材料和试剂

1. 6孔板(康宁生命科学，3516)
2. 96孔板(TTP，目录号：92696)
3. T-25培养瓶（TTP，目录号：90026）。
4. 盖板玻璃（VWR，目录号：631-0150）。
5. Nunc CryoTube（Sigma，目录号：V7884）。
6. 京都海拉细胞(Cellosaurus ID: CVCL_1922)
7. HEK-293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216TM）。
8. pcDNATM 3.1(+)质粒(赛默飞世尔科技公司，目录号：V790-20)
9. pGL4质粒(Addgene)
10. 含有Cas9的质粒是Jonathan L.Schmid-Burgk（Schmid-Burgk等人，2016年）的友好礼物。
11. 含有gRNA的质粒是Jonathan L.Schmid-Burgk（Schmid-Burgk等人，2016年）的一份厚礼。
12. GibcoTM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)，高葡萄糖（赛默飞世尔科技，目录号：11965092）。
13. 胎牛血清（GE Healthcare，Hyclone，目录号：SV30160.03）。
14. GibcoTM庆大霉素(赛默飞世尔科技公司，目录号：15750045)
15. GibcoTM普罗霉素二盐酸盐（赛默飞世尔科技公司，目录号：A1113802）。
16. GibcoTM 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红（赛默飞世尔科技公司，目录号：253000054）。
17. LipofectamineTM 3000 转染试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：L3000015）。
18. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：D2650-100ml）。
19. 因莫他唑(Selleckchem，目录号：S8446)
20. 钩端螺旋体素B（Invivogen，目录号：tlrl-lep）。
21. NucBlue Live ReadyProbesTM 试剂 Hoechst 33342（赛默飞世尔科技公司，目录号：R37605）。
22. GibcoTM Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)，不含钙，不含镁（赛默飞世尔科技，目录号：14190250）。
23. 甲醛16%，不含甲醇，超纯（Polysciences Inc.，目录号：18814-20）。
24. 溴化六氯菊酯（聚溴）（MedChem Express，目录号：2878-55-4）。
25. X-tremeGENE9 DNA转染试剂（Sigma-Aldrich/Roche，目录号：06 365 809 001）。
26. ON-TARGETplus KPNB1 siRNA 人类 (Horizon Discovery, 目录号: L-01523-00-0005)
27. ON-TARGETplus KPNA2 siRNA 人类（Horizon Discovery，目录号：L-004702-00-0005）。
28. 基因脉冲器电穿孔黄油（Bio-Rad，目录号：165-2677）。
29. siRNA缓冲液（Horizon Discovery，目录号：B-00200-UB-100）。

装备

1. 孵化器
2. 镊子
3. Frosty先生冷冻容器（赛默飞世尔科技公司，目录号：5100-0001）。
4. 扫描共聚焦显微镜，例如，SP8共聚焦显微镜（徕卡，型号：SP8 MDi8）。
5. CellInsight CX5高含量筛选平台（赛默飞世尔科技，目录号：CX51110）。

軟件

1. ImageJ(Wayne Rasband(已退休)，https://imagej.nih.gov/ij/download.html)
2. CellProfiler (Broad Institute, https://cellprofiler.org/)
3. Snapgene (GSL Biotech LLC, https://www.snapgene.com/)

流程

该协议的摘要如图1所示。该协议的第一部分描述了三种不同的报告细胞系（图2）的生成，这使我们能够调查ALS病理中涉及的导入途径。该协议可以很容易地适应调查其他运输途径，通过简单地改变核定位或核出口信号在构建。第二部分介绍了如何测量和分析核细胞质运输。

图1.工作流程总结工作流程概要

图2.生成的报告细胞系。生成的报告细胞系。使用CRISPR-Cas9技术，生成了三种不同的报告细胞系，稳定地表达指定的构建体。这使我们能够研究参与ALS的导入途径。1+3）KPNB1/KPNAx介导的导入途径（TDP43使用的途径）和（2）TPNO1介导的途径（FUS使用的途径）。在细胞系1中，记者主要定位到细胞质中。这允许，结合XPO1抑制剂，诱导时间依赖性运输从细胞质到细胞核，并以此来测量KPNB1/KPNAx介导的进口随着时间的推移。细胞系2和3允许以一种简单的方式测量进口和出口之间的平衡变化。

