材料和试剂

50 ml注射器（BD，货号：309654）
Amicon Ultra-15离心过滤器100K（EMD Millipore，目录号：UFC910096）
Amicon Ultra-4离心过滤器100K（EMD Millipore，货号：UFC810096）
Amicon Ultra-15离心过滤器10K（EMD Millipore，目录号：UFC901024）
Amicon Ultra-4离心过滤器10K（EMD Millipore，目录号：UFC801024）
Whatman核孔刻蚀膜，0.4 µm，19 mm（Sigma-Aldrich，目录号：WHA800282）
Whatman核孔刻蚀膜，0.1 µm，19毫米（Sigma-Aldrich，目录号：WHA800309）
1.5 ml反应管的离心管/旋转器
通用的长期存储低温管（Nalgene TM ，Thermo Fisher Scientific，目录号：5000-0020）
50毫升试管（Fisher Scientific，目录号：1443222）
甘油（Fisher Scientific，目录号：G334）
液态氮2
氯仿（Fisher Scientific，目录号：507517453）
海卫一X-100 （西格玛奥德里奇，目录号：T9284）
LB肉汤，米勒（Fisher Bioreagents，货号：BP1426-2）
氨苄西林钠盐（GoldBio，目录号：A-301-100）
Ni-NTA超级流量（QIAGEN，目录号：30430）
硫醇活性染料（LD555，LD655）（Lumidyne Technologies，目录号：LD555-MAL，LD655-MAL）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Bioreagents，货号：BP231-100）
天冬氨酸-谷氨酸结合蛋白，PEB1a（UniProt ID：M9QLL2。位点特异性标记的突变：C18S / N73C / K149C；亲和力突变：A64F，D102L，Y198F，R89L）
大肠埃希氏菌（大肠杆菌）极性脂质提取物（Avanti极性脂质，目录号：100600C-100毫克）
卵磷脂酰胆碱（PC）（Avanti极性脂质，目录号：840051C-25mg）
Bio-beads SM2吸收介质（Bio - Rad，目录号：152-3920）
原儿茶酸（PCA）（Sigma-Aldrich，目录号：37580-25G-F）
原儿茶酸-3,4-二加氧酶（PCD）（Sigma-Aldrich，目录号：P8279）
L-阿拉伯糖（GoldBio，目录号：A-300-1）
HEPES（Fisher生物试剂，目录号：BP310-100）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-3）
氯化钾（KCl）（EMD密理博，目录号：PX1405-1）
二水合氯化钙（Sigma - Aldrich，目录号：223506）
三（2-羧乙基）膦盐酸盐，98％（TCEP）（Alfa Aesar，目录号：40587-09）
乙二胺四乙酸二钠盐，二水合物100％（EDTA）（Alfa Aesar，目录号：C1201100-500A5）
溶菌酶，蛋清（GoldBio，目录号：L-040-10）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（MP Biomedicals，目录号：195381）
超纯蔗糖，无RNase（MP Biomedicals，目录号：04821713）
L-天冬氨酸一钾盐（国际研究产品，目录号：1115-63-5）
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）（Anagrade，Anatrace，目录号：D310 25 GM）
牛血浆中的凝血酶（Sigma - Aldrich，目录号：T4648）
β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（GoldBio，目录号：I2481C100）
牛血清白蛋白（BSA）（组分V，OmniPur，目录号：2930）
链霉亲和素（Invitrogen，货号：S888）
的Thermo Scientific TM EZ-Link的TM马来酰亚胺PEG11生物素（Fisher Scientific公司，目录号：PI21911）
N-乙基马来酰亚胺（Sigma - Aldrich，目录号：E3876）
QIAprep旋转微量制备试剂盒（50 × ）（QIAGEN，目录号：27104）
T7特快lysY主管大肠杆菌（高效率）（新英格兰生物实验室，目录号：C3010I）
Thermo Scientific TM FastDigest DpnI（Fisher Scientific，目录号：FERFD1704）
PfuUltra II Hotstart PCR预混液（Agilent Technologies，目录号：600852）
LB琼脂板，氨苄西林100（Teknova，目录号：L1004）
Pet21（+）vector（Genscript）
重悬缓冲液（请参见配方）
洗涤缓冲液（请参见食谱）
洗脱缓冲液（请参见配方）
体积排阻色谱（SEC）缓冲液（请参见配方）
cysGlt Ph SEC缓冲区（请参见食谱）
休息缓冲液（请参见食谱）
非激活缓冲区（请参见食谱）
激活缓冲区（请参阅食谱）
T50缓冲液（请参阅配方）
cysGlt Ph重悬缓冲液（请参见食谱）

