材料和试剂

无菌培养罩（Sterilgard
手术剪刀和钳子
移液器20、200和1000μl（Eppendorf）
六孔组织培养板（奥林巴斯，目录号：25-105）
毛玻璃载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-143）
5 ml圆底管（Falcon，目录号：352008）
15 ml管（Falcon，目录号：352096）
50 ml锥形管（Falcon，目录号：352070）
22 G针（BD，目录号：305155）
1 ml注射器（BD，货号：309659）
细胞过滤器，40毫米尼龙（Falcon，目录号：352340）
Steritop，0.22毫米PES，250毫升（Millipore，目录号：S2GPT02RE）
CD49b（DX5克隆）微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-052-501）
纯化的大鼠抗小鼠CD16 / CD32（FcBlock）（克隆2.4G2）（BD Pharmingen，目录号：553141）
APC偶联的抗CD49b抗体（克隆DX5）（Biolegend，目录号：108909）
PE偶联的抗FcεRIα（克隆MAR-1）（Biolegend，目录号：134307）
APC / Cy7偶联的抗c-Kit（克隆2B8）（Biolegend，目录号：105825）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CV）
NH 4 Cl（Sigma-Aldrich，目录号：A-4514）
KHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：237205）
EDTA（Corning，目录号：46-034-Cl）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7409）
DAPI（4'，6-Diamidino-2-Phenylindole，Dilactate）（Biolegend，目录号：422801）
UltraComp eBeads（Invitrogen，目录号：01-2222-42）
Dulbecco的改良版Eagle Medium（Gibco，目录号：11960-044）
乙醇（Koptec，目录号：V1001）
70％乙醇（请参阅食谱）
ACK裂解缓冲液（请参阅配方）
MACS缓冲区（请参阅食谱）

设备

离心机Avanti J-15R（贝克曼库尔特）
BD LSR II（BD Biosciences）
autoMACS Pro分离器入门工具包（Miltenyi Biotec，目录号：130-092-545）
生物安全柜

软件

BD FACSDiva软件
FlowJo软件（版本8.8.7，Tree Star）

程序

脾脏单细胞悬液的制备
1. 通过CO 2 吸入对一只幼稚小鼠进行安乐死。用70％的乙醇消毒小鼠的皮肤（配方1）。提取整个脾脏，并在一个六孔板中加入3 ml PBS。其余程序应在无菌的生物安全柜中进行。
2. 将脾脏放在载玻片磨砂部分的粗糙面上（用PBS浸湿），将其彻底捣碎，然后在两个载玻片之间仔细研磨，直到脾脏分离为止。
3. 用5 ml移液管将含有脾细胞的PBS缓冲液吸移至15 ml管中。
4. 在50 ml锥形管上通过40μm细胞过滤器过滤。
5. 在室温（RT）下以335 x g 旋转5分钟。
6. 弃去上清液，然后将沉淀物在RT的2 ml ACK裂解缓冲液中重悬5分钟。
7. 向细胞悬液中加入8 ml PBS。
8. 在室温下以335 x g 旋转5分钟。
9. 弃去上清液并重悬于10 ml PBS中。
10. 计算细胞的1:10稀释度。
11. 将脾细胞置于冰上，直至准备好CD49b + 细胞富集。
磁性标签
1. 在4°C下以335 x g 旋转5分钟。
2. 弃去上清液，每10 7 个总细胞重悬于90μl“ MACS缓冲液”中（成年小鼠的一个脾脏中预期大约有10 8 个总细胞）。 ;
3. 每10 7 总细胞添加10μlCD49b（DX5）微珠。
4. 通过上下吹打几次将其充分混合，然后在冰上孵育30分钟。
5. 每10 7 总细胞添加1 ml MACS缓冲液。
6. 在4°C下以335 x g 旋转5分钟。
7. 丢弃上清液，并在500μl“ MACS缓冲液”中最多重悬10 8 细胞。
8. 将细胞放在冰上，直到可以使用autoMACS Separator。如果autoMACS分离器不可用，则可以使用MACS色谱柱进行正选择（MS）磁分离，也可以使用其他分离器（例如，MiniMACS，OctoMACS，VarioMACS，SuperMACS）进行磁分离。
使用autoMACS分离器进行磁分离
1. 准备和灌注autoMACS分离器。可以在对细胞进行磁性标记的同时完成此过程（步骤B4）。
2. 将包含磁性标记细胞的试管放入选择正确选择程序（“ Possel”）的autoMACS分离器中。
3. 在出口“ pos1”中收集纯化的CD49b + 细胞级分。
4. 在4°C下以335 x g 旋转富集的CD49b + 细胞级分5分钟。
5. 弃去上清液，重悬于1 ml DMEM中。
6. 计数细胞（一个脾脏中预期有10 6 个细胞）。
7. 将细胞放在冰上，直到通过染色和流式细胞仪分析评估嗜碱性粒细胞的纯度。从一种小鼠脾中富集的CD49b + 细胞中约有20-30％是嗜碱性粒细胞。 90％的生存能力。
流式细胞仪染色
1. 将细胞稀释至1 x 10 6 细胞/ ml进行染色。需要两个样本：一个样本将不染色，第二个样本将与抗体和DAPI混合物一起孵育（生成染色的样本）。
2. 在4°C下以335 x g 旋转两个样品5分钟。
3. 丢弃上清液，并用10 µl稀释的FcBlock（在PBS中为1：200）封闭两个样品。
4. 将两个样品在冰上孵育15分钟。
5. 用20μl抗体和DAPI混合物染色一个样品：PEFcεRIα（1：200），APC / Cy7 c-Kit（1：100），APC CD49b和DAPI（1：100）。将等体积的PBS加入未染色的样品管中。将样品放在黑暗处的冰上染色20-30分钟。
6. 向样品中加入500μlPBS，轻轻涡旋并在4°C下以335 x g 旋转5分钟。
7. 弃去上清液并重悬于300μlPBS中。
8. 通过细胞过滤器将细胞过滤到新的FACS管中，以去除团块并将样品放在冰上，直到流式细胞仪分析。
流式细胞仪
1. 在BD FACS DIVA软件上，选择要设置的“新实验”。
2. 选择FSC和SSC的Area，Height，Width；为颜色PE，APC，APC / Cy7和Indo I-Violet选择Log和Area。
3. 创建补偿控件并调整未染色电池的门控（根据需要调整FSC和SSC电压）。
4. 调整单个污渍的每种颜色，以使每个荧光直方图的中心位于10 2 + 1个刻度上。
5. 对于单个污渍进行补偿，请按照制造商的说明使用UltraComp eBeads。使用DAPI染色的细胞生成单色以进行补偿。
6. 在计算实验补偿之前，请检查P2（即荧光阳性）门是否适合每个单染管，并对P2门进行必要的调整。
7. 计算补偿控制并记录事件。设置为收集50,000个事件。
脾嗜碱性粒细胞过继转移至腹膜腔
1. 在4°C下以335 x g 旋转富集的嗜碱性粒细胞5分钟。
2. 丢弃上清液并重悬3个10 5 脾嗜碱性粒细胞，定义为FcεRIα + ，CD49b + 和c-Kit - 200μlDMEM中的细胞。
3. 使用22 G针和1 ml注射器腹膜内注射200μl受体小鼠。