A. 研究核细胞质运输的细胞系的生成。
由CMV启动子驱动的报告构建体，使用CRISPR-Cas9基因敲入协议整合到Hela京都细胞的AAVS1安全港位点中。使用三种不同的CRISPR-Cas9敲入协议。

1. CRISPR-Cas9基因敲入协议创建核细胞质运输细胞系。
第1号议定书（佐久间et al., 2016):
使用经典的PCR将感兴趣的核细胞质运输报告盒插入pcDNA3.1质粒中。设计插入时，确保5'和3'端包含两个相同的靶向位点和微同源序列。CRISPR-Cas9靶向位点是需要的，以便在下面的步骤中从质粒中切出插入物。微组学序列是需要特异性地将插入盒插入AAVS1安全港位点。在这里，我们克隆了一个表达NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki的盒，并将其与P2A-PuromycinR融合（图3A）。
议定书2（盖辛格et al., 2016):
将PuromycinR-P2A-NESpki2-mNeongreen2x-NLSFUS报告子克隆到pcDNA3.1质粒(图3B)，作为模板，用5′硫代磷酸酯修饰的引物(fw引物：T*C*C*CCTCCACCCCACAGTGGGGCC ACTAACGGGCCAGATATACGCG；rv引物：T*C*C*CCTCCACCCCACAGTGGGGCCACTA CTGGTTCTTTCCGCCTCAGAA，用*表示硫代磷酸酯修饰的核苷酸)进行PCR反应。该PCR产物被用作CRISPR敲入协议的供体。该PCR引物包含5′端微同源序列，以使插入物特异性整合到AAVS1安全港位点(类似于协议1)。
第3号议定书（Schmid-Burgket al., 2016):
NLScMYC-AcGFP2x-NESikb2被克隆到pGL4-质粒中，该质粒在5′端含有CRISPR-Cas9的靶向侧，将其线性化，以便使用CRISPaint敲入协议插入AAVS1安全港位点（图3C）。
注：
a. 注意你的报告蛋白的最终大小。如果你的目标是研究主动运输，使用的融合蛋白的两个或三个倍你的荧光蛋白记者（约27 kDa）。我们使用两个副本的mNeonGreen超过被动运输的限制（±50 kDa）。
b. NESpki2含有K到P的突变(MSLNELALPLAGLDI)，削弱了原有的NESpki导出信号。因此，导入和导出之间的平衡向导入转移，报告器主要定位在细胞核内。
c. 因为Schmid-Burgk协议不是基于微组学（Schmid-Burgk et al., 2016)，与1和2相比，这是效率最低的敲入协议。此外，完整的供体质粒集成在Hela京都AAVS1位点在这个协议。Sakuma协议（Sakumaet al., 2016)具有最高的基因敲入效率，但却是最难克隆的协议。

2. 稳定的细胞系生成（使用的质粒见图3）。
所有步骤中使用的细胞培养基由补充有10％胎牛血清（FBS）和50微克/毫升庆大霉素的Gibco DMEM培养基组成。
a. 第1天：在6孔板中播种10万个Hela京都细胞。
b. 第2天：
协议1：使用Lipofectamine 3000（赛默飞世尔科技）共同转染这些细胞。加入500纳克各自的pcDNA3.1-供体质粒（图3A），1000纳克表达Cas9的质粒加上针对AAVS1位点的gRNA（GTCACCAATCCTGTCCCTAG）（图3D）和500纳克表达gRNA（GCCAGTACCCAAAAAGCGGG）的质粒，该质粒在两个位点上切割报告质粒，以切除盒（图3E）。
协议2：使用Lipofectamine 3000（赛默飞世尔科技）共同转染这些细胞。加入500纳克的盒式PCR供体产物（图3B）和1000纳克表达Cas9的质粒加上针对AAVS1位点（GTCACCAATCCTGTCCCTAG）的gRNA（图3D）。
协议3：使用Lipofectamine 3000（赛默飞世尔科技）共同转染这些细胞。添加500纳克各自的pGL4-供体质粒（图3C），1000纳克表达Cas9的质粒加上针对AAVS1位点的gRNA（GTCACCAATCCTGTCCCTAG）（图3D）和500纳克表达gRNA（GCCAGTACCCAAAAAGCGGG）的质粒，在一个位点切割报告质粒，以线性化供体质粒（图3E）。
提示：包括一个阴性对照条件，通过省略供体质粒表达Cas9/gRNA在一个孔中。
c. 第三天：更换培养基，限制转染试剂引起的毒性。
d. 第4天：胰蛋白酶法转染的细胞，并用嘌呤霉素（1微克/毫升）进行选择。
e. 在接下来的日子里，分析板的离散菌落，开始出现。
提示：为了排除瀑布阳性：确保只有当所有的细胞都死在阴性对照（没有供体质粒）继续。此外，在接下来的日子里，用抗生素保持细胞的选择。
f. 当6孔与该多克隆细胞混合物完全汇合时，可种植单克隆细胞。因此，在96孔板中以0.5个细胞/孔的密度播种细胞。这可以通过以下方式实现。
i. 取下培养基，用1毫升的1x PBS洗细胞。
ii. 移去PBS，每孔加入500微升0.05%的胰蛋白酶。返回孵化器中5分钟。
iii. 确认细胞分离。如果没有，将细胞再次在孵化器中几分钟，直到他们做。
iv. 每孔加入1.5毫升介质。重要的是吸管上下混合，并获得单细胞。测量获得的细胞数。
v. 进行1/100稀释（10微升到990微升的培养基），以方便下一步的操作。搅拌均匀。
vi. 加入含有50个细胞的体积到10毫升培养基（10毫升是足够一个96孔板）。
vii. 每孔加入100微升，以获得0.5个细胞/孔的浓度。因此，大多数孔将有零或一个细胞，少量含有两个或多个细胞。
提示：在左上角播种较高的密度（如，1000个细胞/孔）。因此，它将更容易找到正确的焦点在显微镜上，当你搜索殖民地。
g. 扫描板五天后的单克隆菌落的形成。不要包括包含两个（或更多）独立的菌落的井，因为他们很可能从一个以上的细胞产生，因此不会导致单克隆培养。
小贴士注意井的两侧，因为细胞往往会附着在那里。
h. 当96孔完全充满，扩大单克隆培养。
小贴士：从T-25培养瓶开始逐步扩大。
i. 在液氮中长期储存之前，将细胞冻结在-80℃。可采用以下方法：
i. 准备冷冻培养基（共10毫升：8.2毫升培养基+800微升DMSO+1毫升FBS）。将培养基放在冰上，因为DMSO在室温下对细胞是有毒的。
ii. 给冷冻管贴上标签，并在冰上预冷。
iii. 取下培养基，用1x PBS清洗细胞。
iv. 取出PBS，加入0.05％胰蛋白酶。返回到孵化器中5分钟。
v. 确认细胞分离。如果没有，返回细胞到孵化器几分钟，直到他们做。
vi. 加入培养基以抑制胰蛋白酶，并将所有东西带入50毫升管中。
vii. 计数细胞。
viii. 在500 rcf下旋转5分钟。
ix. 取出上清液，并在预先制作的冷冻培养基中重悬颗粒。每1.5×106-2×106细胞加入1毫升。
x. 移液器1毫升的冷冻介质在每个预冷的冷冻管。
xi. 放置管在-80℃，借助Mr.FrostyTM冷冻容器。
xii. 对于长期储存，第二天将样品移到液氮容器中。

