材料和试剂

一次性移液器（VWR，目录号：16001-180）
Parafilm（VWR，目录号：52858-000）
60毫米和100毫米培养皿（VWR，目录号：25373-085和25373-100）
滤纸（VWR，目录号：28460-030）
画笔
气体分散管（Ace Glass，目录号：9435-10）
老鼠
1. 成年C57BL / 6（WT）小鼠
2. 成年钙蛋白酶-1 KO小鼠
3. 成年钙蛋白酶-1 PHLPP1双KO（DKO）小鼠
异氟醚
氯化钠
氯化钾
CaCl 2
硫酸镁<子> 4
d葡萄糖
的NaHCO <子> 3
KH <子> 2 PO <子> 4
人工脑脊液（aCSF）（见食谱）
切割解决方案（见食谱）

设备

寒冷的解剖工具
1. 角形尖端解剖器剪刀（Fine Science Tools，目录号：14082-09）
2. 剪刀（精细科学工具，目录号：91401-14）
3. 弯嘴钳（精细科学工具，目录号：11051-10）
4. 手术刀片
5. 勺
6. 解剖刮刀
脑切片管理器（AutoMate Scientific，目录号：BSK4）
烧杯
冰盒＆nbsp;
McIlwain Tissue Chopper（Mickle Laboratory Engineering，Brinkmann）
水浴
95％O 2 / 5％CO 2 空气罐
-80°C冰柜

程序

准备1升人工脑脊液（aCSF）（见食谱1）。＆nbsp;
将500毫升新鲜制备的aCSF倒入脑切片容器中。将脑切片容器放入37°C水浴中。将脑切片容器连接到95％O 2 / 5％CO 2 空气罐并给aCSF充氧。气流压力设定在约2磅/平方英寸。
将100毫升切割溶液倒入150毫升烧杯中。用封口膜覆盖烧杯，并将其置于-80℃冰箱中5-10分钟，直至溶液具有泥浆稠度。
将冰冷的切割溶液放在大冰盘上。用连接到95％O 2 / 5％CO 2 空气罐的气体分散管鼓泡溶液5分钟。
将60毫米培养皿的盖子放在冰上。将圆形滤纸放在盖子上，用切割溶液润湿滤纸。这是大脑解剖阶段。
冷冻解剖工具包括角形尖端解剖剪刀，大剪刀，弯曲尖镊子，手术刀片，勺子，尖端切除的一次性移液器和冰上的两个解剖刮刀。整个解剖设置如图1所示。

图1.解剖急性小脑切片准备工作。将一个带有切割液，解剖阶段和解剖工具的烧杯放在一个大冰盘上。
用异氟醚麻醉动物并用适当的工具（例如，剪刀）斩首。立即用解剖工具提取整个大脑，并将其放入冰冷的切割溶液中。此步骤应在1分钟内完成。
用冰冷的切割溶液冷却大脑1分钟。
将大脑置于冷解剖阶段。首先，切断前脑，中脑和髓质。然后，切断脑桥以隔离小脑（图2）。

图2.从小鼠全脑中分离小脑的步骤。切断前脑，中脑和髓质，然后切除小脑下的脑桥。顶部，鼠脑的轴视图。底部，小脑和脑桥的冠状视图。数字和虚线表示切口的步骤和位置。
立即将小脑转移到McIlwain Tissue Chopper的舞台上。排出组织周围的额外溶液。将小脑切成200-400μm厚的矢状切片（图3）。

图3. McIlwain Tissue Chopper （Mickle Laboratory Engineering，Brinkmann）
将小脑移至含有冰冷切割溶液的100毫米培养皿中，小心地将每个切片分开，不要使用两个小刷子损坏它们。
使用一次性移液管将切片转移到脑切片容器中的温热aCSF中，切割尖端。
将切片在37℃下在aCSF中孵育1-2小时，其中95％O 2 / 5％CO 2 鼓泡。切片现在可用于电生理学或切片治疗。

