材料和试剂

纸巾

用于局部场电势电极的玻璃吸管，外径1.5 mm x内径1.1 mm，长7.5 cm的带有内部细丝的硼硅酸盐玻璃吸管（Sutter I仪器，目录号：BF150-110-7.5）
尼龙网（组件供应UMN-600），粘在切片支架的底部
硅胶管（1 / 4-3 / 8，VWR，货号：89403-862），用于连接泵和顶部腔室
一次性移液管（Thermo Scientific，Samco 3.2 ml），用于在培养室和记录室之间进行切片转移
动物
使用野生型小鼠（C57BL / 6J，RRID：IMSR_JAX：000664，Jackson Labs）和转基因5xFAD小鼠（RRID：MMRRC_034840-JAX，Jackson Labs）（Oakley等，2006）。实验小鼠来自我们的乔治敦（Georgetown）殖民地，按标准的12小时光照/黑暗周期饲养，随意提供食物和水，所有实验程序均按照乔治敦大学动物保健和使用委员会的指导进行。超级胶（液态，乐泰，目录号：1775049），用于在切片过程中粘合大脑
蔗糖（ACS R试剂，Fisher Scientific ，目录号：S5-500）
氯化钾（ACS R eagents，Fisher Scientific ，CAS ：7447-40-7）
MgSO 4 （ACS R试剂，Fisher Scientific ，CAS ：7487-88-9）
CaCl 2 （ACS R试剂，Fisher Scientific ，目录号：C79-500）
葡萄糖（ACS R试剂，Sigma-Aldrich ，目录号：G8270-5KG）
NaH 2 PO 4 （ACS R试剂，Sigma-Aldrich ，目录号：S0751-1KG）
HEPES（ACS R代理，Fisher Scientific ，目录号：BP310-1）
NaCl（ACS R试剂，Sigma-Aldrich ，目录号：S5886-10KG）
卡波金（95％氧气2 ，5％CO 2 ，罐和可用的调节器从本地天然气供应商）
NaHCO 3粉末（ACS R试剂，Fisher Scientific ，目录号：S233-500）
切片切割ACSF解决方案（请参阅食谱）
库存1：蔗糖库存2：切割ACSF 库存3：NaHCO 3粉末孵育/记录ACSF（见ř ecipes）

设备

切片准备振动切片机（Leica ，型号VT1000S）

水浴（例如，西南科学，型号：SH W10LD 10升浴）
数字温度计（VWR可追溯双温度计，目录号：23226-656，或任何带0.1的类型° C精度）
图2中所示的定制孵育室由1/4有机玻璃（丙烯酸）板制成，购自McMaster-Carr
从具有1/2 x 1/2 x 1/2格的蛋箱光扩散板切割切片架（e-Plastics SKU：W / EGG.500X2X4）
600毫升玻璃烧杯（VWR ，目录号：89001-078）
