材料和试剂

无菌200μl移液管尖端（Fisher Scientific，Fisherbrand Redi尖端1-200μl移液管尖端，目录号：02-681-147）
丁腈手套（vwr，vwr无粉丁腈检验手套，目录号：82026）
50毫升Falcon离心管（Fisher Scientific，目录号：14-432-22）
普通显微镜载玻片（登维尔科学公司，登维尔超普通显微镜载玻片，目录号：M1001）
显微镜玻片盖玻片（登维尔科学公司，登维尔超显微镜盖玻片，目录号：M1100-02）
青春期后和性成熟（&gt；42天）雌性小鼠（任何品系）
无菌10x PBS（Fisher Scientific，Lonza Biowittaker磷酸盐缓冲盐水（10x），目录号：11669980）
去离子H2O（Milliporesigma Synergy超纯水净化系统，制造商编号：Synshofus）

设备

具有4倍和10倍放大镜的复合双目显微镜（Olympus CX43生物显微镜）
20-200μL移液管（Gilson，移液管P200L，20-200μL容量，目录号：FA10005M）
管架（Fisherbrand 4路管架，目录号：03-448）

软件

Microsoft Excel
python（http://www.python.org/“target=”\u blank“>www.python.org）
originpro（或类似的统计软件）

注意：用于提高鼠标动情周期图可视化速度的python函数的文件可在https://github.com/christianlabiuc/estrousscycle.实现和下面介绍如何使用这些文件。

