材料和试剂

注意：用于代谢组学的所有化学品和溶剂均为质谱级（Sigma-Aldrich，Germany）。其他溶剂属于分析级。

提示
Millipore miracloth，孔径22-25μm（VWR，目录号：475855-1）
培养皿（盖子）Nunclon TM Delta，8.8 cm 2 （Thermo Fisher Scientific，目录号：150318）
15 ml Falcon TM 锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：10468502）
50 ml Falcon TM 锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：10788561）
50 ml注射器，无针头（Thermo Fisher Scientific，目录号：11901563）
5毫升锥形制备管（Starlab，目录号：E1450-1100）
2 ml微量离心管（Starlab，目录号：I1420-2600）
30 ml Sterilin TM 通用容器（Thermo Fisher Scientific，目录号：11309143）
铝箔
过滤纸
0.2μm一次性Merck滤芯（Thermo Fisher Scientific，目录号：10740365）＆nbsp;
1.5 ml玻璃螺口瓶，带螺帽和微型插件（VWR，目录号：548-0018，-0020，-0106）
Levington M3干堆肥（Spunhill，目录号：YEV05K）＆nbsp;
非染色硅砂（Sweepfast，目录号：CH52）＆nbsp;
拟南芥种子
玉米种子（ Zea mays ）
乙腈（Hypergrade，Sigma-Aldrich，目录号：1000291000）
甲醇（Hypergrade，Sigma-Aldrich，目录号：1060351000）
甲酸（FA，Sigma-Aldrich，目录号：F0507-500ML）
液氮（BOC）
Bleach Mexcel（5-10％）（SLS，目录号：CLE0300）
盐酸（37％）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
甲酸钠（0.01 M NaOH / 1％FA（1/1，v / v）用乙腈/水（80/20，v / v）稀释10倍（Sigma-Aldrich，目录号：71539-500G）
亮氨酸脑啡肽（2 ppm在乙腈/水（50/50，v / v）中含0.1％甲酸）（Sigma-Aldrich，目录号：L9133-25MG）
冰冷萃取溶液MeOH 50％+ FA 0.05％（见食谱）

设备

移液器（P-5000，P-1000）（Starlab）
生长管（使这些定制，见下文）
压力盖（使这些定制，见下文）
Speedvac真空浓缩器（赛默飞世尔科技，目录号：SPD120）
冷冻干燥机（Modulyo台式冷冻干燥机）（爱德华兹，产品目录号：D-230）＆nbsp;
用于UPLC（2.1 x 50 mm，1.7μm，Waters）的BEH C18色谱柱，带保护柱（VanGuard，2.1 x 5 mm，1.7μm，Waters）＆nbsp;
SYNAPT G2si Q-TOF（沃特世）
离心机（适合5毫升管）
微量
超声波清洗浴
烙铁
钻（7毫米多用途钻头）
生长柜（Fitotron，SANYO）
镊子
4°C冰箱
-80°C冰柜

注意：此设备是针对拟南芥进行描述的，但对于较大的植物，例如玉米，需要调整设备的使用。

软件

MassLynx，带有数据桥的4.1版， https://www.waters.com
R使用XCMS软件包，版本3.2， https://www.r-project.org
多个实验查看器-MeV，版本4.9.0， http://mev.tm4.org/#/welcome
MetaboAnalyst 3.0版， http://www.metaboanalyst.ca
METLIN， https://metlin.scripps.edu