设备

分光光度计（Horiba Photon Technology PTI，Quantamaster 8000）
NanoDrop 2000c（Fisher Scientific，目录号：ND-2000C）
2,800 ml带挡板的芬巴赫式培养瓶（Fisher Scientific，目录号：09-552-39）
玻璃烧杯
磁力搅拌棒
Superdex 200增加10/300 GL色谱柱（GE Healthcare，目录号：28-9909-44）
AKTA纯色谱系统（GE生命科学）
Aldrich公司®单颈圆底烧瓶中，将100ml的容量，联合：ST / NS 24/40（Sigma-Aldrich公司，目录号：Z414492）
BUCHI旋转蒸发仪TM的R-300旋转蒸发仪具有控制器和V-300泵
干式密封真空干燥器（Fisher Scientific，目录号：088427）
Avanti迷你挤出机套件（Avanti极性脂质，目录号：610000）
过滤器支持（Avanti Polar Li pids，目录号：610014）
MAXQ 8000冷藏/冷藏可堆叠摇床（Thermo Fisher Scientific）
德拉蒙德便携式移液器（Thomas Scientific，目录号：13-661-17E）
移液器套件，P1000，P200，P20，P10（Gilson，目录号：F167370）
Avanti JXN-26离心机（贝克曼库尔特）
Avanti JXN-30离心机（贝克曼库尔特）
Optima MAX-XP台式超速离心机（贝克曼库尔特）
Optima L-100XP超速离心机（贝克曼库尔特）
J-LITE JLA-8.1000定角铝制转子，6 × 1,000 ml，8,000 rpm，15,970 ×g （Beckman Coulter，目录号：363688）
JA-20定角铝质转子，8 × 50毫升，20,000 rpm，48,400 ×g （贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号：334831）
45型Ti固定角度钛转子（Beckman Coulter，目录号：339160）
TLA-100.3定角转子（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号349481）
1 L（1 ，000个毫升）聚碳酸酯瓶盖组装，95 × 191毫米（Beckman Coulter公司，目录号：A98812）
70 ml，聚碳酸酯瓶组件，38 × 102 mm（Beckman Coulter，货号：355622）
26.3毫升，带盖组件的聚碳酸酯瓶，25 × 89毫米（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号：355618）
50 ml，带盖组件的聚碳酸酯瓶，29 × 104 mm（Beckman Coulter，目录号：357000）
Avestin EmulsiFlex C3细胞分裂剂（Avestin）
杜恩纸巾研磨机套装
XK 16/20色谱柱（Cytivalifesciences，目录号：28988937）
Spectrum TM Spectra / Por TM 4 RC透析膜管12,000至14,000道尔顿MWCO（Fisher Scientific，目录号：08-667D）
Spectrum TM透析管密封件：Spectra / Por TM标准类型（Fisher Scientific，目录号：08-670-11A）

软件

SPARTAN（斯科特·布兰查德实验室，https： //www.scottcblanchardlab.com/software ）
MATLAB（MathWorks，https：//www.mathworks.com/products/matlab.html ）
Prism（GraphPad Software，Inc.，https://www.graphpad.com/）
来源（美国马萨诸塞州北安普顿市的OriginLab Corporation，https：//www.originlab.com/）

程序

ccPEB1a传感器结构
将带有C末端6x His-tag的PEB1a克隆到pet21a（+）载体中。
对PEB1a进行诱变以去除天然的半胱氨酸，并引入两个半胱氨酸，用荧光团（C18S，N73C，K149C）进行位点特异性标记，从而生成ccPEB1a构建体。
C18S ：

