持干燥。将盖子轻轻放在培养皿上，并将其保持在37°C的培养箱中。
  注意：
  1. 避免使用红色/粉红色墨水。要打开LumiCycle并将样品放入其中，必须在红灯下完成。
  2. 要轻松盖住顶部，首先用油脂填充10 ml注射器（参见视频1）。
视频1
1. 用70％EtOH清洁通风橱（水平流量）和内部所有设备（立体显微镜，灯）。用70％EtOH清洁脑基质和所有镊子，让它们在干净的通风橱下干燥。用铝纸覆盖脑基质，并将其保持在4°C至少1小时，然后冷却下来。
  注意：也可以将矩阵放入冰箱冷却，但不要让它进入太多时间。如果基质太冷，大脑会坚持下去。如果发生这种情况，将一些HBSS培养基滴在大脑和基质上以取下切片。＆nbsp;
采样
1. 通过颈椎脱臼杀死小鼠。
2. 然后，快速获取大脑并将其保存在冰上/冰箱中的HBSS 1x中，直至解剖。
3. 为了避免组织退化（如果所有程序都超过~1小时），我们建议一次牺牲一到两只动物。
  注意：＆NBSP;
  1. 这种牺牲方法是根据法国国家法和2010年9月22日欧洲委员会指令（2010/63 / UE）的规则进行的。
  2. 我们不使用镇静剂。你可以使用另一种牺牲方法，让你快速获得大脑。
  3. 如果您需要多个样品，请在采样的时候小心。重要的是在同一时刻进行采样，或检查一天中不同时刻的采样是否不影响您的数据。
  4. 我们通常每只动物花费不到1分钟就可以在大脑死亡后提取大脑。＆nbsp;
解剖
1. 将大脑置于基质内，并用剃刀刀片（约500μm厚度）将其切成一片。将大脑颠倒放置可能是寻找解剖学标志作为视交叉的解决方案，并在大脑图谱的帮助下找到包含感兴趣区域的切片的位置（参见图2）。也可以对整个大脑进行切片（参见视频2），然后选择您感兴趣的结构所在的切片。
  注意：我们通常花费不到2分钟来切割整个大脑。
图2.矩阵中的大脑颠倒。箭头指向的视交叉可用作解剖标志。

视频2
1. 显微切割在立体显微镜下在冷HBSS中，在玻璃和灭菌的培养皿中进行。尽量减少样品以适应1 mm 2 ：这样，组织可以轻松获得所需的所有营养素，并避免坏死。
  注意：
  1. 也可以使用塑料培养皿，但是在一次或两次显微切割后，手术刀在其上留下痕迹而不在玻璃上。此外，玻璃培养皿可在灭菌后再次使用。
  2. 我们通常使用镊子来保持样本和手术刀切割含有感兴趣结构的方形。然而，如果相邻区域也振荡，则仅对感兴趣的区域进行显微切割是重要的。例如，SCN在没有任何问题的情况下适合正方形，而我们感兴趣的另一个脑结构habenula需要将其周围的所有其他组织移除。
  3. 根据感兴趣区域的难度，我们通常花费3-5分钟进行显微切割。如果你有很多大脑，一个人可以用矩阵切割大脑，而第二个人则是微观切割以加速实验。
2. 在对应于样品的培养箱内取出培养皿，并将细胞培养插入物（Millicell ®）放在培养基上。它下面不应该有任何气泡。如果是这种情况，请将其拿出并放回原处。用镊子将样品放在其顶部，或用1,000μl移液器回收样品。取出培养插入物顶部残留的HBSS1x（见视频3）。
视频3
1. 将样品放回培养箱中，直到收集完所有样品。
  注意：我们通常花费不到5分钟将样品放在插入物上并将培养皿放回培养箱内。＆nbsp;
LumiCycle
1. 最后，将样品放入光子计数光度计作为LumiCycle。您将需要处于昏暗的红光和低强度，以避免光线（主要是绿黄色光）改变内部敏感的光电倍增管。正如其名称所示，LumiCycle 32允许你在里面有32个样本。您可以一次或多次打开它们。
2. 我们通常在一小时内将样品记录3次，每个样品设置112秒。
3. 7天后，如果您想将样品保存在录音中，则需要更换介质。
  注意：这取决于您的样本（大小，荧光素的消耗量......）和您的实验时间表。您需要检查样品振荡并在它们不足时进行更改。＆nbsp;
清洁的
1. 为了确保在用于解剖或培养的培养基中不会生长细菌或真菌，我们将10x漂白剂加入其中直至液体变得清澈然后丢弃。
2. 将所有使用的镊子和脑基质放入清洁溶液中至少20分钟。它们需要完全浸渍或至少与组织接触的部分。用自来水清洗设备并擦干。小心;解决方案有毒;因此，不要在水槽中丢弃它。
  注意：我们通常会让清洁溶液中的工具过夜。避免使用漂白剂，因为它会损坏您的设备。
3. 使用70％EtOH清洁通风橱（水平流量）和内部所有设备（立体显微镜，灯泡）。