程序

设备准备
1. 用于植物发育和随后化学取样的生长管（图2A）。
  为了制造生长管，在通风橱中使用预热的烙铁来熔化30毫升塑料管底座中的7毫米孔。需要重复该步骤，因为需要许多管。生长管可以用纯蒸馏水彻底洗涤并重复使用几次。在底部安装具有40 mm 2 miracloth的管以保持土壤。用所需的土壤基质（~40 ml）填充管，例如9：1（v / v）砂和干燥堆肥的混合物（有关详细信息，请参阅材料和试剂）。
  注意：对于较大的植物物种，如4周大的玉米幼苗，在粘土农业土壤中生长，50毫升猎鹰适合具有相似大小的孔（图2C）。
2. 加压盖（适用于较大的Falcons）帮助推动液体通过生长管（如果需要，图2D）。
  通过钻一个小于注射器直径的孔来形成这些盖子，并强制注射器穿过，用坚固且防水的环氧树脂固定。将硅施加到盖子的边缘和螺纹将确保紧密密封以允许足够的压力。对于保留更多水分的土壤，可能需要这种设置，以缩短用提取溶液冲洗土壤的时间。
  注意：可以使用相同的实验装置进行同时测定。例如，可以在施用提取溶液之前对非破坏性根际土壤或大块土壤进行取样，以进行元素分析，或DNA / RNA提取，以确定微生物群落组成和土壤功能分析。
生长系统的实验装置（拟南芥;图2A和2B）
1. 在4℃高压灭菌的水中，在黑暗中将拟南芥种子分层2天。
  注意：如果适合实验设计，可以对种子进行表面消毒。这些技术是有效和直接的（Lindsey等，2017）。
2. 将土壤填充的生长管包裹在锡箔中以限制藻类生长并在各个培养皿中放置生长管以防止生物重复之间的交叉污染。＆nbsp;
3. 用胶带将管密封到培养皿上以提供稳定性。托管在托盘中。
4. 在个别培养皿中加入15毫升水，使土壤饱和。
图2.采集根际化学物质的实验装置。 A-C。照片显示收集管含有无植物和植物的土壤（1. 拟南芥和2.玉米）。用箔覆盖管以防止藻类生长，并将其置于小的培养皿上以防止交叉污染。 D.连接到环氧树脂固定注射器的加压盖的示例。这允许在样品收集期间施加压力，以增加样品收集的速度和产量（这个词被多元化），同时最小化活细胞暴露于潜在破坏性有机溶剂。当使用较大的植物如玉米时，在施加压力之前用剪刀轻轻地去除枝条。
1. 将四粒种子吸移到各个管的土壤表面上。如果需要，准备未播种的仅土壤样品作为对照。＆nbsp;
2. 用盖子盖住托盘并放入具有适当生长条件的生长箱中。＆nbsp;
3. 培养皿应每两周提供5-10毫升水。
4. 幼苗出苗后，用镊子仔细地将幼苗留在每盆一苗。
注意：在短日照生长条件下（8.5：15.5光照：黑暗; 20°C光照，18°C黑暗; 65-70％相对湿度）最后浇水，在代谢物提取之前，应不迟于3天。
生长系统的实验装置（玉米;图2C）
1. 将种子在高压灭菌的无菌水中浸泡过夜，然后在含有无菌湿滤纸的培养皿中于23℃在黑暗中放置两天。＆nbsp;
2. 植物发芽种子在土壤填充的生长管中，离土壤表面1.5厘米。
3. 将生长管包裹在铝箔中，用黑色塑料珠覆盖表面以限制藻类生长。
4. 将管置于具有所需环境条件的生长室中。
注意：土壤可以根据实验设计进行调整，但更多有机质的土壤可能更难以解释结果。此外，根据所使用的土壤，25％的珍珠岩将在采集缓冲液的过程中帮助排水（见下文）。对于此处演示的示例，使用了堆肥，但也可以使用农业土壤（更多细节见Pétriacq et al。，2017）。
从对照和拟南芥 /玉米土壤中提取代谢物（图3）
1. 从含有一个5周龄拟南芥植物或一个17日龄玉米植物的管中收集植物土壤样品（时间可能取决于实验设计）。
  注意：本协议中使用的时序假设与上述类似的增长条件。
2. 对于拟南芥，在幼苗完整的情况下，将冰冷的提取液（5 ml）涂抹在管的顶部，避免对土壤表面造成任何干扰。
  注意：对于较大的植物，您可能想要切割或同时采样幼苗。如果这样做，请小心避免污染植物材料受损的萃取溶液。此外，当使用较大的植物如玉米时，可以在施加压力之前用剪刀轻轻地去除枝条。
3. 1分钟后，可从5ml离心管中的排水孔收集4-4.5ml。
4. 为了与玉米一起使用，用约0.5cm土壤表面的刀片轻轻切开幼苗，然后将15ml提取溶液施加到土壤中并使用含有注射器的改进的盖子向罐顶部施加压力。
5. 1分钟后，在离心管中收集5-10ml。＆nbsp;
6. 离心沉淀土壤残留物（5分钟，3,500 x g ），将4ml上清液等分到新的离心管中。
7. 在液氮中快速冷冻并冷冻干燥直至完全干燥。
注意：
1. 样品现在可以储存在-80°C直到化学分析。
2. 如果土壤未饱和，则可以收集较少的流量。缓冲液与植物接触的时间越长，组织损伤和通过细胞代谢物产生偏倚的可能性就越大。限制样品暴露于MeOH的时间少于1分钟，以防止根部受损的风险。与无菌蒸馏水取样无关。
图3.采样工作流程。参见图注释。
为UPLC-qTOF分析准备样品
1. 将干燥的等分试样重悬于100μl甲醇：水：甲酸（50：49.9：0.1，v / v）中。
2. 在4℃下超声处理20分钟，涡旋并离心（15分钟，14,000 x g ，4℃）以除去可能阻塞UPLC柱的潜在颗粒。或者，通过从分析供应商处获得的0.2μm一次性滤芯过滤样品。
3. 在通过UPLC系统注射之前，将最终上清液（80μl）转移到装有玻璃插入物的玻璃瓶中。＆nbsp;
4. 在此过程中，通过将5μl每种样品混合到一个单独的小瓶中来生成质量控制（QC）样品。这将作为LCMS系统的分析可靠性的控制，并且在运行大量样品时MS强度漂移的情况下可选择标准化数据（Broadhurst et al。，2018）。
UPLC-qTOF设置
1. LC和MS特征在Pétriacq等人（2017）中有详细说明。使用SYNAPT G2si HDMS Q-TOF质谱仪（Waters），偶联UPLC BEH C18色谱柱（2.1 x 50 mm，1.7μm，Waters），带保护柱（VanGuard，2.1 x 5 mm，1.7μm，Waters）以400μlmin -1 的流速分离化合物，将流动相制备为A;含0.05％甲酸的水和B;具有0.05％甲酸的乙腈，具有以下梯度：0-3分钟5-35％B，3-6分钟35-100％B，在100％B下保持2分钟，8-10分钟，100-5％B ＆NBSP;