需要三台鼓风机（例如，来自亚马逊的气石气瓶气泡扩散器）（两台用于培养室的孵化用气体鼓风机和记录ASCF烧瓶，一台用作记录室中ACSF循环的过滤器）
低压，低流量泵，可通过太阳能微型喷泉/鸟巢套件（Amazon）获得。该泵提供了〜1的流程，000个毫升/分钟，并且使用一个安全的低电压电源（下）
泵的可变直流电源（电路专家CSI5003XE或B＆K Precision 1550直流电源）
小鼠断头手术剪刀（WPI ，目录号：501743G）
弹簧剪刀（WPI ，目录号：15905G），用于穿过颅骨并拔出大脑
尺寸4水彩笔尖刷（办公室仓库596713），用于转移脑片
杜蒙＃7学生钳（精细的小号cience牛逼ools ，目录号：97797-00），用于提取大脑
锥形刮铲（PTFE涂层，VWR ，目录号：10806-412），用于拔除大脑
杜蒙＃5学生镊子（精细小号cience Ť ools ，目录号：91150-20），用于调节在记录室切片位置
用于SWR录制尽管大多数电生理设备都可用于记录SWR，但必须以高循环速率灌注切片的两侧。见Maier等。（2009）和ħ á 。书等。（2009年）修改了补丁记录台上的传统暗室。以下列出的是低成本本地现场电势记录系统的部件。该系统易于使用且可靠，可一次记录多个小时的SWR。局域电位记录室
可灌注切片两侧的腔室很重要。请参阅过程和数据记录部分。图3说明了定制记录室中的流向。 LFP放大器，带有探测头级的1000倍放大（例如，Warner Instruments ，型号：DP 311A）
数据采集系统以数字化的数据（例如，NeuronNexue智能箱，允许多个信道与一个电极阵列）
示波器（例如，Digikey ，用于定位电极2250-SDS1022-ND）
用于放置电极的音频监视器（AM S ystems 3300）
手动微机械手（SD I仪器SKU MX160）和用于固定机械手的磁力架（SD I仪器）
625 nm LED（Thorlabs ，型号：M625D3），用于在腔室下方进行切片照明
移液器拉拔器（Sutter ，型号：P97），用于拉动超低阻抗移液器以进行局部场电势（LFP）记录
LFP记录和刺激电极（由移液器拔出器拉出的低阻抗（〜500K）玻璃移液器）。低电极阻抗（50-500 K ）对于低噪声记录很重要。
用于ACSF循环的蠕动泵（例如，Pulsatron Dolphin系列蠕动计量泵，60.0 gpd / 25 PSI，Norprene管，0.25“ ID x .44” OD）。
用于连接泵和记录室灌注的塑料管（VWR ，目录号：89403-850，3 / 32-5 / 32 Tygon管）
管夹流量调节器（VWR达隆®普通Hosecock夹），对于记录室的调节灌注率
1000 ml玻璃烧瓶，用于循环记录室的ACSF灌注（VWR ，目录号：75804-652）
奥林巴斯，尼康或美国显微镜提供的立体变焦解剖显微镜，10-40倍变焦（SKU：V-SM-3 SD I仪器）
记录台（纽波特，目录号：IG-22-2）