数据分析

LumiCycle分析
注意：即使LumiCycle仍在录制，您也可以在实验的每个时刻复制录制文件。

我们使用LumiCycle分析，该分析符合数学模型，用于提取振荡特征（周期，振幅，acrophase）。您可以手动计算，但软件非常准确且省力。
首先，我们用24小时运行平均值减去振荡的基线。最后，我们获得了一条正弦曲线，该曲线围绕y轴的0振荡，这可以与不同的数学模型相关联。数据的平滑有助于实验和理论振荡之间的最佳拟合。
然后，我们使用'LM fit（dampened）'模型，它最适合我们的振荡。它将润版考虑在内并给予我们适当的拟合（良好），这意味着100％是您的模型在您的数据上的完美拟合（LumiCycle软件，Actimetrics）。从数学模型中，软件计算所选振荡时间窗的周期和第一峰值幅度（通过选择相对T 0 ）。与“LM拟合”不同，周期图模型计算周期的平均值和振荡的幅度。我们还在黄色滑块的帮助下测量了峰值，峰值出现的时间，这使得我们可以在其位置上获得时间。
有关详细步骤，请参阅视频4。
注意：由于生物发光的巨大峰值（人工制品），我们通常会跳过录制的第一个小时。我们建议至少在3天内进行此分析。

Viedo 4
然后，我们将振荡数据（原始或基线减去）导出为.csv文件，可以通过表格软件打开。这允许我们使用所需的图形软件重新创建振荡（参见图3）。

图3.来自 Per2 ::荧光素酶转基因小鼠的habenula样品振荡的实例 .3天后（第一个箭头），将样品从LumiCycle中取出另一个实验并用新的培养基（第二箭头）放回去。最后一个箭头表示样品在最后一次更换后（大约10.5天）死亡。
排除
'LM fit（dampened）'型号提供合适的贴合度（良好）。阈值应该由用户定义，在该阈值下振荡被认为是心律失常的。但是，不能排除样本。
当没有观察到节奏并且数据像平坦时，有两种可能性：细胞不同步（在组织水平，节律消失）或样本死亡。当样品死亡时，生物发光的数据值必须在设备的噪声范围内。对于每个光电倍增器，只需在LumiCycle中放入没有任何样品的介质即可获得噪音。
注意：我们通常将habenula样本的阈值设置为70％。您需要每次验证数据如何适合模型。

