材料和试剂

黑色不透明1.5 ml微量离心管（Midwest Scientific，目录号：T7100BK）
Avant透明1.5毫升微量离心管（Midwest Scientific，目录号：AVSS1700）
dPBS（Life Technologies，目录号：14190-250）
白蛋白，牛血清，馏分V（西格玛，目录号：A3059）
Invitrogen TM 总外泌体分离试剂
1. 从尿液中（Thermo Fisher Scientific，Inc.，目录号：4484452）
2. 来自细胞培养基（Thermo Fisher Scientific，Inc.，目录号：4478359）
3. 从等离子（Thermo Fisher Scientific，Inc.，目录号：4484450）
4. 从血清（Thermo Fisher Scientific，Inc.，目录号：4478360）
Tag-It Violet TM 增殖和细胞跟踪染料（Biolegend，Inc.，目录号：425101）
PV1 / PL-VAP，FITC，抗人抗体（Lifespan Biosciences，目录号：LS-C209607-100）
CD31，亮紫605，抗人类抗体（BioLegend，Inc.，目录号：303122）
CD144，PE，抗人抗体（BioLegend，Inc.，目录号：348506）
漂白剂，Clorox（运行期间在FlowSight中使用的解决方案）
异丙醇，HPLC级（Honeywell，目录号：AH323-4）（操作期间在FlowSight中使用的溶液）
Coulter Clenz ®（BD Biosciences，目录号：8546992）（操作期间在FlowSight中使用的解决方案）
去离子H 2 O（操作期间在FlowSight中使用的溶液）
Molecular Probes TM AbC总抗体补偿微珠试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Inc.，目录号：A10497）
蔗糖（Sigma，BioXtra，目录号：S7903）
MES：2-（N-Morpholino）乙磺酸，4-Morpholineethanesulfonic酸（Sigma，目录号：M3671）
二甲基亚砜
EV缓冲液（pH 7.4）（请参见配方）
5 mM Tag-It Violet TM （TIV）解决方案（请参阅食谱）

设备

1毫升移液器
FlowSight Imaging流式细胞仪（Amnis，Inc.）配备：
1. 488 nm激光
2. 405 nm激光
3. 642 nm激光
4. 785 nm激光（SSC）
5. 定量成像
6. 96孔板自动进样器
冷冻微量离心机（Eppendorf，5415R型，48 x 2 ml转子）
MultiTherm温育涡旋仪（Midwest Scientific，目录号：MTHC-1500）
巴恩斯特德去离子水系统（型号）
-80°C冷冻室
-20°C冷冻室
4°C冰箱

软件

Amnis ® IDEAS版本6.2（Luminex Inc.， https：// www .luminexcorp.com / imaging-flow-cytometry / ），数据分析软件
Amnis ® INSPIRE版本6，数据采集软件
Excel（微软）
JMP版本10.0（SAS研究所）

程序

电动汽车隔离
注意：根据制造商的指导，使用总外泌体分离试剂（Invitrogen，Waltham，MA）从全尿中分离出EV。
1. 将尿液样品（1,000μl）在4°C下于2,000 x g 离心30分钟，以去除细胞和碎片。
2. 将尿液上清液（800μl）与1体积（800μl）的总外泌体分离试剂混合，并在室温下孵育1小时。
  其他样品（血浆，血清，细胞培养基）也可以使用制造商关于试剂量，孵育时间和温度的建议类似地制备。
3. 孵育后，将样品在4°C下以10,000 x g 离心1小时。
4. 用1 ml移液器移出上清液并丢弃。
5. 将沉淀的外泌体重悬于50μlEV缓冲液（2 mol / L蔗糖和500 mmol / L MES [2-（N-吗啉代）乙磺酸，4-吗啉乙烷磺酸]溶液）中。
6. 储存在-80°C。样品被认为至少可以稳定6个月（Mendt et al。，2018）。
EV染色和抗体标记
1. 启动并校准FlowSight。
2. 在冰上解冻样品。
3. 如配方2 Tag-It Violet标记EV一样，通过向一管Tag-It Violet TM 中添加50μlDMSO，制备5 mM Tag-It Violet TM 溶液。通过与内部蛋白质结合，从而标记电动汽车，这些电动汽车对于明场可视化来说太小了。
4. 使用20μl移液器将20μlEV移液至1.5 ml不透明的黑色微量离心管中，以保护样品免受光照。孵育后的涡旋仪有一个清晰的盖子，通常位于主实验室中，因此黑色试管可以防止荧光染料在孵育过程中发生光漂白。
  包括一个仅用Tag-It Violet染色的EV样本，以进行单色补偿控制。
5. 使用100微升移液器向每个样品中添加30微升dPBS。
6. 使用2μl移液器将0.5μl的5 mM TIV储备液添加至EV（最终浓度为50μM）。
7. 使用MultiTherm温育涡旋仪在37°C和250 rpm下温育EV 2小时。
8. 使用10μl移液器添加抗体（例如，肾小管周围毛细血管识别）。
  3μlPL-VAP（LSBio）
  4μlCD31（生物传奇）
  3微升CD144（Biolegend）
  在MultiTherm温育涡旋仪中以250 rpm在室温温育1小时。
使用FlowSight进行数据采集
1. 使用配备有Amnis INSPIRE`软件的FlowSight成像流式细胞仪（华盛顿州西雅图的安尼斯公司）进行采集。
2. 在加载到FlowSight之前将样品涡旋10-20 s。
3. 仪器设置：
  激光器（全部设置为全功率）：
  405 nm 100毫瓦
  488 nm 60兆瓦
  642 nm 100毫瓦
  785纳米（SSC）70毫瓦
4. 至少获得100,000个TIV阳性事件。
5. 准备用于抗体的单色控制补偿珠。
  1. 在1.5 ml微量离心管中，加入1滴AbC捕获珠。
  2. 每管加入一种抗体，步骤B8中指示的体积。
  3. 在室温下孵育15分钟，避光。
  4. 加入1 ml dPBS后，涡旋并使用1000μl移液器以250 x g 旋转5分钟。
  5. 除去上清液。
  6. 加入一滴AbC阴性珠和50μldPBS。
  7. 涡流并在FlowSight上运行。
    1. 关闭Brightfield以获得1000个事件（用于补偿）。
    2. 开启Brightfield可以获取1000-5000个事件，以帮助初步确定门。
6. 样本按以下顺序运行。
  1. 仅TIV电动汽车
    1. 关闭Brightfield以获得1000个事件（用于补偿）。
    2. 开启Brightfield可以获取1000-5000个事件，以帮助初步确定门。
  2. 抗体单色对照（如上述步骤C5g所获取）
  3. 具有TIV和所有抗体的样品（亮域已打开）