这个2 x 2英尺的光学面包板可以安装在标准实验室工作台上。从SWR记录LFP不需要隔振表。如果使用低阻抗玻璃电极并且在设置的30英寸范围内没有仪器电源线，也可以避免使用法拉第笼。

程序

制备

切片之前，准备两个人工脑脊髓液（ACSF）从储备溶液（在下面的配方部分程序）的解决方案：所述的切削ACSF（200毫升）和温育ACSF（2 ，000毫升）。将两者都用碳气剧烈鼓泡约3分钟。然后将切割ACSF冷却至4 ℃，在冰/水浴中，并温育ACSF温热至32 ℃，在培养装置（见配方细节小号部分）。切片
严格按照NIH指南，严格按照乔治敦大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议使用动物。
通过自由呼吸异氟烷蒸气（> 5％）约20 s，在麻醉罐（由IACUC批准）中对动物进行深度麻醉。完全麻醉后（肌肉张力消失，对尾巴捏紧无反应），用一把外科剪刀将动物迅速断头。
用一把小手术剪刀沿着头皮的中线切开皮肤，露出头骨，然后将头浸入冷的（4°C）ACSF切割溶液中约1分钟。浸入水中时，取出覆盖颅骨的组织以减少隔热。此步骤后，应将大脑冷却至5-10 °C 。
如图1所示，用一把小外科剪刀剪开头骨。使用Dumont＃7镊子去除大脑上方的头骨碎片。从头端开始用刮铲轻轻地抽出大脑，并在约4°C下让大脑滑入切割的ACSF溶液中。
重要提示：确保刮铲的尖端位于大脑腹侧的中线，以避免接触腹颞叶，否则可能导致腹侧海马受压。切削ACSF的温度必须高于0 °C，以避免低温引起的损坏。
图1.用于脑部提取的头骨切割线。红线标记穿过头骨的切口。数字是建议的顺序。切口5不能太深，以确保不会干扰切口下方的皮质组织。在拔脑之前，需要将头部冷却至10 °C以下。只要大脑是冷的，它对于短时间的提取并不是至关重要的。在提取过程中，应注意不要拉伸或压缩海马体。在震动刀切割平台的表面上涂上一层薄薄的超级胶水，以便在平台上粘合大脑。
使用抹刀拿起从切削液中的脑（脑涨的背侧），并使用小片纸巾的从腹侧吸收过量的溶液，然后将脑的腹侧放到吨他切割板的表面涂有超级胶液。
在大脑的背面施加少量压力，以确保大脑和切割台之间牢固的胶粘接触。
现在，将切割台安装在振动切片机上，并用4 °C的切割ACSF填充切割台的腔室。从头端到尾端以水平方向切开大脑。与水平平原之间的倾斜角度为12.7度（在鼻尖处较高），可以更好地保留CA3和CA1区域之间的连接，从而更好地表达SWR（Miyawaki等人，2014）。然而，当在切480-500 μ米，12.7度的倾斜角的并不重要。较厚的切片（> 350 μ米，迈尔等人，2009 ）是用于SWRS的表达很重要。
海马切片（即我们切断488 μ米）在高振动速度（〜70赫兹）和低前述速度（1-2在振动切片机设置）被切割。切割时允许ACSF切割溶液的温度从〜4°C升高到10°C是可以的。如果总切割时间超过30分钟，则需要用碳素起泡，以防止切割溶液的pH值发生变化。
每次切割后，将切片用细刷轻轻转移到培养室中的培养ACSF中，同时注意不要弯曲或压缩组织。在传输之前，可以将整个水平切片（两个半球）修剪成两半。通常，我们从每只动物获得4-5个完整的水平切片（从两侧各取10个海马切片）。
孵化
在恒温装置（图2）中以恒定的流量循环将孵育温度保持在32°C。调整可变电源并保持〜1的比率，000毫升/分钟（3.5-4 V至泵）。流速应不高于1 ，000毫升/分钟，以减少在这可能会导致对组织的机械损伤的溶液运动或浮动的切片。
应在烧杯中以200-400 ml / min的速度不断向鼓泡中通入二氧化碳，以保持ACSF溶液中O 2 / CO 2饱和。
在32 °C下2 h后，将水浴温度降低到27°C，并让ACSF从32°C缓慢冷却到27°C（大约需要1.5 h）。继续孵育直至使用切片。切片在孵育设备中可存活约24小时。

