材料和[R eagents

1. Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤器（Millipore- S Sigma，UFC503008，孔径：30 kDa NMWCO）

2.无纺布洁净室湿巾：TX604 TechniCloth （TexWipe ，目录号：TX604）

3.培养皿（Fisher Scientific，目录号：08-757-100A）

4.标准比色杯（Perfector Scientific，目录号：9002）

5.蒸馏去离子d H 2 O（DDI H 2 O）

6. pUC19载体（新英格兰生物实验室，目录号：N3041S）

7. PCR引物（IDT，定制订单）

F364：5'-GAGTTCTTGAAGTGGTGGCC-3'

R364：5'-GGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTC-3'

F480：5'-GCGATTAAGTTGGGTAAC-3'

R480：5'-GTTCTTTCCTGCGTTATC-3'

8. DreamTaq聚合酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0701）

9.脱氧核苷酸（dNTP ）溶液混合物（New England Biolabs ，目录号：N0447S）

10. PCR纯化试剂盒（Qiagen ，目录号：28104）

11.限制性核酸内切酶：DdeI （新英格兰生物实验室，目录号：R0175S）

12.限制性核酸内切酶：BspQI （新英格兰生物实验室，目录号：R0712S）

13. CutSmart ®缓冲液（新英格兰生物实验室，目录号：B7204S）

14.寡核苷酸（IDT，定制）

O30：5'-TCATCTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTATCT-3'

O31：5'-TCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCATA-3'

O32：5'-GCTTATGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCTTGCGCAGCGAGTCAGTGAGATAGGAAGGAGAGAAGAGCGCCCAATACGCAGA-3'

O33：5'-CACTGACTCGCTGCGCAAGGCTAACAGCATCACACACATTAACAATTCTAACATCTGGGTTTTCATTCTTTGGGTTTCACTTTCTCCAC-3'

O34：5'-CTAACAGCATCACACACATTAACAATTCTAACATCTGGGTTTTCATTCTTTGGGTTTCACTTTCTCCACCACTGACTCGCTGCGCAAGG-3'

O36：5'-TACGTGTAGGAATTATATTAAAGAGAAAGTGAAAAAACCAAAGAATGAAAAAGAAGATGTTAGAATTGTAAGCGGTATCAGCTCACTCATA-3'

O37：5'-GCTTATGAGTGAGCTGATACCGC-3'

O42：5'-TCATGACTCGCTGCGCAAGGCTAACAGCATCACACACATTAACAATTCTAACATCTGGG TTTTCATTCTTTGGGTTTCACTTTCTCCAC-3'

O43：5'-CCTTGCGCAGCGAGTCA-3'

15. T4多核苷酸e激酶（New England Biolabs ，目录号：M0201S）

16. T4 DNA连接酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：15224090）

17. DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich公司，目录号：43819-5G）

18. EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：15576028）

19. Tris base（Sigma-Aldrich，目录号：10708976001）

20.苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1，用10 mM Tris ，pH 8.0、1 mM EDTA饱和（Sigma-Aldrich，目录号：P3803-100ML）

21.异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A426P-4）

22.乙醇（Decon Labs，目录号：2701）

23.乙酸钠缓冲溶液，pH 5.2±0.1（25℃），3 M，0.2微米过滤（Sigma-Aldrich公司，目录号：S7899-100ML）

24.乙酸（ACROS Organics，目录号：AC124040010）

25. HCl （Sigma-Aldrich，目录号：258148-25ML）

26.氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266-100G）

27.钠Ç hloride （氯化钠）（SI GMA-Aldrich公司，目录号：S9888-500G）

28.白云母块云母（AshevilleMica ，目录号：1级）

29. 1-（3-氨基丙基）silatrane （APS）[如参考文献所述合成。（Shlyakhtenko等人，2013年）]

30. TESPA-V2 AFM探针（Bruker AFM探针，目录号：TESPA-V2）

31.镀铂校准栅，周期为1 µm × 1 µm（Bruker AFM探头，目录号：PG）

32. 10 ×绑定缓冲区（请参阅食谱）

设备

Aquamax水净化系统（APS水务公司）
PCR热循环仪（Eppendorf ，目录号：5332-54318）
Votexer （Glas -Col，目录号：099A PV6）
HPLC（Shimadzu，目录号s ：228-34350-92; 228-35555-92; 228-39001-92; 228-39001-92; 228-39005-92）
TSKgel DNA-STAT色谱柱：4.6 mm ID × 10 cm，5μm （Tosoh，目录号：821962）
ND-1000 NanoDrop分光光度计（ThermoFisher Scientific，清单编号：E112352）
VWR 1400E真空烤箱（V W R，型号：1400E）
MultiMode 8，Nanoscope V系统（布鲁克，型号：MMAFM-2）