程序

注：这些程序应在每天的同一时间执行。例如，我们的实验室将这些程序乘以zeitgeber time（zt）1-5，相对于zt 12时的关灯。

小鼠阴道涂片标本的采集与分类
1. 在50毫升Falcon试管中，将10倍PBS稀释至1倍PBS溶液，方法是向45毫升蒸馏水中加入5毫升10倍PBS，并轻轻摇匀。将试管放入试管架中，并为样品准备一个干净的玻片。
2. 使用20-200μl移液管，将20μl 1x PBS吸入200μl移液管尖端。
3. 把老鼠从笼子里拿出来，放在笼子顶上，同时轻轻地抓住尾巴以防被束缚。让鼠标抓住笼子盖的顶部。调整鼠标的方向，使其后部可见。
4. 用非支配性的手，用拇指和食指轻轻握住鼠标尾部，轻轻向上拉，使后脚离开笼子顶部。用指环和小指轻轻地推动鼠标后半身，使臀部向上倾斜，这样就可以方便地观察和接触阴道（图1）。
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  图1。样本采集的鼠标方向
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5. 用占优势的手，拿起吸管。将移液管尖端插入小鼠阴道约0.2 cm深，确保不要将尖端插入太远，以免造成内伤或压力（图2）。
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  图2。将移液管尖端轻轻插入阴道 < BR>
6. 用吸管吸进和吸出溶液1-3次，并尽可能多地吸出液体用于涂片样品。
7. 将鼠标放回其主框架中。
8. 轻轻地将涂片样本排出到载玻片上，形成一个垂直的椭圆形状（图3）。
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  图3。将涂片样本提取到显微镜载玻片上。注意，可以在同一载玻片上放置多个涂片。
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9. 对随后的小鼠重复此步骤，直到幻灯片上没有留有样本的空间（通常为每张幻灯片5到8个样本）。
10. 为了评估样品，将玻片放在复合双目显微镜的台上。确定每个样本的阶段，并将信息记录在实验室笔记本上。
11. 一旦在玻片上收集到阴道涂片，就必须根据每个涂片中存在的细胞类型对其进行分析和分类。共有四个典型周期阶段：发情前期（有核上皮细胞）、发情期（角化上皮细胞）、发情期（角化上皮细胞和白细胞约占50%）和发情期（高密度白细胞）。只有少数细胞获得，所有细胞都是白细胞的一个阶段，特别是在间期延长时。为了描述这些涂片的特征并将数据输入分析程序，将这些涂片命名为“少量”。分析程序中只能输入一个阶段；如果涂片显示有多个细胞类型（e.g.，有核上皮细胞和角质上皮细胞），则记录大多数细胞类型所代表的阶段（图4）。
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  图4。图示每个周期阶段细胞学的典型涂片。在“发情前期”示例中的白色箭头表示有核上皮细胞。“发情”例子中的红色圆圈表示角化上皮细胞。“少数”示例中的红色箭头表示白细胞。放大10倍获得的图像。比例尺=100μm。
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python代码在数据可视化与分析中的应用
1. 生成包含以下列的Excel文件：
  1. 鼠标ID：每个鼠标的唯一标识符。
  2. 周期日期：进行发情周期监测的日期。
  3. 发情周期：发情周期阶段。该函数只取P、E、M、D和少量作为有效的动情周期阶段数据项。前四项分别代表发情前期、发情期、发情中期和发情中期。各阶段的完整描述和可视化见注7。“少数”被描述为间期后的阶段，此时白细胞在涂片中仍然清晰可见，但与完全间期涂片相比数量明显减少。列出为数不多的天数将被绘制为D，以便进行数据可视化。无效数据将被丢弃。
  4. 时间：给发情周期的监测期贴上标签。例如，如果在药物治疗前后对同一只老鼠进行动情周期监测，则在治疗前的时间将数据标记为1，在治疗后的时间将数据标记为2。此功能可以有效地可视化和绘制不同时间段。
  注意：每一行代表一天内给定鼠标的涂抹。多个鼠标可以包含在同一个电子表格中，只要它们用不同的ID标记。请确保输入的excel文件中的列名称与所述完全相同；否则，将无法正确生成绘图。
2. 使用pyestrousscycle.py文件中实现的函数。
  1. 绘图周期（filedir、animalid、saveoutputfile、分辨率、时间、颜色）
    注意：此函数将为给定的鼠标生成发情周期图（如图5所示）。
    •filedir：输入文件的目录
    •animalid：每个鼠标的唯一标识符
    •saveoutputfile：设置为true将绘图保存到本地A目录。默认值为false。
    •分辨率：设置绘图的dpi值。默认值为80。
    •时间：如果需要，请选择时间段，将数据分组到值列表中的不同监视会话中，例如，[1，2]分别表示会话1和会话2。
    •颜色：选择不同时间段的颜色，按分配给每个监测周期的顺序列出；例如，['black'，'red']将黑色分配给会话1，将红色分配给会话2。
  2. plotAllofthem（文件目录，保存输出文件，分辨率，时间，颜色）
    注意：此函数将为输入文件中的所有老鼠生成发情周期图。输入参数设置与plotcycles函数中的相同。
  3. 百分比表=分析（filedir，saveoutputfile）
    注意：此函数将计算每个鼠标在每个周期阶段花费的时间百分比。将saveOutputFile设置为true以将结果表保存为本地目录中的Excel文件。
3. 示例代码、发情周期数据和示例输出文件都在github上的上述链接中提供。运行example.py代码，学习如何使用python函数并生成示例性发情周期图。
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  图5。从功能图周期生成的单个鼠标的发情周期图示例。黑色圆圈和线条表示第一次监测期间的周期阶段评估，红色圆圈和线条表示第二次监测期间的评估。评估日期在x轴，观测周期阶段在y轴。P=发情前期；D=发情期；M=发情期；E=发情期。图顶部的数字表示鼠标ID号。注意，这些数据是从一只癫痫小鼠获得的，在第一次监测期间，将该小鼠置于一个新的环境中进行连续的脑电图（EEG）记录，从而导致动情周期模式的更多变化和不规则。然而，这个例子说明了本文提出的数据采集和绘制方法能够准确地反映规则周期和中断周期。

