材料和试剂
1. 100 mm x 20 mm细胞培养皿（取芯，货号：430167）
2. 1.5 ml微量离心管
3. D型一次性注射器过滤器（Millipore，目录号：SLGP033RB ）
4，聚偏二氟乙烯（PVDF）转移膜（Thermo Scientific，目录号：88518）
5. H K-2 细胞（  空中交通管制，目录号：CRL-2190）
6. Pierce交联免疫沉淀试剂盒（ Thermo Scientific ，目录号：26147）
7. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（ Gibco，货号：11885084 ）
8. 胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10099141 C）
9. 棕榈酸（PA）（西格玛，目录号：P5585）
10. 牛白蛋白（BSA）（ Solarbio ，目录号： A8850）
11. 停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Thermo Scientific，目录号：78442 ）
12. 磷酸盐缓冲盐水（ PBS）（Solarbio ，目录号：P1020 ）
13. 鼠标- 乙酰赖氨酸抗体（Abcam，目录号：ab22550）
14. 兔LCAD抗体（Proteintech ，目录号： 17526-1-AP）
15. 兔β-HAD抗体（西格玛，目录号：HPA037539）
16. 兔COXIV抗体（Proteintech ，目录号：11242-1-AP）
17. 抗兔IgG HRP二抗结合抗体
18. 甘氨酸（小号olarbio ，货号： G8200 ）
19. 十二烷基硫酸钠（SDS）（S olarbio ，目录号：S8010 ）
20. 过硫酸铵（APS）（S olarbio ，目录号：A8090 ）
21. -N，N ，N”，N'- 四甲基乙二胺（TEMED）（Invitrogen公司，目录号：15524010 ）
22 Tween-20（Solarbio ，目录号：T8220）
23. 特里斯（Solarbio ，目录号：T8060）
24. 1.5 中号三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS -HC 升）（pH值8.8）（Solarbio ，目录号：T1010）
25. 1.0M的三（羟甲基）氨基甲烷（三- HC 升）（pH6.8）中（Solarbio ，目录号：T1020）
26. 30％丙烯酰胺（Solarbio ，货号：A1010）
27. 双辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒（Beyotime ，目录号：P0012S）
28岁 Immobilon Western化学发光HRP底物（密理博（Millipore），目录号：WBKLS0050）
29. 甲醇（中国天津开通）
30岁氯化钠（中国天津开通）
31. 12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离凝胶（10 ml）（请参阅食谱）
32. SDS-PAGE堆积凝胶（4毫升）（请参阅食谱）
33. 1 X TBST甲烷（Tris-H Ç 升，氯化钠，Ť 吐温20）（见配方）
34. 2.5％BSA （请参阅食谱）
35. 10 mM PA（PA储备溶液）（请参阅食谱）
36. 200 μ 中号PA （见配方）

设备
离心机（Eppendorf，目录号：5810R）
P1000移液器（Eppendorf，目录号：3111000858）
P200移液器（Eppendorf，货号：3111000840）
P20移液器（Eppendorf，目录号：3111000823）
P10移液器（Eppendorf，目录号：3111000815）
转子
台式摇杆（HEIDOLPH，目录号：Titramax 101）
分光光度计
印迹和凝胶成像仪（通用电气公司，目录号：Amersham Imager 680）

程序
制备细胞
在100 x 20 mm细胞培养皿中平板培养细胞。培养细胞具有10％FBS的DMEM（Fujiki 等。，2019; 纪尧姆·卡诺（Guillaume Canaud）等。，2019 ; Das 等。，2020 ）和200 μM PA在一个37°C 的5％CO 2的加湿气氛。

