材料和试剂

移液器吸头，10μl（Tarsons，目录号：523100）
移液器吸头，200μl（Tarsons，目录号：523101）
移液器吸头，1 ml（Tarsons，目录号：523104）
Nunc Maxisorp F96微量滴定板（Thermo Fisher Scientific，目录号：437111）
离心管50 ml（Tarsons，目录号：546041）
微量离心管（MCT）1.5 ml（Tarsons，目录号：500010）
PCR管0.2 ml（Tarsons，目录号：510051）
细菌菌株（ E.coli >）
ssDNA文库和引物（IDT定制合成）：
正向引物：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'
反向引物：5'-生物素-AATAGCCACCGTGTCCA-3'
图书馆：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA-45N-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'
LB肉汤（HiMedia Laboratories，目录号：M1245）
苯硼酸（HiMedia Laboratories，目录号：RM1599）
来自 Streptomyces avidinii >的链霉抗生物素蛋白 - 金（Sigma-Aldrich，目录号：53134）
Tris-HCl（HiMedia Laboratories，目录号：MB030）
甘氨酸（HiMedia Laboratories，目录号：MB013）
氯化镁（HiMedia Laboratories，目录号：MB040）
氯化钠（HiMedia Laboratories，目录号：MB023）
磷酸二氢钠（HiMedia Laboratories，目录号：GRM3963）
磷酸氢二钠（HiMedia Laboratories，目录号：MB024）
Tris base（HiMedia Laboratories，目录号：TC072）
碳酸钠（HiMedia Laboratories，目录号：GRM851）
碳酸氢钠（HiMedia Laboratories，目录号：TC230）
盐酸37％（默克，目录号：100317）
PCR mastermix（2x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：K0171）
PCR级DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D9170）
胰蛋白胨（HiMedia Laboratories，目录号：RM014）
酵母提取物粉末（HiMedia Laboratories，目录号：RM027）
LB增长媒体（见食谱）
碳酸盐缓冲液（见食谱）
Tris-HCl结合缓冲液（见食谱）
甘氨酸-HCl洗脱缓冲液（见食谱）
Tris中和解决方案（见食谱）
苯硼酸（PBA）涂料溶液（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（见食谱）

设备

移液器（Thermo Fisher Scientific，型号：Finnpipette TM F1可变容量单通道移液器）
Incubator-Shaker（Eppendorf，型号：Innova ® 44）
4°C冰箱（Vestfrost Solutions，型号：AKG 377）
-20°C冰柜（Vestfrost Solutions，型号：CFS 344）
pH计（Hanna Instruments，型号：pH 211）
分光光度计（GE Healthcare，型号：NanoVue Plus）
离心机（Eppendorf，型号：5430 R）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：C1000 Touch TM ）

程序

第0天

接种物的制备
1. 取冻干的 E。将大肠杆菌细胞重悬于1ml无菌LB肉汤中。
2. 将其在37℃孵育过夜，在孵育器振荡器中以180rpm持续摇动。
微量滴定板功能化
1. 取无菌微量滴定板，并在过滤无菌碳酸盐缓冲液（pH 9.2）中制备100μl2.5mMPBA。
2. 将其在4°C孵育过夜，使孔表面用PBA进行功能化。
Naïve适配体库制备
1. 将10μl100μMSsDNA文库加入190μl结合缓冲液中。
2. 将其在95°C孵育10分钟，立即转移到冰浴中，以防止单链DNA文库再次杂交。
  注意：如果用户未能将材料转移到冰浴中，可以通过重新加热DNA样品来重复步骤C2。如果使用冷却组件加热加热块，应避免使用冷却组件冷却样品。>
3. 将其转移至4°C冰箱，过夜孵育单链DNA寡核苷酸，以获得各自的3D构象。

