材料和试剂

注意：除U2OS C32单元标准外，您可以用等效的替代品替换所有列出的试剂，设备和软件。

Falcon TM 标准100- mm组织培养皿（Corning TM 353000，Fisher Scientific，目录号：08-772-E）
Falcon TM 聚苯乙烯6孔微孔板（Corning TM 353046，Fisher Scientific，目录号：08-772-1B）
Cryovials （Corning TM 430487，Fisher Scientific，目录号：03-374-20）
的Eppendorf TM 卡扣帽微量safe- 锁TM 管，1.5毫升（Fisher Scientific公司，目录号：05-402）
带有细胞过滤器卡扣盖的试管（Corning TM 352235，Fisher Scientific，目录号：08-771-23 ）
保护眼睛
面具
U2OS C32 Halo-CTCF标准细胞系[ 首先描述于Hansen 等。（2017），可根据要求提供] 。解冻一根冷冻管的内容物，然后将其置于一块100 mm细胞培养板上
用户提供的表达感兴趣的Halo标记蛋白的细胞系
DMEM，低葡萄糖，GlutaMAX TM 补充剂，丙酮酸（Fisher Scientific，目录号：10567014）。储存温度：4 ° C。保质期：从生产日期算起12个月
胎牛血清（FBS）（HyClone ，目录号：SH30910.03）。未完全定义的FBS也将起作用。商店在50个毫升等份在-20 ° 下保质期：由指定的制造商
50 X 青霉素-链霉素混合物，5000个单位青霉素钾和5000 微克硫酸链霉素每m 升在0.85％盐水（龙沙TM 17-603E，Fisher Scientific公司，目录号：BW17-603E）。在-20°C下以5 ml等分试样储存。保质期：自生产之日起12个月
注意：工作浓度为每1 ml培养基100单位青霉素钾和100μg 链霉素硫酸盐。

TMR- HaloTag  配体（Promega公司，目录号：G8251）。存储温度：-20 ° 下保质期：由指定的制造商
注意：如果你需要从这些TMR（555不同的光谱特性防爆/ 585 EM ），Promega公司提供了一些替代品，包括HaloTag  结合的配体Janelia 氟 染料。

二甲基亚砜，DMSO（Millipore Sigma，目录号：D2650-5X5ML）。存放在室温下。保质期：由指定的生产厂家。我们建议使用新鲜开瓶的安瓿稀释荧光HaloTag 配体
HCl（Fisher Scientific，目录号：A144-50）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：S271-10）
KCl （Fisher Scientific，目录号：P217-10）
Na 2 HPO 4 （Fisher Scientific，目录号：P285-500）
KH 2 PO 4 （Fisher Scientific，目录号：S375-212）
NaOH颗粒（Fisher Scientific公司，目录号：S318-100），小号撕在室温。保质期：由制造商指定
2.5％胰蛋白酶（Fisher Scientific，Gibco，目录号：15090046）。小号torage温度：-20 ° 下保质期：从制造的2.5％的股票的24个月; 从稀释日期开始的12个月内
EDTA（C 10 H 18 N 2 Na 2 O 10 ，Fisher Scientific，目录号：S311-500）。小号torage温度：室温。保质期：由制造商指定
10×PBS，pH 7.4中（1 大号）（见配方小号）
1x PBS，pH 7.4（请参阅食谱）
0.1 M EDTA pH 8.0（请参阅配方）
0.05％胰蛋白酶（请参阅食谱）
U2OS介质（请参阅食谱）
U2OS冻结媒体（请参阅食谱）

设备

细胞培养培养箱（三洋铜合金IncuSafe 加湿培养箱，型号：MCO-18AIC（UV））。设定在37°C和5.5％CO 2
生物安全柜（贝克· 斯特里加德三世，型号：SG403A）
水浴（Thermo Fisher Scientific Precision，型号：185（2843））
显微镜（Nikon Diaphot 反相显微镜）
台式离心机（Eppendorf，型号：5702）
微型离心机（Eppendorf，型号：5418）
涡旋混合器（Scientific Industries，Inc.，型号：Vortex-Genie 2）
BD LSRFortessa TM 流式细胞仪
注意：F 或TMR染色，您将需要561 nm激光作为激发源和610/20带通滤光片或类似物（TMR发射最大值约为585 nm）。