程序免疫沉淀

细胞裂解
小心丢弃细胞中的培养基。
用4 ml预装的PBS 轻轻清洗细胞一次。
用预冷的细胞裂解 IP裂解/洗涤缓冲液（IP试剂盒）冰上含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂持续10分钟。
注意： 500 微升裂解缓冲液用于1个100 毫米X 20 MM细胞培养皿。
将裂解液收集到1.5 ml微量离心管中，并继续在冰上裂解20分钟。
注意：每10分钟混合一次以确保完全裂解。
在13,000 x g （4°C）下离心20分钟。
将上清液收集到新的试管中并丢弃细胞碎片。
使用BCA蛋白质检测试剂盒和分光光度计检测细胞裂解液的蛋白质浓度。准备1毫克蛋白质用于IP和30 μ 克蛋白质进行输入。
注意： BCA测定的STD曲线的范围是50-2 ，000 微克/毫升，一个第二样品的ODS中落在STD曲线的末端。
澄清前细胞裂解液
加将80μl 的对照琼脂糖树脂浆液加入离心柱中。
注意：使用前请轻轻摇动对照琼脂糖树脂瓶。对于1 毫克的细胞裂解液，请使用80 μ升的控制琼脂糖树脂。对照琼脂糖树脂的体积与细胞裂解液的质量成正比。
在1,000 x g ，4°C下离心1分钟以除去存储缓冲液。
加100 微升1×偶联缓冲液的柱，离心机在1000 X 克，4℃下1分钟，并弃去流过。
加 1 mg细胞裂解液至含有树脂和在旋转器上于4°C孵育1 h。
在1,000 x g ，4°C下离心1分钟，收集流入新管并将其放在冰上以备后用。
注意：树脂和色谱柱来自IP套件。
抗体结合蛋白A / G和琼脂糖
加入20 微升的蛋白A / G PLUS琼脂糖树脂（IP包）的成旋转柱。地点列到离心管中并离心以1 ，000 X 克，4℃下1分钟。丢弃流通物。
注意：在使用前，轻轻旋转瓶子的Pierce Protein A / G Plus琼脂糖。
用200洗涤琼脂糖树脂两次 μ升1的X 偶联缓冲液和每次洗涤后，以1，000 x g ，4°C 离心1分钟。丢弃低通。
加 10 μ升（1 μ 克/ μ 升）小鼠乙酰基-赖氨酸的抗体，5 μ 升20的X 偶联缓冲液和85 μ 升的将超纯水加到色谱柱中的树脂上。对正常的小鼠IgG对照进行相同的操作。
在旋转器中孵育室温下 60分钟。
以1,000 x g 离心，在4°C下放置1分钟，并丢弃流通液。
抗原免疫沉淀
在乙酰赖氨酸中加入1 mg细胞裂解物抗体在柱中交联树脂。
注意：蛋白裂解物的体积是更好地300之间微升和600 微升。
在旋转器中于4°C 孵育过夜。
离心机在1,000 x g ，4°C下放置1分钟，并丢弃流通液。
加200 μ 升的IP裂解液/洗涤缓冲液以洗涤样品，在1,000 x g ，4°C下离心1分钟，并丢弃流通液。重复此洗涤一次。
抗原洗脱
加入30μl洗脱缓冲液（IP试剂盒），在室温下孵育5分钟。
以1,000 x g 离心4 °C 1分钟，收集流通量。
将流通液（步骤B5b ）添加到色谱柱中，然后再次离心。收集流量（IP样本）。
W 酯印迹分析的样品前处理
向样品中添加4 x SDS-PAGE上样缓冲液以制成1 x 最终溶液。
将IP样品和输入样品在100 °C下加热5分钟以使蛋白质变性。
蛋白质印迹分析程序
准备 12％SDS-PAGE凝胶。
负载30 每微型凝胶微克蛋白很好。在80电压下运行凝胶30分钟，然后在120电压下运行45分钟。
在室温下在冰/水浴中以100电压，约60分钟的湿转移条件将凝胶的蛋白质转移到PVDF膜上。
在室温下用5％脱脂牛奶封闭膜1小时。
在室温下用TBST清洗膜5分钟。
用抗LCAD抗体孵育膜（1：1 ，000），抗β-HAD抗体（1：1 ，000）和抗COXIV抗体（1：5 ，000），该稀释剂在2％脱脂上的摇杆乳在4 °C下过夜。
室温下在摇杆上用TBST将膜清洗3次，每次10分钟。
与抗兔IgG HRP-c 二抗结合的抗体在室温下孵育60分钟。
室温下在摇杆上用TBST将膜清洗3次，每次10分钟。
通过增强可视化蛋白质条带化学发光（ECL）（图2 ）。接触时间大约20秒。

图2。乙酰化水平 PA刺激后LCAD和β-HAD升高。通过免疫沉淀和Western印迹检测Ac-LCAD和Ac-β-HAD。IgG组为阴性对照，检测无特异性结合蛋白。以来LCAD和β-HAD是线粒体蛋白，使用内部线粒体参考COX IV对线粒体含量进行标准化。

数据分析
LCAD或β-HAD 的乙酰化水平由乙酰化LCAD与总LCAD或乙酰化HAD与总HAD之比表示。

菜谱
12％ SDS-PAGE separatin 克凝胶（5毫升）
ddH 2 O 1.6毫升
30％丙烯酰胺 2毫升
1.5 M Tris（pH 8.8）1.3毫升
10％SDS 0.05毫升
10％APS 0.05毫升
TEMED 0.002毫升
SDS-PAGE堆积凝胶（2毫升）
ddH 2 O 1.4毫升
30％丙烯酰胺0.33毫升
1.0 M Tris（pH 6.8）0.25毫升
10％SDS 0.02毫升
10％APS 0.02毫升
TEMED 0.002毫升
1 x TBST
Tris 0.606克
氯化钠4.4克
ddH 2 O恒定体积500毫升
吐温20 500 μ升
2.5％牛血清白蛋白
牛血清白蛋白0.25 克
ddH 2 O 10毫升
10 mM PA （PA 储备溶液）
PA 0.025642 克
95％乙醇1毫升
2.5％BSA 9毫升
使用一次性注射器过滤器对溶液进行灭菌
200 μ 中号PA（PA工作荷兰国际集团溶液）
10毫米PA 1毫升
DMEM与10％FBS 49毫升

致谢
这项工作得到了国家自然科学基金（批准号81770729和91749111）和山东省泰山学者计划（批准号tsqn 20161073）的支持。该方案改编自我们之前的工作（Lv 等人，2019）。

利益争夺
作者宣称他们没有利益冲突。

参考文献
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