图3.用于生成报告细胞系的质粒。用于生成报告细胞系的质粒。A.供体质粒含有协议1中使用的记者NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki。B.含有报告者NESpki2-mNeongreen2x-NLSFUS的质粒，它作为协议2中进行的PCR反应的模板。NESpki2*含有K到P的突变。C.供体质粒含有协议3中使用的报告NLScMYC-AcGFP2x-NESikb2。D.协议1、2和3中使用的表达Cas9的质粒加上靶向AAVS1位点的gRNA（Schmid-Burgk等人，2016）。E.在协议1和3中使用的表达gRNA的质粒来裂解含有记者的供体质粒（Schmid-Burgk等人，2016）。
3. 验证
注意：验证您的记者很重要。可以通过以下方式进行验证：
(1) 用现有的化合物处理你的细胞，例如，瘦肉精B抑制XPO1介导的导出(Kudo等人，1999)或importazole抑制KPNB1介导的导入(Soderholm等人，, 2011)1999)。
(2) 转染你的细胞与适当的构建体，如，M9M的表达，以抑制TPNO1/TPNO2（Cansizoglu等人，2007）。
(3) 敲除靶向运输受体，例如，针对KPNB1或KPNA2的siRNA。

注：在所有步骤中使用的细胞培养基由Gibco DMEM培养基补充10％FBS和50微克/毫升庆大霉素。
a. 用瘦肉精B验证XPO1介导的出口。
i. 第1天：种子NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki报告细胞的密度，以获得60-70％汇合的第二天。
ii. 第2天：改变井中一半的培养基，以获得最终浓度为50 nM的XPO1抑制剂瘦肉精B（工藤 et al., 1999)。
iii. 返回细胞到孵化器30分钟。
iv. 用4％PFA固定细胞15分钟。
v. 用1x PBS洗涤细胞三次。
vi. 染色核使用NucBlue活细胞染色试剂（Invitrogen）。
vii. 图像细胞，以确认增加的核定位的记者在瘦肉精B处理的细胞（图4）。

图4.验证XPO1介导的出口。XPO1介导的出口的验证。表达记者NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki的细胞的代表图像。A.在稳定状态下，记者定位在细胞的细胞质中。B.添加XPO1抑制剂leptomcyin B (LMB)导致记者的核定位。比例尺=20 µm。

b. 用importazole验证KPNB1/KPNAx介导的导入。
i. 第1天：种子NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki报告细胞的密度，以获得60-70％汇合的第二天。
ii. 第2天：用50μM的KPNB1抑制剂importazole（Soderholm et al., 2011)。
iii. 改变一半的培养基在井中，以获得50 nM瘦肉精B的最终浓度。
注：记者在细胞质中定位稳定状态（由于XPO1介导的出口），因此，与XPO1抑制剂（瘦肉精B）结合使用，作为KPNB1/KPNAx介导的进口-记者。
iv. 将细胞返回到培养箱中，30分钟后用4％PFA固定细胞。
v. 用1x PBS洗涤细胞三次。
vi. 染色核使用NucBlue活细胞染色试剂（Invitrogen）。
vii. 图像细胞，以确认在importazole处理的细胞（图5）的记者的核定位减少。