软件

BD FACS Diva TM 6.2 （BD，https://www.bdbiosciences.com/zh-cn/instruments/research-instruments/research-software/flow-cytometry-acquisition/facsdiva-software）
FlowJo 10.6.1 （BD，https: //www.flowjo.com ）
Excel 16.30 或等效版本（Microsoft Corporation，https://www.microsoft.com/Microsoft/Excel）

程序

细胞培养
注意：在生物安全柜中执行所有细胞培养程序，以保持无菌状态。可以从不同的组织/公司获得进行细胞和组织培养的通用指南[ Abcam （参考文献1）；ATCC （参考文献4）；ECACC （参考文献11）；LifeTechnologies （参考文献18）] 。

与您从我们实验室收到的U2OS C32细胞标准并排培养您感兴趣的细胞系。解冻U2OS细胞：
在设置为37 ° C的水浴中预热U2OS介质（配方4）。
将9 ml U2OS介质添加到15 ml锥形管中。
将冷冻管放入37 ° C水浴中，轻轻旋转直至几乎完全融化。
用P1000移液器将冷冻管中的内容物（1毫升或更少）转移到15毫升锥形管中，并颠倒几次。
在台式离心机中离心细胞（200 xg ，在室温下5分钟）。
吸出上清液，轻弹试管以重悬细胞并添加10 ml U2OS培养基。
板到一个100毫米的组织培养皿中，并将细胞放在设置为37°C和5.5％CO 2 的培养箱中过夜。
当细胞准备就绪（60-80％汇合）时，将其分成6孔板
注意：我们通常在6孔板上进行标记实验，但您可以根据需要按比例放大或缩小比例。

在设置为37 ° C的水浴中预热U2OS介质和1x PBS ，并在室温下使用胰蛋白酶。
从培养箱中取出100毫米平板。
吸出培养基并用10 ml的1x PBS洗涤。
吸出PBS，并加入1.5 ml胰蛋白酶。
将平板移至培养箱中1-2分钟，或直至细胞在显微镜下看起来呈圆形并部分分离（用手击打平板侧面有助于分离大多数细胞）。
添加10.5 ml U2OS培养基，并上下吸移以获得单细胞悬液。
将细胞悬液分配到6孔微孔板中。每种细胞类型至少接种2孔：一个未标记以测量背景荧光，另一个则用TMR染色。接种后第二天，每孔一毫升细胞将为您提供足够的细胞以进行染色和流式细胞术（从60-80％融合的100-mm平板开始，一毫升将包含〜250,000-500,000 U2OS细胞）。如果需要延迟实验，请减少用量（例如，0.5毫升等待一整天，或0.25毫升等待几天）。
注意：建议您此时创建自己的U2OS C32单元标准库存。要冻结U2OS细胞，请将剩余的所有细胞倒入15 ml锥形管中。在重悬冷冻培养基（配方5）和等分至冷冻管颗粒（我们一般制备2瓶从汇合100mm的板开始，再悬浮于500沉淀微升至1ml冷冻每小瓶介质的）。

加入培养基至2 ml最终体积，然后将板放回培养箱中。

TMR标签
注意：使用荧光基团时，请尝试尽量减少光照（例如，保持遮光罩的灯熄灭，用箔纸盖住盖板和灯管）。

在37 ° C下预热1x PBS，U2OS介质和特定细胞系所需的任何其他介质，在室温下预胰蛋白酶。每个6孔板的孔中需要约5 ml培养基。
注意：如果您感兴趣的细胞系在悬浮液中生长，请向下旋转细胞以替换培养基或进行PBS洗涤。由于细胞不需要胰蛋白酶消化，孵育5分钟以洗掉未反应的配体后，您可以进行PBS洗涤并将细胞直接重悬在新鲜培养基中进行流式细胞术。

解冻的5mM的TMR- HaloTag  配体由Promega提供。
稀1:10在DMSO中以创建一个1000 X 原液（500 μM ），并等分较小待储存在-20 ° C（例如，稀释的10 微升到90 微升DMSO中，并准备10× 10 微升等分试样）。如果可能的话，请避免冻融1,000 x 纸料，尽管几个冻融周期不成问题。
制备1.5ml标记每孔媒体的被染色，稀释1000 X TMR- HaloTag  配体库存在细胞培养基中（1：1,000稀释度：1.5 微升在每次1.5毫升介质）。对于每个要测量的细胞系，记住要留下1个未标记的孔。
从培养箱中取出您前一天准备的6孔板。
吸出常规细胞培养基，并添加1.5 ml标记培养基（标记孔）或常规培养基（用于背景测量的未标记孔）。
将板转移回37 ° C培养箱30分钟。
吸出上清液，用4 ml 1x PBS洗涤。
吸出PBS，并加入2 ml常规培养基。
将板转移回37 ° C培养箱5分钟，以除去未反应的配体。