2. 将色谱柱温度设置为45°C，使用10μl的进样体积。
3. 使用质量范围50-1,200 Da，扫描时间0.2 s（ESI - 和ESI + ），仪器在灵敏度模式下进行MS全扫描（即，没有碰撞能量）。＆nbsp;
4. 使用适当的电压条件，在ESI - 模式下，转移电池中的碰撞能量从5到45 eV（MS E ）（例如，毛细管），-3 kV;采样锥，-25 V;萃取锥，4.5 V）和ESI + 模式（例如，毛细管，+ 3 kV;采样锥，+ 25 V;萃取锥，10 V）。＆nbsp;
5. 每种模式的源温度应为120°C，350°C时的去溶剂化温度，800 L h -1 的去溶剂化气流和60 L h时的锥形气流 -1 。
校准qTOF质谱仪
1. 在分析之前，用甲酸钠溶液校准Q-TOF检测器。＆nbsp;
2. 在每次运行期间，通过输入亮氨酸脑啡肽作为内部参考（即，锁定质量），扫描频率为10 s，锥电压为40 V，毛细管电压为3 kV，可以确保准确的质量测量。
3. 在分析运行开始时注入6个QC样品，然后每10次注射，并在分析运行结束时用QC样品完成。
4. 在每次处理之间和ESI - 和ESI + 电离模式之间注入空白样品（50％甲醇，v / v）以稳定电喷雾电离源。
处理MS数据用于统计分析（参见图4，用于随后的分析步骤的示意图）和解构根茎化学物质
1. 运行完成后，使用MassLynx中的Databridge函数或ProteoWizard（MsConvert）将原始文件（此处从MassLynx获取）转换为CDF或mwXML格式。
2. 对于代谢峰的后续比对和整合，使用安装了XCMS软件包的R（Smith et al。，2006）和补充数据S1 。＆nbsp;
3. 当存在于所有生物重复中时（n = 3，在存在3个生物重复的实例中），阈值强度为10（I = 10）且最大分辨率范围为20ppm时，可以保留峰用于分析。应根据研究中使用的质谱仪（此处为q-TOF）调整XCMS参数，并调查所研究的特定数据集的细微差别。
4. 将每次运行的峰值归一化为总离子电流（TIC）。对于每个样品，归一化峰值将为ESI + 和ESI - 电离模式生成单独的数据集。
图4.用于鉴定根际代谢物的分析工作流程。使用XCMS（Smith et al。，2006）处理质谱数据以进行峰识别（RT- m / z 特征）和对齐，分组和保留时间（RT）校正，然后检查质量控制和标准化（中位数，立方根变换和Pareto缩放）。代谢组学概述由主成分分析（PCA）给出，这对于验证来自含植物和无植物管的提取物之间的足够代谢组学分离是至关重要的。如果PCA无法证明全球差异，含有植物的土壤中的根际化学可能被大量土壤化学过度稀释，并且需要进一步调整收集系统（例如，更大的植物，其他土壤，不同的提取溶液和更长的样品提取）。在二元比较的特定情况下（无植物与含植物的管），生物标志物检测可以用从（正交）偏最小二乘 - 判别分析（O）PLS-DA（Worley and Powers，2013）获得的S Plot进行。。该监督技术为投影（VIP）分数提供变量重要性，其反映了PLS判别模型的每个变量的判别统计功效。最终，通过火山图进行的单变量统计比较（倍数变化与统计显着性）允许直接识别对根际特异的代谢标记（即，根茎化学物质）。
MS数据的统计分析
对于这个实验装置，识别“根际”化学特征的强度来自实验设计，即，自由土壤与种植土壤的组合，以及随后通过以下方式获得的二元统计比较火山图显示出具有生物学意义的统计学意义。进一步的统计测试（例如，ANOVA， t - 考虑多重比较的测试，例如错误发现率-FDR或Bonferroni校正，如果适用）可用于受治疗影响的标志物的量化和注释。这些管道取决于实验初始结构中使用的条件和问题。
＆NBSP;在分析之前，需要进行适当的标准化。数据集的中位数归一化，立方根变换和Pareto缩放似乎在代谢组学数据集上表现最佳（van den Berg et al。，2006）：数据集的原始结构在保留的同时受到影响与具有低强度的峰相比，具有高强度的峰的软化。
1. 治疗/点组合之间代谢信号的全局差异可以分别显示阴离子（ESI - ）和阳离子（ESI + ），或联合两个数据集连接在一起，主成分分析（PCA），在线使用MetaboAnalyst（v.3.0; http://www.metaboanalyst.ca ） ;（Xia et al。，2015）关于中值归一化，立方根变换和Pareto缩放数据。
2. 为了量化二元处理之间存在数量差异的离子数量（特别是无植物土壤和含植物土壤之间的比较），可以在中值归一化，Pareto-scale和立方根变换数据上创建火山图，截止值> 2倍变化（Log ₂> 1）和统计上显着的阈值 P <1。 0.05（Welch的 t -test; MetaboAnalyst）。然后可以选择这些标记用于识别。当“根际”化学物质的条件针对相应的土壤进行筛选时，火山图可以解构对根际化学信息素特异的标记。当土壤化学成为目标时，可以进行常规热图或聚类分析，并进一步保留相关标记用于后续分析（例如通过Pearson相关性进行随后的分子聚类的方差分析（Williams et al。，2018））。强烈建议您遵守代谢组学标准计划制定的指南（Fiehn et al。，2008; Goodacre et al。，2007; Sumner 等人，2007）。
假定代谢标志物的注释
基于精确检测的 m / z 值，可以分配所选离子标记的推定注释，质量精度<1。 30 ppm），使用METLIN化学数据库（Smith et al。，2005），或在线或内部提供的其他化学/代谢物数据库。然后可以使用PubChem检查预测的途径或类别注释（ https://pubchem.ncbi.nlm。 nih.gov/ ）。

