材料和试剂

菌株：菌株ClpP1-Strep已经在（Derrien等人，2012）中描述，并且可以从ChlamyStation培养物保藏中心获得（http://chlamystation.free.fr ）

StrepTrap HP 1ml（GE Healthcare，目录号：28-9075-46）

EDTA游离蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：05 056 489 001）

d-Desthiobiotin≥98％（IBA，目录号：2-1000-005）

1M Tris-HCl pH8.0，在4℃下

硫酸铵饱和溶液（> 4.5M;未溶解的盐将沉降到底部）

设备

Beckman离心机，转子（JA-10，JA-20，JA-12和Type 70ti）和聚碳酸酯离心管（Beckman Coulter）
半连续离心机（如 Firlabo）
FPLC装置（BioLogic DuoFlow，Bio-Rad Laboratories）
法语Press（Aminco）
旋转轮

程序

衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）细胞培养物
1. 在恒定照明（40μE/m）下在TAP培养基（可从Chlamydomonas资源中心获得的Recipe中获得5L的莱茵衣藻培养物（菌株）在25℃下，在具有空气鼓泡的5L搅拌的锥形烧瓶中。当培养物密度对应于晚指数期（细胞密度在6×10 6和10 7个细胞/ml之间）时收获细胞。从指数生长期（2至3×10 6个细胞/ml）的预培养物接种5L培养物。通过使用Malassez计数室的细胞计数来测量细胞密度。知道衣藻产生时间在指定条件下约8小时，您可以确定接种物的体积，以在所需的日期和时间获得所需的浓度。
收获单元
从此开始，在4°C下工作，所有溶液和玻璃器皿预冷却至4°C
1. 通过连续离心浓缩细胞培养物。在我们的Firlabo设备中，最终体积为1.5L。将该体积分配到三个500ml离心瓶中。
2. 在4℃下在Beckman JA-10转子中以5,000rpm离心5分钟
3. 将细胞重悬在最终体积为500ml的缓冲液A中
4. 在4℃下在Beckman JA-10转子中以5,000rpm离心5分钟
5. 使用10ml缓冲液A重悬细胞。在该阶段，溶液是致密的，具有深绿色。根据由Roche提供的建议加入蛋白酶抑制剂，和EDTA，终浓度为1mM。将最终体积调整为40 ml
制备可溶性细胞蛋白提取物
1. 细胞裂解：用40ml细胞悬浮液填充French Press的压力室。为了从压力室中排出空气，倾斜它以便允许气泡到达出口，打开龙头并推动活塞，直到所有的空气都已经排出。然后关闭水龙头，将压榨机置于压力（6,000 psi）下。通过缓慢打开压力盒的水龙头开始细胞裂解。收集流出物在冰上保持的50ml Falcon管。在此过程中，液体应缓慢流动，以避免突然的压力下降
2. 对细胞裂解液重复该程序一次。
3. 预清洗：将细胞裂解液转移到离心管（Beckman Thickwall Polycarbonate，50ml，29×104mm）中，并在Beckman JA-20转子中在4℃下以20,000rpm离心30分钟。收集上清液。
4. 超速离心：用缓冲液A调节至终体积为50ml。加入MgCl 2至终浓度为6mM（需要5mM的最小MgCl 2浓度为5mM）允许堆积类囊体膜，需要它们完全去除）。在两个超速离心管（Beckman加盖管，聚碳酸酯，26.3ml，25×89mm）中分配50ml。在Beckman转子70ti型中，在4℃下以60,000rpm离心60分钟
5. 用装有足够长的针头的注射器小心地收集上清液（橙黄色）以达到管的底部。然后将其转移到100毫升的量筒中