收集细胞进行流式细胞术
胰蛋白酶消化细胞。对于每个孔：
用2 ml 1x PBS洗涤。
吸PBS，并添加300 微升胰蛋白酶。
只要需要将板移回37 ° C培养箱，即可分离细胞。
通过加入900灭活胰蛋白酶微升的细胞培养基。
用P1000将每个孔重悬几次，然后将内容物转移到1.5 ml Eppendorf管中。
在微量离心机中离心细胞（200 xg ，5分钟，在室温下）。
重悬细胞沉淀在500 微升新鲜培养基。
将细胞转移到流式细胞仪试管中，使其通过试管的细胞滤网卡口盖。
将试管存放在冰上，避光保存，并立即进行流式细胞仪。

通过流式细胞仪测量荧光强度
大多数流式细胞仪和软件都可以使用，但是在这里我们使用BD LSRFortessa TM 仪器和相关的BD FACSDiva TM 采集软件来说明该协议。

注意：如果您使用其他流式细胞仪和/或其他采集软件，请参阅其操作手册。如果您不熟悉流式细胞仪，我们建议至少与有经验的用户一起进行第一次流式分析。另外，建议您预先设置流式细胞术实验并调整所有必需的设置，以使染色的细胞仅在有限的时间（约20分钟）内在冰上放置。

打开BD LSRFortessa TM 流式细胞仪，并连接计算机。
打开BD FACSDiva TM 采集软件，然后等待流式细胞仪连接。如果您不熟悉该软件，则可以在https://www.bu.edu/flow-cytometry/files/2010/10/BDFACSDivaSoftwareReferenceManual.pdf上找到6.0版本的完整参考手册。
如果出现“ CST不匹配”窗口，请单击“使用CST设置”。
在上方的菜单栏中，单击“查看”并确保选中以下项目，并打开相应的窗口：工具栏，状态栏，浏览器，细胞仪，检查器，工作表和采集仪表板。
在上方的菜单栏中，单击“实验”，然后从下拉菜单中选择“新实验”。
选择一个空白模板。现在，您的实验将在“ 浏览器” 窗口中显示为已打开的书。右键单击实验名称，然后单击“重命名”以指定其他名称。
在浏览器窗口中的实验图标下方，单击“ Cytometer设置”。
移至“ 检查器” 窗口以设置“ 细胞计数仪设置” 。在“参数”选项卡中，选择并删除除FSC （正向散射），SSC （侧向散射）和PE-Tx-Red-YG （用于TMR染色）以外的所有内容；仪器将使用561 nm激光作为激发源，通过610/20带通滤光片或类似物（TMR发射最大值为〜585 nm）读取发射。如果您使用的是不同的荧光团，请进行相应的修改。检查FSC 和SSC 参数的“ A”和“ H”以进行记录信号面积和高度（这将使您能够在分析过程中从双峰中区分出单个细胞）对于PE-Tx-Red-YG 参数，选中“ A”和“ Log”，以使数据为对数刻度。
返回上一级菜单栏，单击“实验”，然后从下拉菜单中选择“新样本”。一个面板模板窗口将会出现。点击“确定”。将根据浏览器窗口中打开的实验创建一个新的标本（注射器图标）。右键单击标本名称并将其更改为今天的日期（YYYYMMDD）。
在浏览器窗口中，选择“ 全局工作表” ，然后移至“ 全局工作表” 窗口。
绘制点状图（窗口工具栏左侧的第5 个按钮，单击并拖动到工作表中的任意位置；当您释放鼠标时，点状图将出现）。
通过将光标放置在点图内并单击几次以绘制您选择的形状，创建一个多边形门（从左边第14 个按钮）。采集样本后，您将调整门以选择活细胞。
创建直方图（左侧第7 个按钮），如果需要，单击x 轴将显示的参数更改为PE-Tx-Red-YG。
选择直方图后，移至“ 检查器” 窗口并选中“ P1”。这只会显示您在12中门控的活细胞的TMR信号。
返回到“ 浏览器” 窗口。
单击“ +”号以展开“ Tube”图标，以扩展标本图标。右键单击它，然后使用您的样本名称（U2OS_C32_unlabeled ）重命名。
单击左侧的灰色指针以选择刚刚创建的样本。
取出您的第一个样品（U2OS_C32_unlabeled），短暂涡旋，取下瓶盖，将其装到流式细胞仪上。
使用仪器控制面板中的“ LO”按钮将流速设置为较低。
点击仪器控制面板上的“运行”按钮。
返回Diva软件，移至Acquisition Dashboard，然后单击“ Acquire”以在“ 工作表” 窗口中可视化单元格。
在Cytometer 窗口中，调整FSC 和SSC 电压以区分工作表点图中活细胞的死角（对于U2OS，我们对FSC 使用〜220 ，对SSC使用〜280 ）。在“ 采集仪表板” 窗口中，单击“重新启动”以仅显示使用调整电压采集的单元。现在，您可以将P1门调整为仅包括活细胞。
注意：前向和侧向散射值在每个单元之间都不同，具体取决于单元大小（FSC）和内部复杂度（SSC）。与死细胞或细胞碎片相比，活细胞具有更大的FSC和SSC值，通常占人口的大部分。如果完全重悬了样品，则细胞双峰/聚集体的FSC和SSC值将比单个细胞高，但不应代表大多数细胞（在分析阶段将排除双峰。请参见下面的步骤E5）。