图2 。培养箱的构造。该设备的上部容器是由丙烯酸塑料玻璃制成的流动ACSF容器。容器内部有一个切片保持室（从蛋箱式灯扩散器切下[请参见设备] ）。将切片保持在分开的隔室中（顶视图），然后浸入循环的ACSF溶液中。尼龙网（请参见材料）粘在切片支架上，以实现良好的流通。切片保持器的底侧具有比顶侧更高的流速，其在每个隔室中提供小的向下电流以使切片抵靠网状物稳定。顶部容器中的屏障可保持液位。仪器下方是一个600毫升的玻璃烧杯，它坐在水浴中，水深约6厘米，以保持32 °C的温度。将烧杯中的ACSF以200-400 ml / min的速度连续通入碳素。低压泵（请参阅设备）用于循环ACSF。泵由可变直流电源供电（请参阅设备）。调整泵的电压（3-4 V），使流量达到〜1,000 ml / min（约为泵容量的1/2）。总流体体积是800-1 ，000毫升。盖好上部容器，以减少许多小时后的蒸发和摩尔渗透压浓度变化。 SWR记录
建立孵育/记录ACSF溶液的循环在记录室：将800-1 ，000毫升孵育ACSF入1 ，000个烧瓶中，把烧瓶内的货架上的记录室的水平1-1.5米以上允许重力流通过3 / 32x 5/32 Tygon管将其从烧瓶虹吸到反应室中。气石连接到烧瓶中的油管末端，并用作用于循环的流体过滤器，并用作油管的锚固件，以留在烧瓶的底部。用实验室真空吸尘器或注射器抽吸虹吸管。流量由油管夹调节。正常循环速度为40-100毫升/分钟。从记录室中滴落的液体收集在位于该室下方的100 ml烧杯中，并通过蠕动泵送回烧瓶。我们对ACSF的进，出口流都使用了重力，因为这可以完全消除在运行蠕动泵时挤压管路所产生的静电噪声。烧瓶中的ACSF以50-100 ml / min的速度连续不断地通入碳素，以保持O 2 / CO 2饱和
孵育> 3小时后，SWR逐渐出现。孵育7小时后，大多数切片应从海马的最背侧到腹侧大部分表达SWR。
要将切片放置在记录室中：用流体移液管（将移液管的小端切掉）小心地将切片从培养室移入记录室的中心。切片应通过流体的垂直流动在腔室的中央保持稳定。切片的位置和方向可以通过一对＃5细镊子轻轻调节。要特别注意不要弯曲或压缩组织。对组织的机械干扰可以使SWR停止或衰减几分钟。海马应以其全变焦放大倍数（40 x ）放置在体视显微镜视野的中心。
准备记录电极：使用P-97拉拔器通过5-7次拉动拉低电阻玻璃电极。多个拉导致50-100的电阻ķ欧姆当充满ACSF，和末端开口为约10 μ米。低电阻导致LFP记录的低噪声。
将电极安装到放大器的头级。将电极的尖端插入海马切片顶部上方记录室的液体表面。此步骤无需显微镜即可完成。打开示波器和音频监视器。示波器的基线应该平坦，音频监视器的静电噪声应该很小。基线跳动和较大的音频噪声表明电极填充不良（气泡）。测量电极的电阻，应小于100 K欧姆。
放置电极头的方法：将显微镜的变焦放大倍数调到最小（0.75 x ），并调节焦点以找到电极头。用操纵器调整吸头的位置，以降低吸头的位置，使其接近记录位置（CA1的层半径，图4A）。调整电极时，请始终调整显微镜焦点，以使电极尖端清晰可见。如果电极的尖端不在显微镜的焦点内，切勿移动电极。此时，请勿将尖端插入组织。现在增加显微镜的变焦倍率到2-3 X ，调整焦距找到电极尖端。在高放大倍率下，继续降低电极，直到其位于组织表面上（切片表面和电极头均处于聚焦状态）。现在，在音频监视器中应该可以听到波纹振荡的声音（〜100 Hz ）。
要将电极头插入组织中：缓慢将电极头推进到组织表面。接近组织时，涟漪声变大。当尖端接触组织时，音频监视器中会听到很大的声音。在接触位置，慢慢转动机械手的插入旋钮轴1 / 4-1 / 2圈，其前进尖端90-180 μ米到组织中。请注意，电极的机械干扰会在几分钟内衰减SWR的幅度，因此缓慢的插入非常重要（90秒钟约20秒）μ米提前）。显微镜无法观察到电极头的这种小而缓慢的移动，因此需要通过音频监视器进行引导。后几分钟电极插入UTES，剧烈具有高振幅的SWRS应出现并持续几个小时（图4）。我们通常记录100-200 μ米表面的下方，其中的信号是最大的。
背侧海马的切片的SWR速率比腹侧海马的切片慢得多。仅当切片的两面在浸没式记录室中充分灌注时，SWR才能维持。SWR在常规的单侧灌注室（例如Warner RC-22）中不能很好地表达。
记录期间SWR的维持：在图3所示的两侧灌注室中，SWR可以维持约24小时（图4C，图5）。