通过硫酸铵沉淀分级分离可溶性蛋白级分注意：这部分协议是专门针对莱茵衣藻ClpP复杂，如果你想适应协议到另一个物种，你必须确定硫酸铵浓度范围，你感兴趣的蛋白质复合物沉淀。 >
1. 测量上清液体积，加入1/3体积的饱和硫酸铵溶液，最终达到25％饱和度。为了避免不均匀沉淀，重要的是逐渐进行并在恒定和温和的转向（将磁力搅拌棒放置在圆筒底部）。然后让溶液在4℃平衡15分钟，并转移到50ml Falcon管。
2. 在4℃下在Beckman JA-12转子中以5,000rpm离心10分钟
3. 小心地将上清液倒入量筒（100ml）中。测量其体积，加入1/4体积的饱和硫酸铵溶液以达到最终的45％饱和度，采取与上述相同的预防措施。让溶液在4℃平衡15分钟，并将其转移到两个50ml Falcon管。
4. 在4℃下在Beckman JA-12转子中以5,000rpm离心10分钟。小心地倒出上清液（沉淀物是软的）。然后使用注射器和针头，清除所有剩余的上清液。
5. 加入4毫升缓冲液B的每个丸和封盖。将管置于4℃的旋转轮上，使丸粒溶解（20-30rpm下20-30分钟）。将两种蛋白质溶液混合到15ml试管中，如果需要，用缓冲液B调节体积至10ml，通过颠倒管子轻轻混合。
在StrepTrap柱上进行亲和层析该步骤可以使用FPLC装置，蠕动泵或甚至用注射器手动进行。
1. 在缓冲液B（10柱体积，1ml/min）中平衡该柱
2. 在此期间，在4℃下在Beckman JA-20转子中以5,000rpm离心蛋白质提取物5分钟，以除去可能阻塞柱的可能不溶性颗粒。
3. 结合：将蛋白质提取物装载在柱上（0.5ml/min;如果柱手动操作，这对应于每秒1滴的流动）
4. 用缓冲液B（10柱体积，1ml/min）洗柱
5. 用缓冲液E洗脱（10柱体积，1ml/min，分级：1ml）。以1ml的级分收集。部分2对应于ClpP浓度的峰，但可以合并部分2至5以产生高纯度ClpP复合物（用于质量控制，参见Derrien等人（2012）中的图1，显示样品在纯化过程的每个步骤）。
浓缩和储存。
1. 一旦浓缩，纯化的ClpP复合物可以在-80℃下储存数月。首先，用1ml缓冲液B平衡Centricon离心过滤单元（100kDa截留）。然后，将洗脱级分2至5洗脱并将体积减少至约500μl，加入500μl缓冲液B，并通过吸移将溶液均化轻轻地（避免气泡形成）。如果需要除去Desthiobiotine，重复该步骤几次以稀释化合物。最后，浓缩溶液至200μl至300μl的体积。浓度应约为500μg/ml。（对于质量控制，检查Derrien等人（2012）中的图3，显示考马斯染色和纯化的ClpP复合物的银染SDS-PAGE）。

食谱

缓冲区A
20mM Tris-HCl pH8.0，4℃ 150mM NaCl 1 mM DTT
缓冲区B
20mM Tris-HCl pH8.0，4℃ 150mM NaCl 10％甘油 1 mM DTT
洗脱缓冲液
20mM Tris-HCl pH8.0，4℃ 150mM NaCl 10％甘油 2.5 mM Desthiobiotine
2.5 mM Desthiobiotine
< i>注意：重要的是将Tris HCl 1M储液的pH调节到4℃。 Tris缓冲液的pH随着温度降低而增加（20度下降对应于0.5至0.6个pH单位的增加）

致谢

该协议改编自并且以前在Derrien等人（2012）中使用。

参考文献

Derrien，B.，Majeran，W.，Effantin，G.，Ebenezer，J.，Friso，G.，van Wijk，K.J.，Steven，A.C.，Maurizi，M.R.and Vallon，净化莱茵衣藻叶绿体ClpP复合物：额外的亚基和结构功能。 Plant Mol Biol 80（2）：189-202