软件

Femto S can Online（俄罗斯莫斯科高级技术中心，http：//www.nanoscopy.net/en/Femtoscan-V.shtm）
Origin（美国马萨诸塞州北安普顿市OriginLab Corporation，https：//www.originlab.com/）

程序

准备DNA底物
尾部DNA底物（T3或T5）是从双链体DNA片段装配有粘性末端（224 bp的片段为T3，356 bp的片段为T5）和尾部-DNA片段。叉子DNA底物（F3或F5）由两个带有粘性末端的双链DNA片段（224 bp片段和356 bp片段）和一个核心叉子片段组装而成。

1.组装T3 DNA底物

准备T3的双链体DNA片段（224 bp的双链体DNA）
运行PCR反应：为224-bp片段准备364-bp PCR产物：
使用的质粒pUC19（1纳克/微升与设计的正向沿）引物（F364，25 μM ）和反向引物（R364，25 μM ）和扩增用PCR的底物DNA：

1）混合680微升的DDIħ 2 O，80微升梦的Taq缓冲液，12微升的F364，12微升R364的，12微升的的dNTP溶液混合，2微升pUC19上，2微升梦的Taq （总体积800微升）放入1.5毫升微量离心管中。

2）将混合物等分到薄壁PCR管中（每个管约100μl ），并将反应放入热循环仪中。

3）在94°C初始变性2分钟后，运行以下程序33个循环：94°C变性30 s，62°C退火30 s，72°C延伸70 s。在33个循环后，在72°C下设置10分钟的最终延伸。

注意：w ^ ë通常取0.5〜微升的PCR产物，并运行一个琼脂糖凝胶（〜2％，W / V）以检查PCR反应。

4）PCR产物的纯化：

应用苯酚-氯仿萃取或使用Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤器。

苯酚-氯仿萃取步骤：

一个）收集PCR产物分成几个1.5mL微管中，并保持约700体积微升每个管中。

b）中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊在〜2 1到每个微量离心管和涡流：酒精25：24 ，000的转速˚F或20秒，然后离心以最大速度5分钟。

c）中准确地收集上层相到一个干净的微量离心管中，并保持约400体积微升每管。

d）向每个试管中添加0.1体积的3M乙酸钾，pH 5.2，然后添加2.5-3体积的冰冷的95％乙醇。

e）充分混合，然后将试管在-80 °C下放置30分钟。

f）将试管放入离心机中并正确定位（我们通常将瓶盖的尾部从中心定位）。它会让您知道沉淀物沉淀在底部的位置（在这种情况下，它将位于试管底部的尾部下方）。在冷藏室（4 °C）中以最大速度旋转15分钟。

克）去除上清液用移液管并加入300-500微升冷的70％的乙醇。以与第一次旋转完全相同的方式对离心机中的试管进行定向。它将防止颗粒滑动，并更好地附着在壁上。以最大速度旋转它们5分钟。

h）用移液管轻轻除去上清液，并通过在37°C下孵育10-15分钟将沉淀完全干燥。使用前溶解沉淀。

用限制性核酸内切酶（DdeI ）切割PCR产物：
溶解纯化的PCR产物为180微升DDI H的2 O.加入20微升所述的CutSmart ®缓冲液和3微升的的DdeI到DNA在1.5ml微离心管中。将混合物在37 °C下孵育过夜。

纯化限制性核酸内切酶产物：运行2％（w / v）琼脂糖凝胶或应用HPLC。
HPLC纯化程序：

1）准备缓冲溶液：

缓冲液A：30 mM Tris-HCl pH 9

缓冲液B：30 mM Tris-HCl pH 9，1.2 M NaCl

洗涤缓冲液：40％乙酸

2）按照制造商的建议平衡系统。

3）加载样品并运行下面列出的分离方法（表1）：

表1.纯化224bp产品的时间表

时间（分钟）

中号odule

Ë发泄

V ALUE

0.01

水泵

康

20％

0.01

水泵

流量

0.5毫升/分钟

15

水泵

康

40％

20

水泵

康

50％

120

水泵

康

80％

150

水泵

康

100％

170

水泵

康

20％

174

水泵

流量

0.01毫升/分钟

4）收集产品：

的224-bp的产物的保留时间（RT）是在95 - 97分钟。在此期间，当OD值超过100时，我们开始收集约200μl的洗脱缓冲液（管道的死体积）。将每两滴以下洗脱溶液收集到一个微量离心管中，直到OD数后1分钟低于10