图3.录音室。示意图显示了一个定制的记录室，该记录室在切片周围产生了向下的垂直流体流。流动向切片的两侧提供有力的灌注。同样，向下流动可保持切片稳定（无需在切片上施加重量）。我们使用屏障来维持组织顶部的液位。ACSF的出口是重力滴，可显着降低由真空抽吸引入的电噪声。同样，ACSF可以通过蠕动泵收集并再循环。腔室底部的发光二极管（LED）芯片用于提供漫射照明。使用红色LED（630 nm）可以避免表达通道视紫红质2的神经元的光激活。红光还可以增加厚组织的透明度。该腔室很厚，无法安装在复合显微镜上以修补细胞。但是，SWR在常规的单侧灌注室（例如Warner RC-22）中不能很好地表达。确保组织的两侧被灌注孔是非常重要的（ħ á 。书等人，2009 ;迈尔。等人; 2009年Caccavano等人的SWRS到在单元贴片的录音室表达很好，2020）。
图4.年轻和年老小鼠的SWR。A.左：通过超低电阻的玻璃移液管（<100K欧姆，充满生理盐水）从纹状体半径记录SWR ，可提供出色的信噪比。右迹线：在幼小的小鼠中观察到大量的SWR，具有高的尖波振幅（上迹线）和波纹振荡（底部插入物，为清楚起见在60-180 Hz之间过滤）。B.所有测试的老年小鼠（P6月，四分之四）均表达SWR。与幼鼠相比，SWR的振幅和比率更低。C.来自B中同一动物切片的SWR，在储藏室中过夜灌注后记录。虽然幅度和重复率进一步降低，但驻波比的出现率并未出现大的下降。数据分析 SWRs的发生率，LFP振幅和钙信号可以将其与癫痫发作/发作间期峰值区分开来（Li等，2019）。SWR的发生率很高（1-3个事件/秒），而尖峰间的峰值要慢得多（0.3-0.01个事件/秒）。SWR还伴有〜100 Hz的纹波振荡（图4 A插图），但壁尖峰大多伴有低伽马（20-50 Hz）。培养箱中的回收对于SWR表达很重要。根据我们对198个切片的经验，在恢复时间少于2小时的切片中从未见过SWR，但是在恢复时间7小时后才看到。通常，较年轻的小鼠（P28-P35）会更快恢复，并且孵育3-4小时就足够了。年龄较大的小鼠（P60-P180）需要更长的时间才能从切片中恢复，但是5-7小时后，大多数切片显示出SWR。在用GCaMP-6f基因编码的动物中，切割后海马区显示出强烈的绿色荧光，这表明细胞内钙的浓度升高。在培养箱中恢复数小时后，荧光逐渐降低。在常规的烧杯和氧气鼓风机式培养箱中，通常只有一小部分切片可以很好地恢复并表达SWR。传统腔室中的流体循环没有得到很好的控制。当氧气输送的优化程度较低时，组织的活力会随着切片创伤的恢复而下降。如果ACSF循环受到影响，更长的恢复时间不会提高生存能力。为了改善恢复期的流体循环，我们制造了许多定制的培养槽以延长恢复时间。这些腔室的共同特点是通过搅拌棒或泵进行强制循环。我们发现普通蠕动泵不能为容纳2-3只动物的〜26片的大型孵化室提供足够的流量。因此，我们使用了低压直流泵（从太阳能喷泉获得），流量约为1000毫升/分钟。如此高的流量大大改善了ACSF在所有切片周围的循环。更好的氧合还可以使切片在更高的温度（〜32°C）下恢复。该设备为从切割相关的细胞损伤和细胞内钙升高中恢复提供了稳定的条件。我们已经发表了使用厚切片和强制循环的部分工作（Sun等人，2018 ; Jiang等人，2018 ; Li等人，2019）。从旧的（P3-6月）切片的动物也有尽管创伤性脑损伤（未发表的观察），或在动物5XFAD发展淀粉样蛋白斑（表观正常SWR表达制备由这个协议（图4B / C）Caccavano等人。，2020 ）。在大多数切片中，SWR的幅度在记录室中随时间逐渐减小。在记录室中，SWR振幅花了大约5小时才能减小一半（图5）。看来6个月大的老鼠比一百万岁大的老鼠的振幅降低更多。长时间记录后，SWR幅值似乎变化不大。可以看到更多具有相似振幅的S WR（图5）。似乎没有自发SWR的切片在诱发的活动中也表现出较差的表现，例如，当沐浴在含有20mg / mM的卡巴胆碱（20 mM）中时，破伤风刺激（100 Hz x 100脉冲）不能增强和theta-γ振荡的低振幅。ACSF。这些不太可行的切片通常在切割后需要较短的恢复时间（未发表的观察结果）。切片“生存力”的生物标记是一个重要的问题。在此手稿中，如果SWR长时间表达强烈，我们认为切片是可行的。表达SWR需要网络完整性以及突触激发/抑制的平衡（Schlingloff等，2014）。
图5.记录时间和幅度下降。A.连续记录（> 10 h）一片P30动物的SWR振幅。切片后10小时开始记录。SWR振幅在整个周期内逐渐减小。还原速度在5小时内降至一半。B.切割后10和23 h的痕迹。请注意，振幅较小的SWR在数小时后显示出不成比例的减少。在该图中，我们显示从SWR信号纹状体东方明珠Oriens （信号极性从该逆转图4）。菜谱切片ACSF溶液（每个实验200毫升，使用前由两种储备溶液和0.43克NaHCO 3粉末制成）