正向引物：GGGTGCGAGCGTTGCGTTTAG

反向引物：CGCAACGCTCGCACCCAGCGC

N73C ：

正向引物：CTGGACTGTGGCAGCGTGGATGCGGTTATC

反向引物：GATAACCGCATCCACGCTGCCACAGTCCAG

K149C ：

正向引物：CGGCATTGATGTGTGCTTCAGCGAATTTCC

反向引物：GGAAATTCGCTGAAGCACACATCAATGCCG

在天冬氨酸/谷氨酸结合位点或附近引入其他突变，以调节亲和力。ccPEB1a以约79 nM的解离常数结合天冬氨酸。ccPEB1a Y198F变体具有5.6 µM的亲和力，可在100 nm脂质体中显示多达5个转运周期。
在1.5 ml反应管中混合100 ng具有上述突变的DNA和50 µl T7 Express lysY感受态大肠杆菌细胞，并在冰上孵育30分钟。
在42°C下热震45 s，立即将管在冰上放置5分钟，然后添加750 µl高压灭菌的LB。
在37°C下以250 rpm摇动孵育1 h，然后在琼脂板上添加100 µg / ml氨苄青霉素。
生长过夜为在37℃〜16小时在250摇动转一次通过混合用500μl高压灭菌50％甘油的500μl的培养制备甘油储备，°存储在-80℃。

ccPEB1a纯化
根据制造商的规程，在两个带挡板的2,800 ml芬巴赫式培养瓶中分别制备4 L LB，并在1 L烧瓶中分别制备300 ml。高压灭菌，冷却至37°C或室温。
使用前，在所有LB中补充100 µg / ml氨苄青霉素。
接种300毫升LB与ccPEB1a的细菌甘油原液并生长过夜为在37℃下以250〜振摇16小时转。
用来自S tep B 3的过夜培养物接种LB，使其在600 nm的最终吸光度为0.1。用LB稀释200 µl细胞培养物5次以进行吸光度测量。
当吸光度达到0.8时，用1 mM新鲜制备的IPTG诱导细胞。
让培养物生长3小时，在37℃和16小时在18℃下以250rpm振荡培养。
通过使用JLA-8.1000定角转子在Avanti JXN-26离心机中于4°C以3,326 × g离心15分钟来收获细胞。每2 L细菌细胞培养物使用10 ml重悬缓冲液（请参见配方1）重悬沉淀。
加入100 µg / ml溶菌酶。
在冰上孵育30分钟，然后用去离子水稀释1：3（v：v）。
在4°C下使用JA-20固定角转子在Avanti JXN-26离心机中以3,578 × g的速度离心30分钟，以沉淀碎片。上清液仍然具有一些颗粒物质，并且非常粘。第二个相同的离心步骤可以进一步澄清上清液，防止色谱柱堵塞，并延长树脂的使用寿命。
在烧杯中，将上清液与3-5 ml的Ni-NTA树脂（用3 × 5柱体积（CV）的水和1 × 5 CV的洗涤缓冲液（请参见配方2）洗涤）混合，并在搅拌板上轻轻搅拌1 h在4°C下使用磁力搅拌棒搅拌。
按照制造商的说明组装XK20 / 16色谱柱，然后慢慢倒入树脂浆液，并用注射器将其通过。
用注射器拉动流通管，用5 CV的洗涤缓冲液洗涤。
使用3 CV洗脱缓冲液（请参见第3条）通过重力洗脱蛋白质。
在截留分子量为10K的Amicon Ultra-15离心过滤器中浓缩样品，直到体积达到< 500 µl。通过在分光光度计中测量280 nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。使用Expasy生物信息学资源门户网站的在线Expasy Protparam工具计算蛋白质的消光系数和分子量。
使用TLA-100.3固定角转子在Optima MAX-XP台式超速离心机中在4°C下以49192 × g离心蛋白质溶液15分钟。使用1 ml移液管吸出蛋白质溶液，而不会干扰蛋白质聚集物的沉淀。
在50 ml的SEC缓冲液中对Superdex 200增加10/300 GL色谱柱进行预平衡后，通过大小排阻色谱（SEC）使用Superdex 200增加10/300 GL色谱柱抛光蛋白质。根据制造商的说明设置色谱柱的流速和压力极限。0.3 ml / min的流速和2 MPa的压力极限是该色谱柱的理想选择。通过跟踪在280 nm处的吸光度监控蛋白质洗脱，并收集0.4 ml馏分。
收集峰馏分并立即进行标记程序。蛋白质应该出来作为单体（图URE 2）。