图5.验证KPNB1/KPNAx介导的导入。KPNB1/KPNAx介导的导入的验证。表达记者NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki的细胞的代表图像。A.加入瘦肉精B的结果在核定位的记者，由于KPNB1 / KPNNAx介导的进口。B. 用importazole预孵育部分取消KPNB1/KPNAx介导的导入。比例尺=20 µm。

c. 通过M9M表达验证TPNO1/TPNO2-介导的导入。
i. 第1天：种子NESpki2-mNeongreen2x-NLSFUS报告细胞的密度，以获得60-70％汇合的第二天。
ii. 第2天：用表达多肽M9M（Cansizogluet al., 2007)使用lipofectamine 3000（赛默飞世尔科技）的质粒转染细胞。
注：表达M9M与荧光蛋白（如，红色荧光蛋白）融合，以识别转染细胞。
iii. 转染后4小时更换培养基以降低毒性。
iv. 孵育细胞过夜。
v. 第3天：用4%PFA固定细胞15分钟。
vi. 用1x PBS洗三遍。
vii. 染色核使用NucBlue活细胞染色试剂（Invitrogen）。
viii. 图像细胞，以确认在M9M表达的细胞（图6）的记者的核定位减少。

图6.验证TPNO1/TPNO2-介导的导入。验证TPNO1/TPNO2-介导的导入。表达记者NESpki2-mNeongreen2x-NLSFUS的细胞的代表图像。A.在稳定状态下，记者定位在细胞核内，由TPNO1/TPNO2-介导的导入引起。记者细胞转染了mCherry-plasmid作为阴性对照。B. 用RFP-M9M-质粒转染的报告者细胞，该质粒抑制TPNO1/TPNO2-介导的导入，导致报告者的细胞质重新分布。比例尺=20 µm。

d. 验证KPNB1/KPNAx通过KPNB1/KPNA2-knock down介导的导入。
i. 第1天：种子NLScMYC-AcGFP2x-NESikb2报告细胞的密度，以获得60-70％汇合的第二天。
ii. 第2天：用针对KPNB1或KPNA2的siRNA对细胞进行电穿孔（Horizon Discovery siRNA重悬缓冲液，Bio-Rad公司：230V，950 µF，∞Ω，10 000 ms，#1脉冲）。
iii. 孵育细胞48小时。
iv. 用4％PFA固定细胞15分钟。
v. 用1x PBS洗三遍。
vi. 染色核使用NucBlue活细胞染色试剂（Invitrogen）。
vii. 图像细胞，以确认减少核定位的记者（图7）。

图7.验证KPNB1/KPNAx介导的导入。KPNB1/KPNAx介导的导入的验证。表达记者NLScMYC-AcGFP2x-NESikb2的细胞的代表图像。A.记者定位稳态在细胞核中，由于KPNB1/KPNAx介导的导入。B. 靶向KPNB1或KPNA2的siRNA表达导致记者的细胞质定位。比例尺=25 µm。

4. NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki报告器的优化设计。
在稳定状态下，NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki记者定位在细胞的细胞质中(由XPO1介导的核输出引起)，因此，与XPO1抑制剂(瘦肉精B;LMB)结合使用，作为KPNB1/KPNAx介导的导入记者。
注：由于核强度的结果从出口和进口之间的平衡，重要的是要优化LMB浓度，以最大限度地提高测定的灵敏度，以测量进口赤字。此外，为了最大限度地减少变异性，建议与LMB浓度，诱导记者的逐步进口，并允许进口测量发生在较长的时间（30分钟）。此外，建议至少测量两个不同的时间点，以确保您的测量属于核进口过程的动态范围内，尚未达到饱和。