第1天

细胞的生长和收获
1. 使用分光光度计在λ= 600nm处测量接种物的生长。光密度（O.D.）应≥1。
2. 取250μl接种物接种于25 ml无菌LB肉汤中。
  注意：使用1 O.D.的1％细胞作为接种物进行传代培养。>
3. 将其在37°C，180 rpm下孵育1.5小时，直至 E.大肠杆菌>细胞达到对数期（0.5-0.6 O.D.）。
  注意：对于不同的细胞，可以在SELEX轮次细胞采集之前测量生长曲线。＆nbsp; >
4. 将培养物在3,000 x g >下离心10分钟以形成软颗粒。
5. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（10mM，pH7.4）洗涤细胞三次以除去残留的培养基组分。
  注意：洗涤包括将沉淀重悬于PBS中，轻度涡旋并以3,000 x g沉淀10分钟。>
6. 测量O.D.使用λ= 600nm的分光光度计。光密度（O.D.）应≥1。
  注：1 O.D.大肠杆菌细胞对应于约1×10 5个> 8 > 细胞。可以在PBS中进一步稀释细胞。>
SELEX INITIAL ROUND：曝光和放映
1. 用碳酸盐缓冲液洗涤PBA包被的板两次，并在孔1中重悬100μl1×10 3个细胞。
2. 在25°C孵育1小时，使细胞覆盖在孔的表面。
3. 通过翻转平板倾析细胞悬浮液，并用200μl结合缓冲液洗涤孔三次，以除去未与孔表面结合的任何细胞。
4. 同时，从第0天开始在37°C孵育200μl制备的幼稚文库15分钟。＆nbsp;
5. 将200μl制备的文库轻轻加入涂有细胞的孔中。
6. 在37°C孵育1小时。
7. 通过翻转平板从微量滴定孔中倒出溶液。＆nbsp;
8. 用200μl结合缓冲液轻轻洗涤三次以分离松散结合的序列。
9. 向微量滴定孔中加入200μl洗脱缓冲液。
10. 在室温下孵育5分钟。
11. 小心地使用微量移液管从孔中取出溶液，不要接触孔壁，立即通过加入10μl中和缓冲液中和，使pH值达到~7。
12. 使用NanoVue分光光度计定量获得的序列并标记为第1轮。
  注意：为避免因分离造成任何细菌污染，可在定量前将DNA洗脱液以3,000 x g离心10 min并取上清液。>
13. 屏蔽池可在-20°C下储存直至进一步使用。
  注意：丢弃步骤B3，B7和B8中的内容。步骤B11中的内容将被保存并继续进行下一步。>

第2天

SELEX INITIAL ROUND：放大和分区

进一步扩增第1轮库以增加结合序列的浓度。在冰上进行以下步骤。
制备PCR反应混合物（50μl）;混合以下组件：
使用以下程序在预热至95°C的热循环仪上进行反应：
将PCR产物在95°C加热10分钟。＆nbsp;
立即将变性的PCR产物转移到冰上，加入5μl链霉抗生物素蛋白 - 金生物探针。
注意：如果用户未能将材料转移到冰浴中，可以通过重新加热DNA样品来重复DNA变性（参见第0天的步骤C2）。如果使用冷却组件加热加热块，应避免使用冷却组件冷却样品。>
将混合物在4℃孵育30分钟，使金纳米颗粒上的链霉抗生物素蛋白与反义链上的生物素相互作用。
将内容物转移至在4℃冷却的1.5ml MCT，并在4℃下以14,000 >离心30分钟离心30分钟以分离有义和反义适体库链。
收获含有ssDNA的上清液并丢弃沉淀。
注意：颗粒为红色，上清液应清澈。>
在NanoVue分光光度计上定量上清液以估计存在的ssDNA的量。
将扩增产物保存在-20°C直至进一步使用。

第2-4天

SELEX ITERATIVE ROUNDS：活页夹曝光

用结合缓冲液稀释来自第2天的扩增的ssDNA结合物级分至最终量的1×10 14个/μl分子/100μl（4.44μgssDNA/100μl结合缓冲液）。
加入两个细胞包被的微量滴定孔并在25℃下孵育微量滴定板1小时，类似于第一轮。
如前文所述，重复筛选，扩增和分区的步骤。
重复相同的步骤（上述步骤1-3）直到第6轮，每轮加倍细胞包被的孔数。（第5轮将使用16个孔进行。）量化每轮中获得的DNA并比较DNA浓度的增加。图2中显示了典型的SELEX进展。通过使用分光光度计在λ= 260nm处测量吸光度，通过测量在每轮筛选的ssDNA适体结合剂库的浓度，可以监测粘合剂部分的增加。

图2. SELEX进展。 A. DNA浓度每轮SELEX评估。 B.表显示通过Nanodrop测量评估DNA量的表。＆nbsp;