数据分析

发情周期长度
从发情周期图中手动计算给定小鼠的发情周期长度。一个完整的发情周期被定义为发情2天之间的天数，发情期、发情间期和发情前期发生在这两天之间（另见下面图6的图例）。< BR> < BR> 图6提供了说明小鼠动情周期长度量化的示例。在这个图中有八个发情周期。表1给出了每个周期的周期长度。注意，周期1和8不完整，因此，根据从监测期间的可用天数收集的数据，周期长度表示为可能的最小值。将给定鼠标的所有周期的数据汇集起来，以计算该鼠标的平均周期长度。计算出每只小鼠的平均周期长度后，在originpro或其他统计软件中应用适当的统计测试，以比较治疗组之间的周期长度。
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图6。指定单个发情周期。在这个示例图中，描述了在5天休息的两边进行的两次监测。绿线和数字表示每个周期的开始。请注意，通常情况下，标准的发情前期和发情期太短，无法完全捕捉。如果在发情周期中缺少发情前或发情后一天，请参阅发情周期实验说明以估计是否确实发生。例如，本图中的第7周期并没有显示全部发情前期或发情期，但如果实验注意到有几天涂片显示发情期到发情期的过渡，以及发情前期到发情期的过渡，则第7周期可以被确定为一个完整的周期。还要注意，循环8结束时的绿线会自动生成，以标记监控的最后一天。然而，由于第8周期在监测结束前尚未完成，因此将不包括在周期长度分析中。还要注意，如图5所示，这些数据来自最初在第一次监测期间暴露于e e g记录的癫痫小鼠，因此既中断了（e.g.，周期1、2、6和7）又获得了规则周期（e.g.，周期4和5），但是算法can说明这两种模式的循环长度。
< BR> 表1。图6所示的发情周期长度。请注意，循环3代表了监控中的一个缺口。这5天的发情期从发情开始到结束，表明可能发生了一个完整的周期。然而，由于这些天缺乏数据，这一周期将不包括在数据分析中（在表中用星号表示）。

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在每个周期阶段花费的时间百分比
鼠标在每个周期阶段花费的时间百分比数据将由percentage_table函数生成。（注意，百分比在生成的电子表格中以0到1之间的值给出；乘以100得到最终的百分比值。）将来自给定实验组或监控会话的所有老鼠的数据汇集起来，并在originpro或其他统计中应用适当的统计测试。软件。

笔记

不要使用浸过或带电的显微镜载玻片。载玻片可以用实验室清洁剂清洗，并根据需要重新使用。
在间期，阴道粘液堵塞移液管尖端是常见的。为了收集一个大小合适的样本，轻轻地移动或旋转阴道尖端，以获得适当的抽吸。另外，吸入20μl的1x PBS也可能有助于增加可用的液体量。
在首次学习和实践涂片采集和评估程序时，最好保持每张幻灯片的涂片数量较低，以防止在获得连续样本时样本干燥，从而影响准确分析。
为了存储视觉涂片数据以备日后评估，可以使用连接到计算机的显微镜安装的数码相机，并将图像保存到指定文件夹中，其中包含给定鼠标每天循环的涂片图像。
过度的阴道人工刺激可能导致啮齿动物假妊娠（Adler and Zoloth，1970；Yang等人，2009）。压力也会对啮齿动物的生殖功能、生殖神经控制和发情周期产生负面影响（Breen等人，2012年；Acevedo Rodriguez等人，2018年）。因此，在插入移液管尖端和将PBS液体从阴道排出时，必须尽可能温和。有些老鼠可能需要习惯于处理和细胞收集程序，才能获得正常周期。我们实验室的政策是，一只成年雌性老鼠在3周内没有表现出正常的周期，将被排除在进一步的实验和研究之外。
如果在采集涂片的区域附近没有显微镜，可以在每个涂片上放置小的圆形或方形盖玻片，以稳定样品的运输。确保污迹在滑道上放置足够的距离，以便在盖玻片下不会混合。
尽管这里介绍的python代码的实现可以提供更快速的数据可视化和分析，但应该注意的是，周期图的生成和周期长度的量化以及每个周期阶段所花时间的百分比也可以在excel或另一个类似的电子表格程序，将每个循环阶段的名称转换为一个数字（例如，，estrus=1，metestrus=2，等等），然后将这些数字作为监测日的函数绘制出来。