图2.从Superdex 200增加10/300 GL色谱柱洗脱的单体PEB1a的SEC谱图

ccPEB1a标记
重悬于100 µl DMSO中，将1000 nmol干燥的LD555或LD655重悬至最终浓度为10 mM。涡旋直至染料块消失。分装成10 µl等分试样，并储存在-20°C下。
解冻LD555和LD655染料的等分试样，并与新鲜SEC纯化的ccPEB1a蛋白按1：1：1（mol：mol：mol）的比例混合。可以根据标记效率根据经验优化摩尔比。请注意，SEC缓冲区中没有还原剂，因为它们会降低标记效率。因此，暴露于溶剂的半胱氨酸残基可能会随着时间而氧化，从SEC洗脱后立即将蛋白质溶液与马来酰亚胺试剂混合至关重要。
将Eppendorf管包裹在铝箔中，并在旋转器上孵育45分钟至1小时。
净化标记的单体ccPEB1a从未反应的染料通过SEC，以下的Superdex 200增加10/300 GL的预平衡如上述小号吨EP乙的“ccPEB1a纯化”部分的17。使用相同的流速和压力限制在小号TEP乙17。
使用截留分子量为10K的Amicon Ultra-4离心过滤器将标记的蛋白质浓缩至〜5 µM。
如果ccPEB1a蛋白质变体以解离常数< 5 µM结合底物，则使用截留分子量为12-14 kDa的透析膜管将4 L桶中的4,000倍SEC缓冲液透析该蛋白质，以去除结合的L-天冬氨酸。在蒸馏水中孵育15厘米管30分钟。用蒸馏水冲洗管道，并用透析管夹封闭一端。确保夹子紧紧且没有泄漏后，装入蛋白质溶液。将多余的管道折叠起来，在蛋白质溶液的顶部留出2厘米的空间，然后用夹子将其封闭。将组件翻转1-2次以确保没有泄漏，然后将其放入装有SEC缓冲液的烧杯中。每4小时更换缓冲液3次。
在280 nm，555 nm（LD555）和655 nm（LD655）处测量蛋白质样品的吸收率。使用蛋白质和染料的消光系数：150,000 cm -1 M -1 （LD555）和250,000 cm -1 M -1 （LD655）来计算它们各自的浓度并确定标记效率。
将等份标记的蛋白质分成20微升等分试样，并在液体N 2中快速冷冻。储存在液态N 2中直至使用。

脂质体储备的制备
混合4毫升（100毫克）的大肠杆菌极性脂质提取物和蛋PC（储存在-80℃下以1.33毫升（33毫克）在氯仿中）在一个最终3：1（重量：重量）的比率在100毫升圆底烧瓶。使用玻璃移液器转移氯仿溶液。使用旋转蒸发仪干燥混合物，将烧瓶在真空下旋转〜30分钟；脂质会在烧瓶壁上形成薄膜。
用铝箔将烧瓶的开口松散地盖上，然后放在连接真空的干密封真空干燥器中过夜。
要水合脂质膜，请在圆底烧瓶中加入33.25 ml的Resting缓冲液（请参见第6条），以使最终浓度达到4 mg / ml脂质。为促进脂质膜的水化过程，请执行以下冷冻/解冻循环：通过将烧瓶浸入液氮中来冷冻脂质悬浮液。您可以在保温瓶或冰桶中准备液氮浴。在将烧瓶降低到液氮中时，请用防热手套将烧瓶握住其瓶颈，或使用蒸气管扩展器。脂质悬浮液在冻结时会发出类似于鸡蛋在煎锅上的声音。一旦噪音在1-2分钟内消退，悬浮液就会完全冻结。将烧瓶转移至室温的水浴中以解冻悬浮液。视频1展示了我们使用的设置。重复冷冻/解冻循环10次，直到烧瓶侧面的脂质膜消失，并且悬浮液呈浑浊白色。