5）纯化产品：

样品收集在许多试管中和高盐缓冲液中。我们需要脱盐并浓缩最终产品：以第一个试管为背景，测量每个试管的OD值。当OD值大于高OD值的20％时，收集试管。将所有选定的试管装入Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤器（孔径：30 kDa NMWCO，请参见材料）并离心。通过260 nm处的UV吸光度确定DNA浓度。

准备T3的尾巴DNA片段
磷酸化每个寡核苷酸（O42，O43）：
组分添加到1.5ml微量离心管中并充分混合：10微升的寡核苷酸（100 μM ），5微升的10 × T4连接酶缓冲液，1 μ升激酶，34微升DDI H的2 O.孵育它在37°C下放置1小时。

退火寡核苷酸：
将等摩尔比例的磷酸化寡核苷酸（O4 2，O43）加入微管中并充分混合。将试管放入开水浴（〜100°C）中，并在水浴中孵育过夜，使其逐渐冷却至室温（〜20°C）。

注意：w ^ ë通常运行约2微升上的样品的琼脂糖凝胶（〜2％，W / V）吨O检查退火产物。

用尾巴片段连接双链DNA片段
将组分和连接酶添加到微管中：每个片段的摩尔比为1：1.4（224 bp片段：尾部片段）。在16°C下孵育过夜。

注意：w ^ ë通常运行约2微升上的样品的琼脂糖凝胶（〜2％，W / V）以检查连接反应。

通过HPLC纯化连接产物。收集DNA并使用Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤器浓缩溶液。
通过测量260 nm处纯化DNA的吸光度来确定DNA浓度。
2.组装T5 DNA底物

准备T5的双链DNA片段（356-bp双链DNA）
运行PCR反应：准备356 bp片段的480 bp PCR产物：
使用的质粒pUC19（1纳克/微升与设计的正向沿）引物（F480，25 μM ）和反向引物（R480，25 μM ）和扩增用PCR的底物DNA：

1）混合680微升的DDIħ 2 O，80微升梦的Taq缓冲液，12微升的F480，12微升R480的，12微升的的dNTP溶液混合，2微升pUC19上，2微升梦的Taq （总体积800微升）放入1.5毫升微量离心管中。

2）将混合物等分到薄壁PCR管中。将装有反应混合物的试管放入热循环仪中。

3）在94°C初始变性2分钟后，运行以下程序33个循环：94°C变性30 s，54°C退火30 s，72°C延伸70 s。在33个循环后，在72°C下设置10分钟的最终延伸。

注意：w ^ ë通常取0.5〜微升的PCR产物，并运行一个琼脂糖凝胶（〜2％，W / V）以检查PCR反应。

4）PCR产物的纯化：应用苯酚-氯仿萃取或使用Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤器。

请按照1中描述的步骤进行操作。ai5）。

用限制性核酸内切酶（BspQI ）切割PCR产物：
溶解纯化的PCR产物为180微升DDI H的2 O. 20添加微升所述的CutSmart ®缓冲液和3微升的的BspQI到DNA在1.5ml微离心管中。将混合物在50 °C下孵育过夜。

纯化限制性核酸内切酶反应：运行2％（w / v）琼脂糖凝胶或应用HPLC：
遵循1.a.iii中所述的HPLC纯化程序，但采用以下分离方法（表2）：

表2.纯化356bp产品的时间表

时间（分钟）

中号odule

Ë发泄

V ALUE

0.01

水泵

康

20％

0.01

水泵

流量

0.5毫升/分钟

15

水泵

康

60％

120

水泵

康

80％

150

水泵

康

100％

170

水泵

康

20％

174

水泵

流量

0.01毫升/分钟

356-bp产品的保留时间（RT）为〜75分钟。

准备T5的尾巴DNA片段
磷酸化每个寡核苷酸（O36，O37）：
组分添加到1.5 ml间icrofuge管拌匀：10微升的寡核苷酸（100 μM ），5 μ升的10 × T4连接酶缓冲液，1 μ升激酶，34微升DDI H的2 O.在37 °C下孵育1小时。