数据分析

染色后进行流式细胞术（如上述方法D和E中所述）用于确认接受供体野生型小鼠或缺乏TNF的嗜碱性粒细胞的小鼠嗜碱性粒细胞的受体小鼠在24 h腹膜腔中的嗜碱性粒细胞数量相似CLP之后（Piliponsky等人的图8C，2019年）。

菜谱

70％乙醇（用于100毫升）
70毫升99.9％乙醇
30毫升软化水
在RT上存放长达一年
ACK裂解缓冲液
8.0235 g NH 4 Cl
0.10012克KHCO 3
200μl0.5 M EDTA，pH 8.0
达到pH 7.3并使用Steritop过滤器过滤
在RT上存放长达一年
MACS缓冲区
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2
0.5％牛血清白蛋白（BSA）
2毫米EDTA
储存在4°C并在准备后3天内使用

致谢

该协议改编自Wada等人（2010）和Piliponsky等人（2019）。美国国家卫生研究院（NIH）（R01 HL113351，R01 HL141094）和美国心脏协会（AHA）（12GRNT9680021）支持Piliponsky实验室的研究。 NIH（R01 CA72074，R37 AI23990，R01 AI070813和R01 AR067145）和斯坦福大学病理学系为Galli实验室的研究提供了支持。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

伦理

所有程序均根据美国国立卫生研究院现行准则进行，并获得西雅图儿童研究所机构动物护理和使用委员会（ID：IACUC00020，有效期：8/22 / 2019-8 / 21/2019）的批准）。

参考文献

Piliponsky，AM，Shubin，NJ，Lahiri，AK，Truong，P.，Clauson，M.，Niino，K.，Tsuha，AL，Nedospasov，SA，Karasuyama，H.，Reber，LL，蔡，M.和Mukai ，K.（2019年）。源自嗜碱性粒细胞的肿瘤坏死因子可以增强小鼠败血症模型的存活率。 Nat Immunol 20（2）：129-140。
和田市，石田市，Koseki，H。，石仓市，Ugajin，T.，Onuma，N。，小ata市，石川市，R。吉川，S.，Mukai，K。 Y. Kawano，Y. Minegishi，H. Yokozeki，N. Watanabe和H. Karasuyama（2010）。对小鼠嗜碱性粒细胞的选择性消融揭示了它们在获得的抗tick虫免疫中的非冗余作用。 J Clin Invest 120（8）：2867-2875。