注：在所有步骤中使用的细胞培养基由Gibco DMEM培养基补充10％FBS和50微克/毫升庆大霉素。
a. 第1天：种子NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki报告细胞在96孔板的密度，以获得70％汇合的第二天。
注意：请记住，你需要三个不同的时间点，这在每个条件下一式两份或三份。
b. 第2天：用100微升含有25μM的KPNB1抑制剂importazole的培养基替换旧培养基。
c. 将细胞返回到培养箱中1.5小时。
注：importazole浓度的选择，目的是诱导平均进口抑制，以不错过潜在的小进口赤字诱导的多PR。
d. 同时，制备不同稀释的LMB（溶解在乙醇中）在预热的培养基中的终浓度为0 nM，15 nM，30 nM，45 nM，60 nM，75 nM和90 nM。涡流。
注意：请记住在接下来的步骤中的稀释。因此，准备两倍的最终浓度，例如，120 nM的最终浓度为60 nM。
e. 处理打算30分钟的时间点与不同浓度的LMB的细胞，通过添加100微升的含有LMB的培养基到100微升的培养基已经在井中。
f. 返回细胞到孵化器15分钟。
g. 通过加入100微升的含有LMB的培养基，用不同浓度的LMB处理打算15分钟时间点的细胞。
h. 返回细胞到孵化器15分钟。
i. 用4%PFA固定15分钟。
j. 用1x PBS洗涤细胞三次。
k. 染色核使用NucBlue活细胞染色试剂（Invitrogen）。
l. 细胞可以通过CellInsight CX5高含量筛选平台（赛默飞世尔科技公司）自动分析，以确定诱导对照细胞和importazole处理细胞之间的最大差异的LMB浓度（图8）。
注意：使用多通道移液器以减少变异性。

图8.优化KPNB1/KPNAx介导的NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki记者的导入，随着时间的推移测量。优化KPNB1/KPNAx介导的NLSSV40-mNeongreen2x-NESpki报告的导入随时间的测量。A-B。进口importazole处理的细胞相对于进口DMSO处理的细胞不同浓度的瘦肉精B（LMB）。A-15分钟;B-30分钟。A.45 nM的LMB导致对照细胞和用importazole处理的细胞之间的最强差异。B.较低的浓度允许测量导入抑制，因为导入变得饱和在这个较高浓度的LMB较晚的时间点。C.左图：较低浓度（例如，30 nM）的LMB导致较少的整体导入，因此更难观察到15分钟后受干扰的导入。进口缺陷可以在以后的时间点（30分钟）观察到。中图。45 nM的LMB在两个时间点都显示出导入缺陷。右图：更高浓度的LMB（例如，90 nM）可以推动进口太难观察到进口的最小障碍。A-B。点代表一个实验的平均值，每个实验有2500-7000个细胞。平均值+S.D.C.点代表一个实验的平均值，每个实验2500-7000个细胞。

B. M 在存在突变的C9orf72相关肽的情况下，确保核细胞质的运输。
1. 表达突变的C9orf72相关肽的慢病毒载体的制作。
DPR100-质粒是伊藤大介博士（日本东京庆应义塾大学神经学系）的友好礼物。经典的PCR 被用来克隆mCherry-DPR100构建体到慢病毒载体质粒（LentiCrisprV2_Puro从Addgene）（图9）。使用HEK-293T细胞生产慢病毒载体，如前所述(Hart et al., 2017)。
注意：我们强烈建议使用转导而不是转染来表达所需的疾病相关的结构。转染是更多的压力，这可能会影响核细胞质运输测量。

图9.用于表达mCherry或mCherry-PR100的慢病毒载体质粒。用于表达mCherry或mCherry-PR100的慢病毒载体质粒。A.含有mCherry的慢病毒载体。B.含有mCherry-PR100的慢病毒载体。

2. 化验
注：在所有步骤中使用的细胞培养基由Gibco DMEM培养基补充10％FBS和50微克/毫升庆大霉素。
a. 通过细胞和种子到盖板玻璃上
i. 第0天：使用无菌镊子将单个盖玻放入无菌24孔聚苯乙烯组织培养板的每个孔中。
注：
(1) 预涂盖玻片与聚L-赖氨酸和聚L-鸟氨酸或其他细胞表面处理可能是必要的，以坚持其他类型的细胞到玻璃。Hela Kyoto细胞无需额外的涂层就能粘附在玻璃上。
(2) 对于高通量筛选，细胞可以被播种到96孔板或其他格式。
(3) 请记住，你将需要三个不同的时间点，这在每个条件下一式两份或三份。
ii. 种子的密度，将导致在70％的汇合，在你计划执行核细胞质运输测定的日子。
iii. 在组织培养箱中孵育细胞过夜（37℃，5％的二氧化碳）。
b. 转导细胞表达C9orf72相关的多肽
i. 第1天，在培养基中稀释聚丙烯，最终浓度为10微克/毫升。在培养基中稀释聚丙烯，最终浓度为10微克/毫升。将慢病毒颗粒添加到每个孔中。让病毒颗粒在细胞上过夜（约18小时）。
ii. 第2天：取出含有慢病毒的培养基，换上新鲜的DMEM培养基。
iii. 孵育细胞在组织培养箱（37℃，5％的CO 2）额外的两天。
注：添加聚丁烯可以显著提高转导效率。然而，首先确认polybrene对你的细胞没有毒性，因为它可以诱导某些细胞类型（例如，iPSC衍生的神经元）的细胞死亡。
c. 测量核细胞质运输
i. 第5天：准备一个所需体积的预热培养基，含有45 nM LMB。
ii. 用含有LMB的培养基处理打算30分钟时间点的细胞。
iii. 返回细胞到孵化器15分钟。
iv. 用含有LMB的培养基处理打算15分钟时间点的细胞。
v. 返回细胞到孵化器15分钟。
vi. 通过添加4％PFA（最终浓度）到培养基中固定细胞15分钟。
vii. 染色核使用NucBlue活细胞染色试剂（Invitrogen）。
viii. 使用20微升移液器将一滴安装介质放在载玻片上，然后用镊子将盖玻片倒置在载玻片上。用纸巾去除多余的装片介质，并使用指甲油密封载玻片。
ix. 使用共聚焦显微镜（图10）成像细胞。
注：
(1) 切记在不同条件下要保持相同的设置，并将重点放在核的中间（核仁清晰可见）。
(2) 对于高通量筛选，强度可以通过使用高含量分析仪（如赛默飞世尔科技的CellInsight CX5高含量筛选平台）自动分析。