返回“ 检查器” 窗口，调整PE-Tx-Red-YG电压，以将工作表直方图移到x 轴的最左侧，同时仍显示所有事件（对于U2OS，我们使用〜520）。
在“ 采集仪表板” 窗口中，单击“停止采集”，然后在仪器控制面板中，单击“ STNDBY”以暂停采集。
快速检查其他未标记的样本，以确保您为U2OS电池选择的电压对于其他电池类型也是合理的。如果没有，请根据需要进行调整。
不是es ：

我们通常在一个样品与另一个样品之间加水，以避免交叉样品污染。
当使用不同的像元类型时，您可能需要在一种像元类型和另一种像元类型之间移动P1门。但是，您必须找到所有电池类型都可接受的电压值，并在采集所有样本期间保持恒定。
回到您的原始样本。重复步骤D18-D21。如果不需要进一步的电压调整，请在“ 采集仪表板” 窗口中修改“ 采集设置”，以决定使用哪个停止门（选择P1）以及要记录的事件数量（选择50,000）。如果需要重新调节电压，请返回步骤D25。
单击“记录数据”按钮将数据保存到FCS文件。如果样品稀释得太高，则将流速提高至MED或HIGH，以加快采集速度。记录了指定数量的事件后，在仪器控制面板上按“ STNDBY”以暂停采集。
在采集仪表板窗口中，单击“下一个试管”以创建下一个样品。您可以在“ 浏览器” 窗口中右键单击它，也可以从“ 检查器” 窗口中的“管”选项卡中对其重命名。
取下一个样本并重复步骤D18-D21和D27-D28，直到您获取并记录了所有样本。
对流式细胞仪执行任何建议的清洁程序。
在浏览器窗口中，通过右键单击标本名称导出数据。选择“导出”，“ FCS文件”，并保留默认的FCS3.0格式。单击“确定”，出现提示时，选择要保存数据的目录，然后单击“保存”。
退出BD FACSDIVA TM 软件（从顶部菜单中单击“文件”，然后单击“退出”）。

使用FlowJo 软件分析流式细胞仪数据并获得平均荧光强度（有关完整的软件文档，请参阅docs.flowjo.com/d2/）
注意：可以使用BD FACSDiva TM 软件代替FlowJo 进行数据采集和分析。免许可证的替代方案是我们用来分析原始手稿中的数据的Matlab 代码（Catoglio 等，2019），网址为https://gitlab.com/tjian-darzacq-lab/cattoglio_et_al_absoluteabundance_2019。