退火寡核苷酸：
请按照1.b.ii中所述的步骤进行操作。

用尾巴片段连接双链DNA片段
将组分和连接酶添加到微管中：每个片段的摩尔比为1：1.4（356 bp片段：尾部片段）。在16 °C下孵育过夜。

注意：w ^ ë通常运行约2微升上的样品的琼脂糖凝胶（〜2％，W / V）到检查连接反应。

通过HPLC纯化连接产物。收集DNA并使用Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤器浓缩溶液。
通过测量260 nm处纯化DNA的吸光度来确定DNA浓度。
3.组装F3 DNA底物

叉状DNA的双链体区段是用于尾部DNA底物的224-bp区段和356-bp区段（如图1A所示）。

图1.叉子DNA底物的组装过程。A.将F3 DNA底物：用粘性末端结扎两种双工-DNA片段（224碱基对片段和356-bp的片段）和核心叉段（具有3'端，69个核苷酸的单链区域）一起。B.该F5 DNA底物：用粘性末端（用于F3相同的双工-DNA片段）和核心叉段（具有5'-末端，69个核苷酸的单链区域）一起结扎两种双工-DNA片段。

准备F3 DNA的核心片段
磷酸化每个寡核苷酸（O30，O31，O32，O33）：
组分添加到1.5ml微量离心管中并充分混合：10微升的寡核苷酸（100 μM ），5 μ升的10 × T4连接酶缓冲液，1 μ升激酶，34微升DDI H的2 O.孵育将其在37 °C下放置1小时。

退火寡核苷酸（核心片段）：
对于F3叉底物，将等摩尔比例的磷酸化寡核苷酸（O30，O31，O32，O33 ）添加到微管中并充分混合。将试管放入开水浴（〜100°C）中，并在水浴中孵育过夜，使其逐渐冷却至室温（〜20 °C）。

注意：w ^ ë通常运行约2微升上的样品的琼脂糖凝胶（〜2％，W / V）以检查退火产物。

用核心片段连接双链DNA片段
将片段和连接酶添加到微管中：每个片段的摩尔比为1：1：1.2（224-bp片段：356-bp片段：核心片段）。在16°C下孵育过夜。

注意：w ^ ë通常运行约2微升上的样品的琼脂糖凝胶（〜2％，W / V）以检查连接反应。

通过HPLC纯化连接产物。收集DNA并使用Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤器（孔径：30 kDa NMWCO）浓缩溶液。
通过测量纯化的DNA在260 nm处的吸光度来确定DNA浓度。
4.组装F5 DNA底物（请参见图1B中的示意图）

准备F5 DNA的核心片段
磷酸化每个寡核苷酸（O30，O31，O32，O34）：
将组分添加到1.5 ml微量离心管中并充分混合：10μ升的寡核苷酸（100 μM ），5 μ升的10 × T4连接酶缓冲液，1 μ升激酶，34 μ升DDI H的2 O.孵育它在37 ℃下1个小时。
退火寡核苷酸：
将等摩尔比例的磷酸化寡核苷酸（O30，O31，O32 ，O34 ）添加到微管中并充分混合。遵循3.a.ii中描述的相同步骤。

注意：w ^ ë通常运行约2微升上的样品的琼脂糖凝胶（〜2％，W / V）到检查退火产物。

将双链DNA片段与核心片段连接：遵循3.b中描述的相同步骤。
通过HPLC纯化连接产物。收集DNA并使用Amicon Ultra-0.5 ml离心过滤器（孔径：30 kDa NMWCO）浓缩溶液。
通过测量260 nm处纯化DNA的吸光度来确定DNA浓度。