图10.测量KPNB1/KPNAx介导的导入随着时间的推移在神经退行性相关背景下。测量KPNB1/KPNAx介导的进口随着时间的推移在神经退行性相关的背景下。表达记者NLSsv40-mNeongreen2x-NESpki的细胞的代表图像。记者定位在细胞质中的稳定状态，作为XPO1介导的核出口的结果。添加XPO1抑制剂（瘦肉精B; LMB）允许测量KPNB1/KPNAx介导的进口随着时间的推移。A.Reporter细胞用mCherry-慢病毒载体转导作为对照。B.用poly-PR100-mCherry-慢病毒载体转导的报告者细胞。Poly-PR二肽与神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症有关。比例尺=20 µm。

数据分析

A. 指南
1. 图片J
在共聚焦显微镜上拍摄的图像可以手动分析与免费在线可用的软件ImageJ。
a. 在ImageJ中导入图片。
注：建议分析64位格式的图像。
b. 选择感兴趣的区域+Ctrl M（图11）。

图11.在ImageJ中手动分析。图像是代表性的NLSsv40-mNeongreen2x-NESpki报告细胞添加LMB和转染mCherry之前。图中包含图10的图像分析数据。平均值±S.D.显示。

B. 自动
1. 细胞剖析仪
共聚焦显微镜上成像的细胞可以自动分析与免费在线可用的软件细胞剖析器（图12）。

图12.Cell profiler自动分析的工作流程在Cell profiler自动分析的工作流程。图像是代表NLSsv40-mNeongreen2x-NESpki报告细胞添加LMB和转染mCherry之前。图包含从图10的图像的分析数据。平均值±S.D.显示。

统计分析
1. 我们建议分析核与总（=细胞质+核）的比值，因为核与细胞质的比值可能容易出现较大的变化。核与细胞质值之间的差异可能会变得非常大，特别是在添加LMB（核强度非常低）之前或在检测结束时（细胞质强度非常低）。此外，当数据必须归一化为初始强度时，核强度和细胞质强度的微小差异可能会造成比值的巨大差异。
2. 比值本质上是不对称的，也就是说，所有的减少都表示为0和1之间的比值，所有的增加都表示为大于1.0的比值。因此，我们建议分析比率的对数。因此，没有变化将是零（1.0的对数），增加将是正数，减少将是负数。

鸣谢

我们感谢Liesbeth Mercelis和Bob Massant的技术援助。这项工作得到了鲁汶大学（C1和开放未来基金）的支持，弗兰德斯科学研究基金（FWO-Vlaanderen GOB3318N - G098314N），ALS Liga（比利时）。J.V.是FWO的博士研究员。P.V.D.是FWO-Vlaanderen的高级临床研究员，并得到Een hart voor ALS基金和Laevers ALS研究基金的支持。