笔记

当将这种方法应用于土壤体积较大的较大物种时，重要的是要注意土壤的含水量会稀释提取溶液，这在提取溶液的设计和冲洗量时需要考虑到 - 通过从样本中收集。
＆NBSP;此外，此处建议的提取溶液（50％MeOH）限制了样品的组织损伤，但是该溶液的实际设计可以根据感兴趣的化学特征进行调整。值得注意的是，较低和较高浓度的甲醇都是合适的。因此，可能优选其他提取缓冲液（例如水，70％MeOH，10％MeOH 等）。强烈建议无论如何都要执行方法优化，尤其是在应用与所讨论的那些不同的提取解决方案的情况下。

食谱

提取解决方案
50％甲醇（升级）：49.95％超纯水：0.05％甲酸
注意：
1. 使用清洁设备将此解决方案生成所需的体积。存放在冰箱中的保质期不到一周。
2. 萃取溶液可含有不同含量的MeOH，具体取决于收集所需的化学类型。

致谢

我们要感谢Anne Cotton和Roland Schwarzenbacher收集图像以说明收集系统。 JT承认欧洲研究理事会（ERC;第309944号“Prime-A-Plant”）的巩固者资助，Leverhulme信托研究领导奖（编号RL-2012-042）和BBSRC-IPA资助（BB / P006698 / 1）。 PP感谢MetaboHUB（ANR-11-INBS-0010）项目，波尔多大学和P3研究所的财务支持。

利益争夺

作者声明，研究是在没有任何可被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

参考

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