使云母表面功能化
如所述（Shlyakhtenko et al。，2013），在DDI H 2 O中制备50 mM 1-（3-氨基丙基）甲硅烷基APS储备溶液。储备溶液可以在4 °C下保存一年以上。从APS储备液中准备15 ml的有效APS（167μM ）。
从优质云母片上切下1 × 3厘米的云母带。对角放置在比色杯中时，检查其是否合适。A S电气原理的过程以制备APS的官能云母用于AFM成像在所示Stumme-DIERS等。（2019）。用刀片将云母层劈开，直到两面都被新劈开为止，并且切片应该很薄（〜0.1毫米）。立即将云母片放入APS填充的比色杯中，孵育30分钟。
在运行的DDI H 2 O oplet或慢速液体下冲洗云母片约10 s 。在柔和的氩气气流下，将APS云母带的两面完全干燥。
注：ü瑟锁钳取云母片。非织造的纤维素和聚酯擦拭布（推荐的擦拭材料在材料中详细介绍）可用于在干燥时帮助从云母边缘吸水。使云母片垂直于抹布，以免损坏功能化的云母表面。

APS功能化的云母已准备就绪。为了存储，将干燥的云母带放入干净的比色杯中，并将其保存在真空室内。功能化的云母可以在真空室或氩气气氛中保存至少一周。

准备蛋白质-DNA复合物
从制备的结合溶液中的10 ×宾迪纳克缓冲液（见配方）。取1μl的10 ×结合缓冲液，并用DDI H 2 O补足至10μl 。结合溶液包含10 mM Tris-HCl （pH 7.5），50 mM NaCl ，5 mM MgCl 2和1 mM DTT 。
准备蛋白质-DNA混合物
准备PriA -DNA复合体。混合3.6微升的的PRIA monom ER（摩尔浓度：100纳米）以1微升：DNA底物（45摩尔浓度nM的在8:1的摩尔比）：1。添加5.4微升的结合缓冲液在室温下（〜20的混合物，并培育℃）10分钟。
准备PriA -SSB-DNA复合体。将10μl的SSB四聚体（摩尔浓度：50 nM ）与10μl的PriA单体混合，并在使用前将混合物在冰上放置30分钟。取3.6μl的蛋白质混合物，以1：2：4（DNA底物：SSB：PriA ）的摩尔比将其添加到叉子DNA底物中。用结合缓冲液补足体积至10 µl，并将混合物在室温（〜20 °C）下孵育10分钟。
孵育后，稀释复合物溶液以降低DNA浓度（〜2 nM ），可将其沉积到APS功能化的云母上。
注意：在执行此步骤之前，请安排实验以准备使用APS-mica。混合物稀释后，应立即沉积在云母上。

在APS云母上制备蛋白质DNA样品
将双面胶带粘贴到多个磁性圆盘上，然后将其放在一边。
将APS云母基板切成1 × 1 cm的正方形。将这些碎片在一个干净的培养皿中，并保持它们覆盖。
使用结合缓冲液制备稀释的组装蛋白-DNA复合物（使最终DNA浓度保持在1.0至2.0 nM ）。
沉积10微升经稀释的蛋白质的DNA样品在APS-云母片孵育两分钟的中心。用DDI H 2 O小滴轻轻冲洗样品约10 s，以除去所有缓冲液成分。
在干净的氩气的作用下，借助干净的抹布将沉积的样品干燥。将样品附着到磁性圆盘上，并在成像前将其保存在装有氩气的真空柜中至少3 h。
注意：乙ë小心不要样品沉积后接触到云母表面。

原子力显微镜成像
使用MultiMode 8，Nanoscope V系统（布鲁克，加利福尼亚州圣巴巴拉）在同一供应商的TESPA探头（标称频率为320 kHz，弹簧常数为42 N / m）上以轻敲模式在空中操作获取图像。

将探头安装到悬臂支架中。确保它与凹槽的末端牢固接触。将悬臂支架安装到扫描仪头的末端。
将样品安装在AFM载物台上。
注：乙Ë小心不要接触样品表面。

调整激光，直到总和最大，使其位于悬臂上。调整光电探测器并将垂直和水平偏转值设置为接近零。
调整悬臂。单击“自动调谐”以找到悬臂的自由空气共振频率，并将峰值偏移调整为〜3％。
设置初始扫描参数。将初始扫描大小设置为1 µm，X和Y偏移设置为0，扫描角度设置为0。将积分增益设置为1.0，将比例增益设置为5，将扫描速率设置为1 Hz。单击“参与”按钮开始该方法。
接近后，逐渐优化振幅设定点，直到清晰可见样品表面为止。优化扫描参数后，将分辨率提高到1024 × 1024像素。检查在扫描过程中Trace和Retrace是否互相跟踪良好。单击捕获按钮，然后单击接合按钮以开始图像获取。
展平图像。氯ICK“拼合”在工具面板，并保存在同一文件夹中的副本。