数据分析

Amnis IDEAS数据分析软件
1. 电动汽车使用IDEAS（美国华盛顿州西雅图的阿姆尼斯）进行了量化。
2. 使用IDEAS补偿矩阵向导创建实验补偿矩阵。
3. 打开来自一个样本的原始数据文件，并应用补偿矩阵。
4. 使用IDEAS软件中基于抗体和Tag-It Violet染色面板的逐步数据分析向导创建门控策略模板。图1说明了在流式细胞术数据分析中用于PTC识别的门控策略步骤。
  对于PTC识别，主要关注Tag-It Violet + / PL-VAP + / CD31- / CD144-事件，并为此目的开发了门控策略。 PL-VAP + / CD31- / CD144-的组合用于鉴定从肾周毛细血管释放的EV。
  
  图1.示意图，显示了用于PTC识别的流式细胞术门控策略。。步骤1：从收集到的所有事件中绘制出侧面散射（大小）和Tag-It紫罗兰色（EV）强度的散点图，绘制门（ROI））对于Tag-It紫罗兰色阳性事件和SSC低;步骤2：EV +人群的PL-VAP抗体强度直方图，绘制PL-VAP阳性事件的门（ROI）；步骤3：来自PL-VAP +人群的CD31和CD144散点图，对于PTC EV，最重要的门（ROI）是CD31- / CD144-，但是用于识别CD31- / CD144 +，CD31 +，CD144-和CD31 +的门（ROI） / CD144 +事件也会被绘制。
5. EV使用以下流控策略进行测量（请参见图1）。
  1. 创建侧向散射（SSC）通道6与收集的所有事件的Tag-It Violet通道7的散点图。
    1. 绘制感兴趣的区域（ROI），以进行积极的Tag-it紫罗兰事件和低SSC
    2. 标记为Tag-It Violet +或EV +人群
  2. 创建PL-VAP通道的直方图。
    1. 得出正PL-VAP的ROI
    2. 标记为PL-VAP +
  3. 创建CD31与CD144的散点图
    1. 围绕负CD31和负CD144的事件绘制ROI。
    2. 标签为CD31- / CD144-
    3. 同时为CD31 + / CD144 +事件绘制投资回报率
6. 具有所有ROI的门控策略在IDEAS中保存为模板。
  1. 保存的模板和补偿矩阵将应用于所有样本。
  2. 手动验证了3-5个样本的ROI，以验证ROI边界阈值
  3. 从每个样本中提取作为每个ROI中事件数的数据。
7. 门控种群表示为Tag-It紫罗兰阳性事件的百分比。（参见Sun et al。（2018），图2A和2C，以比较患者组之间的数据。）
  1. PL-VAP + / CD31- / CD144-事件
  2. PL-VAP + / CD31 +
  3. PL-VAP + / CD144 +
  4. PL-VAP + / CD31 + / CD144 +
使用JMP进行统计分析；请参阅Sun et al。（2018）进行数据分析。

菜谱

EV缓冲液（pH 7.4）
2 mol / L蔗糖（Sigma，BioXtra）
500 mmol / L MES（西格玛）
在4°C下稳定6个月。
5 mM Tag-It Violet TM （TIV）解决方案
50μl无水DMSO
一小瓶Tag-It Violet TM （122.25μg）
在-20°C下可稳定1个月，但最佳做法是新鲜制作

致谢

该协议改编自Sun et al。（2018）。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助号DK10081，DK104273，DK102325和DK120292的部分支持。

利益争夺

没有利益冲突。

伦理

这项研究已由梅奥诊所的机构审查委员会批准，并根据《赫尔辛基宣言》的道德原则进行。每位患者均获得知情的书面同意。

参考文献

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