竞争性利益

提交人声明他们没有财务和非财务竞争利益。

参考文献

1. Arai，T.，Hasegawa，M.，Akiyama，H.，Ikeda，K.，Nonaka，T.，Mori，H.，Mann，D.，Tsuchiya，K.，Yoshida，M.，Hashizume，Y.和Oda，T.（2006）。TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.Biochem Biophys Res Commun 351(3): 602-611.
2. Ash, P. E., Bieniek, K. F., Gendron, T. F., Caulfield, T., Lin, W. L., Dejesus-Hernandez, M., van Blitterswijk, M. M., Jansen-West, K., Paul, J. W., 3rd, Rademakers, R., Boylan, K. B., Dickson, D. W. and Petrucelli, L. (2013).Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.Neuron 77（4）：639-646。
3. Boeynaems，S.，Bogaert，E.，Van Damme，P.和Van Den Bosch，L.（2016）。Inside out: the role of nucleocytoplasmic transport in ALS and FTLD.Acta Neuropathol 132（2）：159-173。
4. Cansizoglu, A. E., Lee, B. J., Zhang, Z. C., Fontoura, B. M. and Chook, Y. M. (2007).Structure-based design of a pathway-specific nuclear import inhibitor.Nat Struct Mol Biol 14(5): 452-454.
5. Fahrenkrog, B. and Harel, A. (2018).Perturbations in traffic: aberrant nucleocytoplasmic transport at the heart of neurodegeneration.Cells 7（12）. DOI：10.3390/cells7120232。
6. Geisinger, J. M., Turan, S., Hernandez, S., Spector, L. P. and Calos, M. P.(2016).In vivo blunt-end cloning through CRISPR/Cas9-facilitated non-homologous end-joining.Nucleic Acids Res 44（8）：e76.
7. Hart, T., Tong, A. H. Y., Chan, K., Van Leeuwen, J., Seetharaman, A., Aregger, M., Chandrashekhar, M., Hustedt, N., Seth, S., Noonan, A., Habsid, A., Sizova, O., Nedyalkova, L., Climie, R., Tworzyanski, L., Lawson, K., Sartori, M. A., Alibeh, S., Tieu, D., Masud, S., Mero, P., Weiss, A., Brown, K. R., Usaj,Sartori，M. A.，Alibeh，S.，Tieu，D.，Masud，S.，Mero，P.，Weiss，A.，Brown，K. R.，Usaj，M.，Billmann，M.，Rahman，M.，Constanzo，M.，Myers，C. L.，Andrews，B. J.，Boone，C.，Durocher，D.和Moffat，J.（2017）。Evaluation and design of genome-wide CRISPR/SpCas9 knockout screens.G3（Bethesda）7（8）：2719-2727。
8. Hutten, S. and Dormann, D. (2019).Nucleocytoplasmic transport defects in neurodegeneration - Cause or consequence?Semin Cell Dev Biol S1084-9521（18）.301090-301093.
9. Kudo, N.、Matsumori, N.、Taoka, H.、Fujiwara, D.、Schreiner, E. P.、Wolff, B.、Yoshida, M.和Horinouchi, S.（1999年）。Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region.Proc Natl Acad Sci U S A 96(16): 9112-9117。
10. Kwiatkowski, T. J., Jr., Bosco, D. A., Leclerc, A. L., Tamrazian, E., Vanderburg, C. R., Russ, C., Davis, A., Gilchrist, J., Kasarskis, E. J., Munsat, T., Valdmanis, P., Rouleau, G. A., Hosler, B. A.。Cortelli, P., de Jong, P.J., Yoshinaga, Y., Haines, J.L., Pericak-Vance, M.A., Yan, J., Ticozzi, N., Siddique, T., McKenna-Yasek, D., Sapp, P.C., Horvitz, H.R., Landers, J.E. and Brown, R.H., Jr. (2009).(2009).16号染色体上FUS/TLS基因的突变导致家族性肌萎缩性侧索硬化症。科学》323(5918): 1205-1208。
11. Lange, A., Mills, R. E., Lange, C. J., Stewart, M., Devine, S. E. and Corbett, A. H. (2007)。经典的核定位信号：定义、功能和与导入素α的相互作用。J Biol Chem 282(8): 5101-5105.
12. Majounie, E., Renton, A. E., Mok, K., Dopper, E. G., Waite, A., Rollinson, S., Chio, A., Restagno, G., Nicolaou, N., Simon-Sanchez, J., van Swieten, J. C., Abramzon, Y., Johnson, J. O., Sendtner, M., Pamphlett, R., Orrell, R. W.,Mead，S.，Sidle，K.C.，Houlden，H.，Rohrer，J.D.，Morrison，K.E.，Pall，H.，Talbot，K.，Ansorge，O.，Chromosome，A.L.S.F.T.D.C.，French research network on，F.A.，Consortium，I.，Hernandez，D.G.，Arepalli，S.，Sabatelli，M。Mora，G.，Corbo，M.，Giannini，F.，Calvo，A.，Englund，E.，Borghero，G.，Floris，G.L.，Remes，A.M.，Laaksovirta，H.，McCluskey，L.，Trojanowski，J.Q.，Van Deerlin，V.M.，Schellenberg，G.D.，Nalls，M.A.，Drory，V.E.，Lu，C.S.。Yeh，T. H.，Ishiura，H.，Takahashi，Y.，Tsuji，S.，Le Ber，I.，Brice，A.，Drepper，C.，Williams，N.，Kirby，J.，Shaw，P.，Hardy，J.，Tienari，P. J.，Heutink，P.，Morris，H. R.，Pickering-Brown，S.和Traynor，B. J.（2012）。C9orf72 hexanucleotide repeat expansion in patients with amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia: a cross-sectional study.Lancet Neurol 11（4）：323-330。