注意：

使用制造商提供的校准参考和说明手册（NanoScope软件版本5，004-210-000）可以完成AFM校准。根据此协议，请使用铂金涂层校准栅（PG），周期为1 µm × 1 µm [深度100 nm（ ± 10％）]作为校准参考，并按照仪器手册中的说明进行操作。对于Z轴校准，通过使用同一软件的深度分析测量图像的垂直特征来校正Z灵敏度参数。为此，将特征的实际深度（PG为100 nm）除以测得的深度（深度分析中用“峰峰值”值表示），然后将该商乘以“ Z校准”对话框中的Z灵敏度值，并用新结果替换以前的Z灵敏度值。
在CA的自动调谐ntilever ，所述索纳Ñ CE频率和驱动振幅被自动选择为最大的小号我GN人到NOI小号É比率。在我们的AFM成像系统（MultiMode 8，Nanoscope V系统）中，驱动幅度通常为5-15 mV，并产生200-250 mV的自由幅度。如果需要，自由振幅（在伏）可以是CONVER泰德到悬臂（以nm）的偏转与所述校准弹簧常数和逆光杠杆灵敏度悬臂的，由生产商提供的详细指令之后（的NanoScope软件版本5，004-210-000）。对于TESPA探针，所述标称弹簧常数是37 Ñ ñ / Ñ米和标称灵敏度为60nm / V ，因此名义上，自由振幅（200-250毫伏）是〜12-15纳米。
的设定点值进行手动扫描，以保持所述高分辨率图像，并尽量减少尖端清扫效果期间调整到最大的稳定值。操作幅度在不同的仪器和/或吸头上会有所不同。在我们的原子力显微镜成像系统（多模式8，的Nanoscope V系），振幅设定值是150毫伏，对应于〜8 0 ％的悬臂的自由振幅的。

数据分析

使用FemtoScan Online软件包（俄罗斯莫斯科高级技术中心）对AFM图像进行了分析。图是由Origin软件（美国马萨诸塞州北安普敦的OriginLab公司）制作的。

测量轮廓长度。在FemtoScan中打开展平的图像，测量并记录游离DNA从一端到另一端的轮廓长度。对于内部长度校准，请使用测量值生成直方图，并将其与正态（高斯）分布拟合。为了获得校准因子，将峰中心（Xc ）除以底物长度分成碱基对。
注：牛逼他标定系数应为0.34〜。

测量蛋白质的位置（图2）。从DNA底物上较短臂的末端开始，朝着蛋白质的中心开始，以获取蛋白质的位置（臂长1，如图2所示）。保持从蛋白质中心向DNA底物另一端的记录，以获取DNA的轮廓长度（臂长1和臂长2在一起，如图2所示）。将每个臂长除以计算出的校准因子，即可获得DNA碱基对中的臂长。可以从臂长1的数据集中制作蛋白质分布的直方图（图2C）。

图2.蛋白质位置的测量。A. ř具有代表性AFM图像（0.5 ×与F5为0.5μm）PRIA 。Z标度为3 nm。箭头指向F5 DNA底物上结合的PriA 。B.放大图像（0.25 × 0.25 µm），虚线显示轮廓长度测量值。从较短的臂的末端到蛋白质的中心（绿色虚线）测量每种蛋白质的位置，并从蛋白质的中心一直到蛋白质的末端连续测量与蛋白质结合的DNA底物的总长度。另一只手臂（蓝色虚线）。C.使用短臂长度的数据的PriA在F5 DNA上的位置的直方图。直方图由高斯拟合，其中心位于254±23 bp （SD）的单个峰，bin大小为20 bp。

对于SSB-PriA -DNA结果中的双重特征复合物，请使用软件的横截面特征按如下所述测量每个特征的高度，然后将较高的一个分配给SSB。对于长度测量，请从更靠近SSB的一端开始，连续测量并向SSB和PriA的中心记录，继续记录直到DNA底物另一侧的末端。通过将DNA长度设置为聚簇柱并将蛋白质位置设置为散点图，将这些值绘制为图表（图3）。