笔记

该协议已针对 E进行了优化。大肠杆菌>细胞可以进一步探索其他细胞。必须注意的是，生长介质，温度，持续时间和摇动条件应在实施前进行优化。根据作者的工作，目前的条件已经过优化。有关增长曲线分析的更详细的理解，用户可以参考Wang et al。>（2015）。
储存在4℃的存活培养物可用于在一周内包被孔。如果在SELEX过程中花费更多时间，则需要生成新的可行培养物。
PBA的pK a 是8.9，并且其与聚糖的结合是pH依赖性的。恶劣的环境条件可能会影响目标与PBA的结合。
为了防止细胞过度拥挤和堆积，相对于96孔板格式，已经针对每孔1×10 3个细胞进行了优化。足以覆盖井的所需细胞数可以通过可以覆盖圆柱形孔的内表面积的细胞数（表面积=4πr 2 ）来估算（内表面积=2πrh+πr） 2 ）。
已经发现天然适体文库和引物的随机区域的长度对于目标靶标是最佳的。用于扩增的正向引物可以用选择的荧光团标记。
所有缓冲液应在无菌过滤水中制备。
除非另有说明，否则所有离心步骤均在25℃下进行。
计算81个碱基长链的DNA序列数，平均分子量为26,730g / mol（MW av 单碱基为330）。通过使用乘法因子可以计算其他序列长度的相同值。
随着每一轮，朝向靶分子的结合物的数量增加。如果靶部分的数量没有增加，则由于缺乏可用的靶位点，DNA粘合剂群体会丢失。为避免这种情况，每个步骤后都会增加目标站点的数量。

食谱

LB增长媒体
10克胰蛋白胨
10克NaCl
5克酵母提取物
准备1升
在121.5°C，15 psi高压灭菌15分钟
接种前冷却至37°C
碳酸盐缓冲剂
5.7 mM NaHCO 3
4.3 mM Na 2 HCO 3
准备500毫升的体积，并将pH调节至9.8
Tris-HCl结合缓冲液
10 mM Tris-HCl
150 mM NaCl
5mM MgCl 2
准备500毫升的体积，并将pH调节至7.6
甘氨酸-HCl洗脱缓冲液
10 mM甘氨酸
2 mM HCl
准备100毫升的体积，并将pH调节至3.0
Tris中和解决方案
100 mM Tris碱
准备100毫升的体积，并将pH调节至11.0
PBA涂料解决方案
1毫克/毫升的碳酸盐缓冲液＆nbsp;
磷酸盐缓冲盐水
109.9mg Na 2 HPO 4
27.1mg NaH 2 PO 4
900毫克NaCl
准备100毫升的体积，并将pH调节至7.4

致谢

作者承认DST Nanomission项目（编号SR / NM / NS-1510/2014-G）用于财政资助，INST-PhD和CSIR-JRF用于奖学金。上述协议改编自作者的工作，Kaur 等。>（2017）。

利益争夺

作者没有利益冲突申报。

参考

Ellington，A。D.和Szostak，J。W.（1990）。体外>选择结合特定配体的RNA分子。自然> 346（6287）：818-822。
Kaur，H.，Shorie，M.，Sharma，M.，Ganguli，A.K。和Sabherwal，P。（2017）。桥接钢筋石墨烯功能化aptasensor致病性 E。大肠杆菌O78：K80：H11 >检测。 Biosens Bioelectron > 98：486-493。
Kim，Y.S。，Song，M。Y.，Jurng，J。和Kim，B.C。（2013）。使用细菌细胞分离和鉴定针对 Escherichia coli >的DNA适体 - 通过指数富集方法对配体进行系统进化。 Anal Biochem > 436（1）：22-28。
Priyanka，Shorie，M.，Bhalla，V.，Pathania，P。和Suri，C.R。（2014）。纳米生物探针介导的DNA适体用于爆炸物检测。 Chem Commun（Camb）< / em> 50（9）：1080-1082。＆nbsp;
Safeh，K.，Shangguan，D.，Xiong，X.，O'Donoghue，M。B. and Tan，W。（2010）。使用Cell-SELEX开发DNA适体。 Nat Protoc > 5：1169-1185。
Tuerk，C。和Gold，L。（1990）。指数富集配体的系统进化：噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA配体。 Science > 249（4968）：505-510。
Wang，L.，Fan，D.，Chen，W。和Terentjev，E。M.（2015）。聚对苯二甲酸乙二醇酯表面的细菌生长，分离和细胞大小控制。 Sci代表> 5：15159。