数据分析

我们按照我们在此描述的方案制备了3个月大的小鼠的急性小脑切片，并记录了在各种刺激强度下通过电刺激平行纤维在Purkinje细胞体层中引发的兴奋性突触后电位（EPSP）（Wang et al。，2016）。这种刺激引发典型的P1-N1-P2-N2波形（Barnes et al。，2011），其中N1对应于突触前纤维截击，N2对应于突触后群体的峰值（图4）。由刺激强度低于120mA引起的响应太不可靠而无法分析，并且仅通过计算N2与N1的比率来分析由120mA以上的刺激强度引起的响应，这反映了突触传递的效率。在所有强度下，与WT小鼠相比，钙蛋白酶-1KO小鼠中的N2 / N1比率更小，并且两种基因型之间的总体差异是统计学显着的（图4）。在所有刺激强度下，来自钙蛋白酶-1和PHLPP1双KO（DKO）小鼠的小脑切片中记录的EPSP的N2 / N1比率介于WT和钙蛋白酶-1KO小鼠之间，表明突触传递至少是在DKO小鼠的小脑中部分恢复（图4）。

图4. Purkinje细胞EPSP的平行纤维在成年钙蛋白-1 KO小鼠中减少，在成年钙蛋白-1和PHLPP1双KO（DKO）小鼠中部分恢复。急性小脑切片制备为在程序中描述，并且通过在浦肯野细胞层中记录的平行纤维刺激诱发野外EPSP。结果计算为N 2与N 1的比率，并且表示来自3至5只小鼠的10至11个切片的平均值±SEM。 * P ＆lt;与WT相比，0.001（单变量ANOVA，然后是Bonferroni检验）; ＃ P ＆lt;与WT相比，0.001（单变量ANOVA，然后是Bonferroni检验）; § P ＆lt; 0.001，与DKO（单变量ANOVA，然后是Bonferroni检验）相比（来自Wang et al。，2016）。

食谱

人工脑脊液（aCSF）
110 mM NaCl
5 mM KCl
2.5 mM CaCl 2
1.5mM MgSO 4
1.24mM KH 2 PO 4
10 mM D-葡萄糖
27.4mM NaHCO 3，
切割解决方案
124 mM NaCl
26 mM NaHCO 3
10 mM葡萄糖
3 mM KCl
1.25mM KH 2 PO 4
5mM MgSO 4
3.4 mM CaCl 2
切割液可以在4°C下储存1周

致谢

这项工作得到NINDS的授权P01NS045260-01（PI：Dr.C.M.Gall）的支持，并授予NINDS的R01NS057128至MB。

利益争夺

没有利益上的冲突。

伦理

所有实验中的动物使用均遵循NIH指南，并且所有方案均获得了批准西部健康科学大学机构动物护理和使用委员会。

参考

Barnes，J.A.，Ebner，B.A.，Duvick，L.A.，Gao，W.，Chen，G.，Orr，H.T。和Ebner，T.J。（2011）。攀爬纤维异常 - 浦肯野细胞电路导致 ATXN1神经功能障碍[82Q] 小鼠。 J Neurosci 31（36）：12778-12789。
Edwards，F.A.，Konnerth，A.，Sakmann，B。和Takahashi，T。（1989）。用于哺乳动物中枢神经系统神经元的膜片钳记录的薄片制备。 Pflugers Arch 414（5）：600-612。
Kano，M。和Konnerth，A。（1992）。用于膜片钳记录的小脑切片。在：Kettenmann，H。和Grantyn，R。（编辑）。实用电生理学方法。 pp：54-57。
Llano，I.，Dreessen，J.，Kano，M。和Konnerth，A。（1991a）。小脑浦肯野细胞谷氨酸诱导钙的Intradendritic释放。 Neuron 7（4）：577-583。
Llano，I.，Marty，A.，Armstrong，C。M. and Konnerth，A。（1991b）。突触和激动剂诱导的大鼠小脑切片中浦肯野细胞的兴奋性电流。 J Physiol 434：183-213。
Wang，Y.，Hersheson，J.，Lopez，D.，Hammer，M.，Liu，Y.，Lee，KH，Pinto，V.，Seinfeld，J.，Wiethoff，S.，Sun，J.，Amouri ，R.，Hentati，F.，Baudry，N.，Tran，J.，Singleton，AB，Coutelier，M.，Brice，A.，Stevanin，G.，Durr，A.，Bi，X.，Houlden， H.和Baudry，M。（2016年）。 CAPN1 基因缺陷导致小脑发育和小脑性共济失调的改变在小鼠和人类中。 Cell Rep 16（1）：79-91。