图3.含有PriA和SSB蛋白的复合物的蛋白质分布测量。A. PriA + SSB +叉子DNA（0.5 × 0.5 µm）的代表性AFM图像。Z标度为3 nm。B.双蛋白复合物的放大图像（0.25 × 0.25 µm），虚线表示轮廓长度测量值。绿色箭头指向综合体中的PriA ，而SSB位置则由蓝色箭头指示。C. S3位置对应于零值的F3 DNA底物上的蛋白质图。蓝色方块表示SSB的位置，红色点表示PriA的位置。

测量蛋白质的体积。对于每种蛋白质，从正交截面测量（图4 A ）中收集两组高度（H）和半峰全宽（D）的全宽。应用测量结果，以式中吉尔摩描述等。（2009）：V ＝ 3.14 × H / 6 × （0.75×D 1 ×D 2 + H 2 ）。将这些值绘制为直方图，并以正态（高斯）分布拟合峰，从而获得蛋白质群体的体积。
注意：在我们的AFM成像系统（MultiMode 8，Nanoscope V系统，E扫描仪）中，垂直测量的精度为亚纳米级（Lyubchenko ，2011年）。如我们实验室和其他实验室所进行的那样，空气中DNA的测量高度通常约为0.6至0.8 nm（Thomson等，1996; Hansma等，1996; Maeda等，1999; Pietrasanta等，1999 ；Ye等人，2000 ；Kato等人，2002；Shlyakhtenko等人，2003 ），并且可以将其用作蛋白质-DNA复合物的高度测量的对照。此外，负载的磷脂双层的测量厚度为4-5 nm（Lv等人，2018 ），这与通过其他方法获得的双层测量值完全吻合。

图4.蛋白质大小的测量。A.双蛋白复合物（0.2 × 0.2 µm）的代表性AFM图像。蛋白质的横截面轮廓（绿线和蓝线）产生（BE）中所示的高度分布曲线：（B）和（C）是SSB的图，而（D）和（E）显示了SSB的高度分布。PRIA 。根据这些曲线，将高度（H）和宽度（D）值用于计算蛋白质体积。

菜谱

10 ×结合缓冲液
100 mM的Tris-HCl （pH 7.5）

500毫米氯化钠

50毫米MgCl 2

10毫米DTT

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助，其中R01 GM118006授予YLL，R01 GM100156授予PRB和YLL。