打开FlowJo 程序。
将FCS 3.0文件拖放到下部工作区窗口中。
选择U2OS C32未标记的控件。
在活细胞上创建一个门。
双击文件名；这将打开一个正向（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）值的点图。
创建一个自由多边形门（左上角的第5 个按钮）以封闭活动单元（将其命名为“活动单元”）。
在工作区窗口中，选择“活细胞”门并将其应用于所有样品（只需将其拖放到“所有样品”组的上述窗口中）。
返回到前向散点图和侧向散点图；使用窗口右上角的箭头从一个样本移至下一个样本，并根据需要调整“活细胞”门，并将其拖动。如有必要，还可以修改浇口形状（图2）。

图2. FlowJo中的活细胞门控。FlowJo 生成的前向散射图和侧向散射图说明了应用于此处重新分析的数据的“活细胞”门控。选通的选择可能会影响您的绝对定量，因为细胞大小与蛋白质丰度相关。

排除细胞双峰
注意：在C attoglio 等人发表的原始流式细胞术实验中。（2019）我们没有记录FSC-H和SSC-H值。因此，在下面的表1的重新分析中，我们不能按照步骤E 5的建议排除细胞双峰。

返回U2OS C32未标记控件的散点图，然后双击“活细胞”门内的任何位置。这将打开一个仅显示门控单元的新散点图。
将y 轴设置为FSC-H，将x 轴设置为FSC-A以排除双峰。单细胞沿同一对角线定位，而双峰位于其下方（图3）。
创建另一个自由多边形门以仅包括沿顶部对角线的单元。单击“确定”将其命名为“单个单元格”。
在工作区窗口中，选择“单个单元”门，并将其应用于所有样本（只需将其拖放到“活动单元”子组的上述窗口中）。
像在步骤E 4d中为“活细胞”门所做的那样，分别针对每个样本调整“单细胞”门。

图3. FlowJo中的双峰排除。FlowJo 生成的FSC-H和FSC-A散点图说明了位于主对角线上的单个单元（黑色多边形门）和位于其下方的单元双峰（红色虚线门）。

获取平均荧光强度（MFI）表
返回工作区，选择表编辑器，然后单击“编辑”选项卡。单击“添加列”，然后在左侧选择“均值”，然后从右侧的下拉菜单中选择“单个单元格”填充和“ PE-Tx-Red-YG-A”参数。
单击确定，然后返回到“表编辑器”选项卡。点击“创建表”。这将生成一个表格，其中包含所有样品和未标记对照的平均荧光强度。要将表格下载为Excel文件，请从“创建表格”按钮右侧的下拉菜单中选择“至文件”和“ Excel”。选择一个“目标”文件夹，然后再次单击“创建表”。
退出FlowJo，保存工作区。

获得目标蛋白质的绝对量
在Microsoft Excel中打开FlowJo 生成的表。
对于每个TMR标记的细胞系，从每个TMR标记的样品的MFI中减去未标记样品的MFI（背景荧光，bkg ），以得到调节后的MFI，如下所示：

使用MFI ADJ 值来计算的利息（蛋白质的绝对丰度），如下所示：

其中MFI adj，COI 是表示研究中带有Halo标签的蛋白的目标细胞系（COI）的调整后平均荧光强度，MFI adj，C32 是扣除C32细胞标准品的背景平均荧光强度，109,800 为我们在标准U2OS C32细胞系中估算的Halo-CTCF的绝对量。

在几个生物学重复中获得的平均n POI ，以获得均值和标准差值。
表1详细列出了Cattoglio 等人发表的FlowJo 对原始数据的重新分析。（2019）。您也可以下载原始FCS从3.0文件github上的https://gitlab.com/tjian-darzacq-lab/cattoglio_et_al_absoluteabundance_2019/tree/master/Data。请注意，FSC / SSC门控可能会影响最终的绝对估计值，因为不同大小的细胞还将具有不同的蛋白质量（在FlowJo中为这些样品应用的门控在图2中）。因此，我们在这里报告的小鼠胚胎干细胞的数字与我们最初发表的数字有所不同。具体地，我们现在估计〜539000 ± 36500个Sox2的分子（相对于〜460500 ± 25600在Cattoglio 等人，2019）和111,000〜± 32000 TBP分子（相对于〜99100 ± 29100在Cattoglio 等人，2019）