最终组成：蔗糖（252.0 mM）；氯化钾（3.0毫米）; MgSO 4 （4.0 mM）；CaCl 2 （1.0 mM）；葡萄糖（10.0 mM）; NaHCO 3 （10.0 mM）；NaH 2 PO 4 （1.25 mM）；HEPES（5.0 mM）；充满了生碳素；磷＝ 7.4。库存1：蔗糖 177 g蔗糖，溶于1,000 ml热（65 °C ）蒸馏水中
然后添加蒸馏水至最终体积为2,000 ml
使用前将原料保持在4 °C
2,000 ml储备液可用于10个实验（每个实验180 ml），保持在4 °C且可在一个月内使用。库存2：切割ACSF 按以下顺序将化学品溶解在180毫升蒸馏水中
200毫升试剂（分子量）克氯化钾（74.55）0.45克 MgSO 4 （120.37）0.96克葡萄糖（180.8）3.60克 NaH 2 PO 4 （119.98）0.30克 HEPES（238.3）2.38克 CaCl 2 ·2H 2 O（147.02）0.29克所有化学品完全溶解后，加蒸馏水至终值200毫升
使用前，请将库存保存在4 °C的冰箱中
200 ml储备液可用于10个实验（每个实验20 ml，保持在4 °C并在一个月内使用）。库存3：NaHCO 3粉末准备10份0.43克NaHCO 3粉末（每个储存在1.5毫升Eppendorf管中）以进行10次实验这样可以大大减少每次实验之前的准备时间每次实验前制作200毫升切片ACSF溶液：取180 ml的蔗糖原液，然后加入20 ml的切削原液，使最终体积达到200 ml。用磁力搅拌棒将两种溶液剧烈搅拌混合。
将NaHCO 3粉末放入一个Eppendorf管（0.43 g）中，放入200 ml切片ACSF中。缓慢搅拌下缓慢加入粉末，直至所有NaHCO 3细晶体溶解。用鱼缸中的空气石吹入碳素3分钟，以确保O 2 / CO 2完全饱和。使用前将溶液冷却至4 °C 。
重要提示：使用前测量切削液的温度。切片的最佳温度为3-6 °C 。由于两种储备溶液在混合前均处于4 °C的温度，因此只需约10分钟即可冷却ACSF切割溶液。孵育ACSF（2 ，000毫升每每个实验中，从原液下面和4.37克碳酸氢钠制成3粉末）。
孵育ACSF的最终组成：NaCl（132.0 mM）; 氯化钾（3.0毫米）; MgSO 4 （2.0 mM）；CaCl 2 （2.0 mM）；葡萄糖（10.0 mM）; NaCO 3 （10.0 mM）；NaH 2 PO 4 （1.25 mM）；HEPES（5.0 mM）。与卡波金饱和的，p H = 7.4，渗透压305-310 孵化/记录ACSF
孵化/记录ACSF的储备液按以下顺序将化学品溶解在1,600毫升蒸馏水中
2,000毫升试剂（配方重量）克氯化钠（58.44） 144.0克氯化钾（74.55） 4.5克 MgSO 4 （120.37） 4.8克葡萄糖（180.8） 36.0克 NaH 2 PO 4 （119.98） 3.0克 HEPES（238.3） 23.8克 CaCl 2 ·H 2 O（147.02） 5.9克所有化学品完全溶解后，添加蒸馏水至最终体积为2,000 ml
将储备溶液保持在4 °C，并在一个月内使用。2 ，000毫升ACSF原液是良好的10个实验
准备20份4.37克NaHCO 3粉末（每个储存在17毫升带帽培养管中）以进行20个实验。这样可以大大减少每次实验之前的准备时间
每次实验前将2,000 ml培养液放入ACSF中：取200 ml培养的ACSF储备液并溶于1600 ml温暖的（35 °C ）蒸馏水中
用磁力搅拌棒搅拌溶液
将一管NaHCO 3粉末（4.37 g）加入溶液中，同时剧烈搅拌直至NaHCO 3细晶体完全溶解
加入温热的（35 °C ）蒸馏水，使最终体积达到2,000 ml
用碳纤维起泡3分钟，以确保O 2 / CO 2完全饱和

注意：测量ACSF的温度，在将其装入培养箱之前，应为〜32 °C 。致谢由NIH R03AG061645，乔治城大学医学中心院长的Toulmin赠款支持，2017财年，2019财年。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的经济利益。

伦理

严格按照NIH指南，严格按照乔治敦大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议使用动物。

参考文献

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