利益争夺

没有要宣布的利益冲突。

参考

Bhattacharyya，B.，George，NP，Thurmes ，TM，Zhou，R.，Jani ，N.，Wessel，SR，Sandler，SJ，Ha，T.和Keck，JL（2014）。PriA介导的DNA复制的结构机制重新开始。PROC国家科科学院科学美国阿111（4）：1373-1378。
Cadman，CJ和McGlynn ，P。（2004）。PriA解旋酶和SSB在物理和功能上相互作用。核酸研究32（21）：6378-6387。
考克斯，MM，古德曼，MF，克罗伊泽尔，KN，谢拉特，DJ，桑德勒，SJ和玛丽安·KJ（2000）。修复停滞的复制叉的重要性。自然404（6773）：37-41。
加布拜（Cabbai），哥伦比亚广播公司（CB）和玛丽安（Karians ）（2010）。招募陷入困境的PriA DNA解旋酶复制叉和复制体加载活动对于生存至关重要。DNA修复（Amst ）9（3）：202-209。
Gilmore，JL，Suzuki，Y.，Tamulaitis ，G.，Siksnys ，V.，Takeyasu ，K. and Lyubchenko ，YL（2009）。DNA-EcoRII蛋白复合物的单分子动力学通过高速原子力显微镜显示。生物化学48（44）：10492-10498。
Hansma ，HG，Revenko ，I.，Kim，K。和Laney，DE（1996）。长和短双链，单链和三链核酸的原子力显微镜检查。Nucleic Acids Res 24（4）：713-720。
Kato，M.，McAllister，CJ，Hokabe ，S.，Shimizu，N。和Lyubchenko ，YL（2002）。通过原子力显微镜分析嘧啶/嘌呤偏爱的DNA序列的结构异质性。Eur J Biochem 269（15）：3632-3636。
Kogoma ，T。（1997）。稳定的DNA复制：DNA复制，同源重组和转录之间的相互作用。微生物分子生物学版本61（2）：212-238。
Lv ，Z.，Banerjee，S.，Zagorski ，K.和Lyubchenko ，YL（2018）。支持的脂质双层用于原子力显微镜研究。方法分子生物学1814：129-143。
Lyubchenko ，YL（2011）。用于AFM成像的DNA和核蛋白样品的制备。微米42（2）：196-206。
前田（Y.Maeda），T。松本（Matsumoto）和T.Kawai（1999）。使用非接触原子力显微镜观察单链和双链DNA。App Sur Sci 140（3-4）：400-405。
McGlynn ，P。和Lloyd，RG（2002）。重新修复并重新启动已损坏的复制叉。Nat Rev Mol Cell Biol 3（11）：859-870。
米歇尔B.，格罗彭内G.，弗洛雷斯MJ和比德年科V.（2004）。多种途径处理停滞的复制叉。PROC国家科科学院科学美国阿101（35）：12783-12788。
米歇尔·B·米歇尔（B.Michel，B.），阿肯色州辛哈（Sinha）和DRF里奇（Leach），（2018）。在大肠杆菌中复制叉断裂和重新启动。 Microbiol Mol Biol Rev 82（3）：e00013-18。
Pietrasanta ，LI，Thrower，D.，Hsieh，W.，Rao，S.，Stemmann ，O.，Lechner ，J.，Carbon，J.和Hansma ，H.（1999）。探查酿酒酵母着丝粒DNA（CEN DNA）结合因子3（CBF3）线粒体复合物通过使用原子力显微镜。PROC国家科科学院科学美国甲96（7）：3757-3762。
桑德勒（Sandler，SJ）和玛丽安（Marians，KJ）（2000）。PriA在大肠杆菌中复制叉激活中的作用。Ĵ细菌学182（1）：9-13。
Shlyakhtenko ，LS，Gall，AA和Lyubchenko ，YL（2013年）。云母功能化，用于通过原子力显微镜对DNA和蛋白质-DNA复合物进行成像。方法分子生物学931：295-312。
Shlyakhtenko ，LS，五倍子，AA，Filonov ，A.，Cerovac ，Z.，Lushnikov ，A和Lyubchenko ，YL（2003）。基于Silatrane的表面化学，用于固定DNA，蛋白质-DNA复合物和其他生物材料。超显微术97（1-4）：279-287。
Stumme-DIERS ，MP，Stormberg ，T.，太阳，Z.和Lyubchenko ，YL（2019）。使用原子力显微镜成像探测核小体的结构和动力学。Ĵ显示精通（143）。doi ：10.3791 / 58820。
汤姆森，新罕布什尔州，卡萨斯，S。，史密斯，B。，汉斯玛，HG和汉斯玛，PK（1996）。DNA与云母的可逆结合，用于AFM成像。Langmuir 12（24）：5905-5908。
Wickner ，S。和Hurwitz，J。（1975）。phiX174 DNA依赖的ATPase活性与大肠杆菌蛋白质，即复制因子Y的关联，这是phiX174 DNA的体外合成所必需的。PROC国家科科学院科学美国甲72（9）：3342-3346。
Windgassen ，TA，Leroux ，M.，Sandler，SJ和Keck，JL（2019）。PriA DNA复制重启解旋酶中链分离pin元件的功能。Ĵ生物学化学294（8）：2801至2814年。
Windgassen ，TA，Leroux ，M.，Satyshur ，KA，Sandler，SJ和Keck，JL（2018 a ）。结构特异性DNA复制叉识别可指导解旋酶和PriA解旋酶的复制重启活动。PROC国家科科学院科学美国阿115（39）：E9075-E9084。
Windgassen ，TA，Wessel，SR，Bhattacharyya，B.和Keck，JL（2018 b ）。细菌DNA复制的机制重新启动。Nucleic Acids Res 46（2）：504-519。
Ye，JY，K. Umemura ，M. Ishikawa和R. Kuroda（2000）。通过旋涂技术拉伸的DNA分子的原子力显微镜检查。肛门生物化学281（1）：21-25。
Yu，C.，Tan，HY，Choi，M.，Stanenas ，AJ，Byrd，AK，K，DR，Cohan，CS和Bianco ，PR（2016）。在没有DNA的情况下，SSB在体内与RecG和PriA解旋酶结合。基因细胞21（2）：163-184。
Zavitz ，KH和Marians，KJ（1992）。大肠杆菌DNA复制蛋白PriA的ATPase缺陷型突变体能够催化活性引物体的组装。Ĵ生物化学化学267（10）：6933-6940。