表1.小鼠胚胎干细胞中Sox2和TBP的绝对定量。对于每个细胞系，在其中内源性地用Halo标记了不同的目标蛋白（POI），该表报告了用逗号分隔的4个生物学独立重复获得的流式细胞仪荧光值（MFI，平均荧光强度）。然后，我们减去未标记样品的背景荧光，以获得调整后的MFI值（MFI adj ）。我们最终使用这些值来计算小鼠胚胎干细胞（mESC ）系C3和C41 中Sox2和TBP的绝对丰度，如步骤F2至F4所述。我们在最后一栏中报告的n个POI 是在4个重复样本中平均的绝对定量± 标准差。

细胞系

兴趣点

MFI（澳大利亚）

MFI ADJ

ñ POI

U2OS_unlabeled

574、1071、1216、513

从C32减去

U2OS_C32_TMR

CTCF

7761、10883、10978、5285

7187、9812、9762、4772

109,800; 标准

mESC_unlabeled

451、616、640、309

减去C3和C41

mESC_C3_TMR

袜2

32260、49995、49373、25052

31809、49379、48733、24743

538,996 ± 36,512

mESC_C41_TMR

待定

6434，9036，9562，7175

5983、8420、8922、6866

110,991 ± 31,549

AU：荧光任意单位

数据分析

数据分析仅需要进行上面详述的计算（协议步骤F2至F4）。表1显示了重新分析了Cattoglio 等人首先描述的TMR标记实验子集后的中间数据和最终数据。（2019）。原始文件可从https://gitlab.com/tjian-darzacq-lab/cattoglio_et_al_absoluteabundance_2019/tree/master/Data下载。

菜谱

10x PBS，pH 7.4（1升）
向800 ml的双蒸馏水（ddH 2 O）中添加NaCl（80 g），KCl （2 g），Na 2 HPO 4 （14.4 g）和KH 2 PO 4 （2.4 g）。搅拌溶解
戴上护目镜，并用6 N HCl调节pH值至7.4（Thermo Fisher Scientific要制备6 N HCl溶液，用ddH 2 O 稀释浓酸1：1 ）
用ddH 2 O 将体积升至1升，然后将100毫升分配到可高压灭菌的玻璃瓶中
液体循环高压灭菌30分钟
1x PBS，pH 7.4
137毫米氯化钠

2.7毫米氯化钾

10毫米Na 2 HPO 4

2毫米KH 2 PO 4

用10倍高压灭菌溶液（配方1）稀释并重新高压灭菌

注意：您也可以购买现成的无菌1x PBS。储存温度：15-30 ° C。保质期：从制备日期算起12个月。

0.1 M EDTA，pH 8.0（1 升）
向700 ml的ddH 2 O中添加37.22 g的EDTA并搅拌（EDTA在pH接近8.0之前不会溶解）
用NaOH颗粒将pH调节至8.0（戴护目镜和口罩）
用ddH 2 O 使溶液升至定量
液体循环高压灭菌30分钟
0.05％胰蛋白酶
向1升1x PBS中加入10毫升0.1 M EDTA，pH 8 .0
高压灭菌30分钟，准备50毫升等分试样，然后向每个等分试样中加入1毫升Gibco → 2.5％胰蛋白酶原液
将等分试样储存在-20 ° C
U2OS媒体
向500毫升低葡萄糖DMEM瓶中添加50毫升FBS（最终含量约10％）和5毫升钢笔/链球菌混合物

U2OS冻结媒体
向1 ml DMSO中添加9 ml U2OS介质（最终10％DMSO）。在生物安全柜中打开DMSO，以确保无菌，并将剩余的DMSO分装到15 ml锥形管中（1 ml等分试样）
将冷冻介质在冰箱中保存最多1个月，将DMSO等分试样在-20 ° C下保存12个月

致谢

ASH感谢Siebel干细胞研究所的博士后研究金和NIH NIGMS K99独立之路K99GM130896的支持。该泽南-Darzacq 实验室是由美国国立卫生研究院共同基金4D支持Nucleome 计划U01-EB021236和U54-DK107980（XD），再生医学批LA1-08013加州理工学院（XD），以及由霍华德·休斯医学研究所（003061，RT ）。此处详细介绍的协议首先在Cattoglio 等人中进行了描述。（2019），它使用了以前由希拉· 特维斯（Sheila Teves）生成的Halo标记的Sox2和TBP mESC 品系（Teves 等人，201 6和201 8 ）。我们感谢Elena Slobodyanyuk 测试了该协议，并感谢Nike Walther对本手稿提供了评论。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的金融/非金融利益。

参考文献

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