笔记

故障排除步骤

食谱

0.1 M荧光素
注意：在该方案中，我们使用0.1mM荧光素。浓度太高是有毒的。其他方案可用于不同浓度的荧光素，但它们不应超过1 mM。请注意，不同浓度的荧光素会导致不同的结果。有关详细信息，请参阅Feeney等人。（2016）
1. 直接在荧光素罐（50mg）中加入1.57ml MilliQ水
2. 准备等分试样并将其储存在-20°C的防光容器中
HBSS 1x（1升）
1. 将所有组件加入无菌烧杯中的干净通风橱下（仅使用灭菌材料/设备）：
  100毫升HBSS 10x
  4.7毫升碳酸氢钠
  10毫升HEPES
  10毫升抗生素
  配有无菌MilliQ水
2. 将其放入冰箱中的1升灭菌瓶中冷藏。如果仍然清洁/清洁，您可以使用4-5个月
DMEM 1x（1升）
1. 将所有组件加入无菌烧杯中的干净通风橱下（仅使用灭菌材料/设备）：
  10克DMEM 10x（罐子的所有粉末）
  4.7毫升碳酸氢钠
  10毫升HEPES
  1.5毫升抗生素
  3.5克D（+）葡萄糖
  500毫升无菌MilliQ水
2. 通过使用干净的磁铁均匀化直至粉末完全溶解，并用无菌MilliQ水完成。
3. 滤液（0.22μm，无菌）并将其储存在至少2个灭菌的500ml瓶中。如果介质保持清洁/清洁，我们会在打开瓶子后4个月内使用它们; 2瓶将有效8个月
4. 在实验当天，对于每个样品，在使用前准备1ml DMEM 1x并添加20μlB27,1μl抗生素和1μl荧光素（储备溶液0.1M）。将其保持在37°C的防光处。
  注意：我们通常准备1毫升额外。对于7个样品，在Falcon管中制备8ml
清洁解决方案
在5升自来水中加入25毫升ANIOSYME DD1

致谢

作者没有利益冲突申报。本研究的资金来源由Agence National de la Recherche（ANR-14-CE13-0002-01 ADDiCLOCK JCJC给JM和NLS Ph.D.研究员）和国家科学研究中心（JM）提供。 br /> 作者感谢Guillaume Vanotti先生对视频制作的帮助，Nadia Mazzaro博士和Maxime Sartori先生的意见和建议以及Hikmet Undemir先生的校对。
该方案改编自Yoo et al。（2004）和Yamazaki and Takahashi（2005）中公布的程序。

参考

生物发光记者。Promega 。（2018年1月9日访问）
Feeney，K.A.，Putker，M.，Brancaccio，M。和O'Neill，J。S.（2016）。深入鉴定萤火虫荧光素酶作为哺乳动物细胞中昼夜节律基因表达的报告基因。 J Biol Rhythms 31（6）：540-550。
Gould，S.J。和Subramani，S。（1988）。萤火虫荧光素酶作为分子和细胞生物学的工具。 Anal Biochem 175：5-13。
Takahashi，J。S.，Hong，H。K.，Ko，C.H。和McDearmon，E。L.（2008）。哺乳动物昼夜节律和疾病的遗传学：对生理和疾病的影响。 Nat Rev Genet 9（10）：764-775。
Yamazaki，S。和Takahashi，J。S.（2005）。哺乳动物昼夜节律基因表达的实时发光报告。方法Enzymol 393：288-301。
Yamazaki，S.，Numano，R.，Abe，M.，Hida，A.，Takahashi，R.，Ueda，M.，Block，GD，Sakaki，Y.，Menaker，M。和Tei，H。（2000 ）。重置转基因大鼠的中枢和外周昼夜节律振荡器。 Science 288（5466）：682-685。
Yoo，SH，Yamazaki，S.，Lowrey，PL，Shimomura，K.，Ko，CH，Buhr，ED，Siepka，SM，Hong，HK，Oh，WJ，Yoo，OJ，Menaker，M。和Takahashi，JS （2004年）。 PERIOD2 :: LUCIFERASE昼夜节律动态实时报告显示小鼠外周组织中持续的昼夜节律振荡。 / a> Proc Natl Acad Sci USA 101（15）：5339-5346。