视频1.制备用于蛋白质重建的脂质体原液

分装成1毫升等分的脂质体，在液体N 2中速冻，并保存在-80°C直至进一步使用。

将钠/天冬氨酸共转运蛋白Glt Ph重组为脂质体并包裹ccPEB1a
净化N278C / C321A GLT博士单个半胱氨酸突变体（cysGlt博士），先前所描述的（Akyuz等人，2013），具有低于一些修改。
用12 L的LB（而不是4 L）重复S teps B1-B4，并用cysGlt Ph甘油储备液接种LB。
在37°C下以250 rpm摇动，用20 mM L-阿拉伯糖诱导3 h 。
使用EmulsiFlex C3细胞裂解液将细胞溶解在cysGlt Ph重悬缓冲液中（请参见第10条）。4次通过通常足以破坏大多数细胞。
使用45型Ti固定角度钛转子在Optima L-100XP超速离心机中以100,000 × g和4°C的温度将细胞悬液离心1小时，以使膜沉淀。
在加有40 mM正十二烷基β-D-麦芽吡喃糖苷（DDM）的增溶缓冲液中匀浆粗细胞膜（请参见第11条），在4°C下放置1 h，然后通过在100,000 × g和4下离心1 h去除不溶物质在使用45 Ti固定角度钛转子的Optima L-100XP超速离心机中，以°C为单位。
将上清液与3-5 ml Ni-NTA树脂混合，然后按照步骤B11- B 12中所述组装色谱柱。
用5 CV增溶缓冲液（添加1 mM DDM和40 mM咪唑）洗涤，并在250 mM咪唑存在下洗脱。
与凝血酶以每毫克蛋白质10个单位的温度在21°C下孵育〜16小时，以裂解His-tag。
使用Superdex 200通过SEC纯化裂解的cysGlt Ph ，在50 ml cysGlt Ph SEC缓冲液中预先平衡10/300 GL色谱柱（请参见配方5）。
解冻等分的马来酰亚胺-PEG 11-生物素和NEM，并以1：2：4（mol：mol：mol）蛋白质：马来酰亚胺-PEG 11-生物素：NEM的比例与新鲜纯化的cysGlt Ph蛋白混合。请注意，SEC缓冲液中没有还原剂，半胱氨酸残基可能会随着时间而氧化。因此，从SEC洗脱后立即将蛋白质溶液与马来酰亚胺试剂混合是至关重要的。
使用预先平衡的Superdex 200增加10/300 GL色谱柱，通过SEC从未反应的试剂中纯化标记的cysGlt Ph 。
使用截留分子量为100K的Amicon Ultra-4离心过滤器将标记的转运蛋白浓缩至4 mg / ml。
取出1 ml脂质体等分试样（4 mg / ml），并使用微型挤出机挤出400 nm膜，如视频所示（https://www.sigmaaldrich.com/video/life-science/avanti-mini-extruder .html）。2 1次通过应产生大小均一的单层脂质体。
通过以1：2（w：w）洗涤剂/脂质比率添加Triton X-100，使脂质体不稳定。
将cysGlt Ph以1：1000（w：w）PLR加入脂质体中，并在室温下在旋转器上孵育30分钟。调整PLR，以每个小泡一个转运蛋白的形式富集脂质体。我们在（Ciftci et al.2020 ）中详细介绍了计算。
在50毫升试管中使用之前，请先用10 CV乙醇和20 CV水彻底洗涤Bio-Beads 。颠倒浆液2-3次，让珠子沉淀在底部，然后用移液器吸出上清液。将最终浓度为100 mg / ml的珠子添加到脂质体悬浮液中，并在室温下在旋转器上孵育2小时。至关重要的是，不要添加太多的珠子以避免脂质流失，因为脂质流失会降低蛋白脂质体的产量。
使用1毫升移液器将脂质体溶液从微珠中转移到新的冷冻管中。重复小号TEPS Ç 17和Ç 18为使用新鲜的珠子在4℃下5次以上。
使用TLA-100.3固定角转子在Optima MAX-XP台式超速离心机中于4°C在49,192 × g下离心1 h制成球状蛋白脂质体。
除去上清液并将蛋白脂质体重悬于等体积的静止缓冲液中，冷冻在液氮2中，并在室温下于水浴中融化。
重复小号TEPS Ç 20 Ç 21的两倍多。
按上述方法沉淀蛋白脂质体，以25 mg / ml的浓度重悬于160 µl的静止缓冲液中。
添加来自S tep C8的荧光标记的ccPEB1a，使其终浓度为0.6 µM，并如上所述进行2次冷冻/解冻循环进行封装。两个冷冻/解冻循环应导致高达30％的封装效率（Colletier等，2002 ；Chaize等，2004 ；Costa等，2014）。冷冻/解冻循环次数的增加可能会提高封装效率，但也可能导致变性ccPEB1a的分数增加。我们发现，当前程序允许我们在单个sm-FRET记录中成像多达500个囊泡，足以进行有效的数据收集。P roteoliposomes可以储存在-80℃下在此步骤，直到进一步使用。
通过如上所述的离心方法沉淀蛋白脂质体，以除去未包封的PEB1a。用等体积的静止缓冲液替换上清液。
使用小型挤出机（Avanti Polar Lipids）通过100 nm膜挤出蛋白脂质体（21个通道）。亲teoliposomes可以储存于4℃多达5-6小时后使用。您可以通过阴性染色或cryo-EM验证脂质体的完整性和大小分布。代表性图像示于图URE S7中Ciftci等。（2020年）。