13. Mori, K., Arzberger, T., Grasser, F. A., Gijselinck, I., May, S., Rentzsch, K., Weng, S. M., Schludi, M. H., van der Zee, J., Cruts, M., Van Broeckhoven, C., Kremmer, E., Kretzschmar, H. A., Haass, C.和Edbauer, D. (2013a)。Bidirectional transcripts of the expanded C9orf72 hexanucleotide repeat are translated into aggregating dipeptide repeat proteins.Acta Neuropathol 126（6）：881-893。
14. Mori, K., Weng, S. M., Arzberger, T., May, S., Rentzsch, K., Kremmer, E., Schmid, B., Kretzschmar, H. A., Cruts, M., Van Broeckhoven, C., Haass, C. and Edbauer, D. (2013b).C9orf72 GGGGCC重复在FTLD/ALS中被翻译成聚集性二肽重复蛋白。Science 339(6125): 1335-1338.
15. Neumann，M.，Sampathu，D.M.，Kwong，L.K.，Truax，A.C.，Micsenyi，M.C.，Chou，T.T.，Bruce，J.，Schuck，T.，Grossman，M.，Clark，C.M.。McCluskey, L. F., Miller, B. L., Masliah, E., Mackenzie, I. R., Feldman, H., Feiden, W., Kretzschmar, H. A., Trojanowski, J. Q. and Lee, V. M. (2006).Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis。科学314(5796): 130-133。
16. Ossareh-Nazari, B.、Gwizdek, C.和Dargemont, C.（2001年）。蛋白质从细胞核中输出。Traffic 2(10): 684-689。
17. Ryan, K. J. and Wente, S. R. (2000)。核孔复合体：连接细胞核和细胞质的蛋白质机器。Curr Opin Cell Biol 12(3): 361-371.
18. Sakuma，T.，Nakade，S.，Sakane，Y.，Suzuki，K.T. and Yamamoto，T.（2016）.MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-Cas9 with the PITCh systems.Nat Protoc 11（1）：118-133.
19. Schmid-Burgk, J. L., Höning, K., Ebert, T. S. and Hornung, V. (2016).CRISPaint allows modular base-specific gene tagging using a ligase-4-dependent mechanism.Nat Commun 7: 12338.
20. Soderholm, J. F., Bird, S. L., Kalab, P., Sampathkumar, Y., Hasegawa, K., Uehara-Bingen, M., Weis, K. and Heald, R. (2011).Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β。ACS Chem Biol 6（7）：700-708。
21. Stoffler, D., Fahrenkrog, B. and Aebi, U. (1999)。核孔复合体：从分子结构到功能动力学。Current Opinion Cell Biology 11（3）：391-401。
22. Tyzack, G. E., Luisier, R., Taha, D. M., Neeves, J., Modic, M., Mitchell, J. S., Meyer, I., Greensmith, L., Newcombe, J., Ule, J., Luscombe, N. M. and Patani, R. (2019).Widespread FUS mislocalization is a molecular hallmark of amyotrophic lateral sclerosis.Brain 142（9）：2572-2580.
23. Vance, C., Rogelj, B., Hortobagyi, T., De Vos, K. J., Nishimura, A. L., Sreedharan, J., Hu, X., Smith, B., Ruddy, D., Wright, P., Ganesalingam, J., Williams, K. L.,Tripathi, V., Al-Saraj, S., Al-Chalabi, A., Leigh, P. N., Blair, I. P., Nicholson, G., de Belleroche, J., Gallo, J. M., Miller, C. C.和Shaw, C. E. (2009).FUS的突变，一种RNA处理蛋白，导致家族性肌萎缩性侧索硬化症6型。科学》323(5918): 1208-1211。
24. Vanneste，J.，Vercruysse，T.，Boeynaems，S.，Sicart，A.，Van Damme，P.，Daelemans，D.和Van Den Bosch，L.（2019）。C9orf72-generated poly-GR and poly-PR do not directly interfere with nucleocytoplasmic transport.Sci Rep 9(1): 15728.
25. Yuva-Aydemir，Y.，Almeida，S. and Gao，F. B.（2018）.Insights into C9ORF72-Related ALS/FTD from Drosophila and iPSC Models.Trends Neurosci 41（7）：457-469.
26. Zu，T.，Gibbens，B.，Doty，N. S.，Gomes-Pereira，M.，Huguet，A.，Stone，M. D.，Margolis，J.，Peterson，M.，Markowski，T. W.，Ingram，M. A.，Nan，Z.，Forster，C.。Low, W. C., Schoser, B., Somia, N. V., Clark, H. B., Schmechel, S., Bitterman, P. B., Gourdon, G., Swanson, M. S., Moseley, M. and Ranum, L. P. (2011).Non-ATG-initiated translation directed by microsatellite expansions.Proc Natl Acad Sci U S A 108（1）：260-265。