单分子实验
基于已公开的方法（Joo和Ha ，2012年），制备了用PEG-生物素功能化的TIRF显微镜用石英显微镜载玻片和玻璃盖玻片。
如前所述（Juette et al。，2016），我们使用围绕尼康Eclipse Ti倒置显微镜机身构建的基于棱镜的TIRF显微镜进行了所有单分子FRET成像实验。提供了有关建立基于棱镜的单分子TIRF显微镜设置的分步指南（Selvin和Ha ，2008 ；Axelrod ，2008 ；Roy等人，2008）。
通过使混合物流过进样口并孵育5分钟，使用1 µM BSA和1 µM双链DNA在150 µl T50缓冲液（请参见第9条）中的溶液对石英玻片进行钝化。可以在Blanchard等人的文章中找到更多详细信息。（2004年）以及Joo和Ha （2012年）。使150 µl T50缓冲液流过进样口，以洗去多余的BSA和DNA 。
要使非特异性连接的脂质体成像，请从S tep E 25中流出不超过10 µl的蛋白脂质体悬液。记录您在此步骤中使用的样品数量。
立即用150 µl的静止缓冲液清洗表面，以除去未附着的蛋白脂质体。
以100 mW激光功率以10 Hz的时间分辨率将图像附着的分子合计300 s。
通过以600 mW的激光功率对整个固定化表面进行成像，使漂白剂非特异性附着的分子发生光漂白，并将其置于装有150 µl T50缓冲液的室内。
在T50缓冲液中加入150 µl预混合的0.8 µM链霉亲和素和1 µM双链DNA溶液，孵育5-10分钟。
在连接蛋白脂质体之前，用150 µl T50缓冲液和150 µl静置缓冲液冲洗掉多余的链霉亲和素双链体DNA 。
流动脂质体的相同体积的在小号TEP ˚F 4.立即清洗表面用150μl缓冲液休息以除去未附着的蛋白脂质体。如有必要，流动更浓缩的样品或增加样品量以达到合适的单分子密度。在最佳密度，在拒绝分子的分数gettraces模块SPARTAN的应为〜40％（请参阅数据一nalysis和在线SPARTAN手册）。如果进样量较大，请使用匹配的样品重新检查非特定附件（S teps F 4- F 7）。
以100mW激光功率图像附分子在总共300秒10赫兹时间分辨率，并确定特异性和非特异性附着到表面（数据分子数一nalysis）。理想情况下，在S tep F 6中成像的非特异性附着的荧光颗粒应小于特异性附着分子的25％。
用由2 mM PCA和50 nM PCD组成的除氧系统补充非激活和激活缓冲液（请参见第7-8节）（Aitken等，2008）。
影像蛋白脂质体通过在电影开始后约3 s流入50 µl非活化缓冲液来测试渗漏情况。在S teps E 17 - E 1 8后残留的痕量洗涤剂可以使L-asp自发扩散到脂质体中，并导致在没有活性钠驱动的摄取的情况下，封装的ccPEB1a的FRET效率发生变化。如果此步骤中有大量单分子轨迹（> 10％）显示FRET效率发生变化，请丢弃脂质体，并在下一个制备中增加生物珠的数量或生物珠孵育周期的数量。每个回合中的生物珠不得超过200毫克/毫升。如果200 mg / ml的生物珠仍然不够，请增加孵育轮数。每轮后仔细观察脂质体制剂的浊度水平。浊度的显着降低表明脂质体被过量的生物珠吸附。我们已经观察到，使用100 mg / ml生物珠进行6轮电泳足以从脂质体制剂中除去Triton X-100洗涤剂。该数目可以根据用于增溶脂质体的去污剂的性质和孵育温度而有所不同。具有较高临界胶束浓度（CMC）的洗涤剂更容易去除。可以使用比色测定法检查脂质体制剂中的残留洗涤剂（Urbani和Warne ，2005）。我们已经观察到（通过温控室）轻微的温度变化会导致去污剂去除效率的显着差异。
在电影开始后大约3秒钟，通过使50 µl激活缓冲液流动来对蛋白脂质体进行成像，以测量转运。根据运输商的周转率，调整时间分辨率和电影的总时长。对于周转时间约为30-100 s的cysGlt Ph变体，我们使用20 mW的激光功率，时间分辨率为2.5 Hz。在这种激光功率下，平均光漂白时间约为300 s。对于周转时间约为1 s的变体，我们使用10 Hz的75 mW激光功率，因此平均光漂白时间约为60 s。
在连接新的蛋白脂质体用于下一轮运输记录之前，用2 ml的缓冲液洗涤样品室，并按照S tep F 7的方法漂白所有残留的荧光分子。重复小号TEPS ˚F 10 ˚F 15。

数据一nalysis

使用SPARTAN执行smFRET数据分析，SPARTAN是用MATLAB编写的可免费获得的定制软件包（Juette等，2016）。这提供了在SPARTAN （https://www.scottcblanchardlab.com/software）中实现的粒子检测和荧光轨迹生成的详细说明。
使用“ gettraces”模块处理以TIFF格式收集的数据文件，以检测单个分子并提取随时间变化的荧光变化。纠正串扰。此模块创建带有.rawtraces扩展名的输出文件。可以使用SPARTAN中实现的“ crosstalkcorrect”函数来计算串扰值，该函数计算在给定数据集中的所有轨迹上的受体发生光漂白之后，受体的光漂白后观察到的平均受体强度，其中受体在供体之前被光漂白。此功能需要一个。rawtraces文件，并返回串扰值以及用于计算它的轨迹百分比。
处理。来自“自动跟踪”模块中第2步的原始跟踪文件。应用FRET寿命，背景噪声，施主眨眼事件的次数以及Juette等人的补充表1中所述的信噪比的默认参数。（2016）。对于每个单分子轨迹的第一帧的FRET效率，我们还应用了0.4的下限阈值和0.7的上限阈值。我们选择基于十万ccPEB1a单分子轨迹的分析这些阈值在“描述的工程L-ASP传感器”部分，示于图URE在1B Ciftci等。（2020年）。FRET效率值超出0.4-0.7范围可能对应于变性的ccPEB1a。
手工检查从“所选择的轨迹自动跟踪”使用“模块sorttraces”模块。丢弃轨迹具有多个供体或受体光漂白步骤，其indicat上课多于一个的传感器每囊泡的存在或非特异性标记的传感器。丢弃还轨迹，显示在视觉上明显缺乏供体和受体强度之间的反相关性（图URE 4）。
通过使用指定为' No' ，' All'或' Best'的垃圾箱，在' sorttraces '中将轨迹分为响应和非响应。分别保存响应轨迹和非响应轨迹。图。Ciftci等人的补充信息中的S5 。（2020），示出了响应轨迹的示例（图URE 4）。
手动记录在该FRET效率开始于在一个EXCEL文件的第一列中的每个单分子的轨迹增大时间点response_times.xlsx使得在轨迹的顺序responding_molecules.traces文件在响应时间条目的顺序匹配response_times。 xlsx 。因此，响应时间在1个检测到的第一轨迹是1个第一行中，响应时间检测到2次轨迹是在2次行，等等记录在任何轨迹观察到的第一行的最短响应时间第二栏；这个数字非常适合激活缓冲液的注入时间。仅在步骤7中使用MATLAB脚本TurnoverTime.m时，跟踪订单才是重要的。
在初始逐步增加之后，将FRET效率的逐渐增加拟合为与时间有关的绑定方程式，以获得平均周转时间。Ciftci等人的“材料和方法”部分“ smFRET运输轨迹的分析” 。（2020）解释了这个方程的推导。（可选）使用MATLAB脚本TurnoverTime.m （https://github.com/hdciftci/SingleMoleculeTransportAssay.git）拟合数据。该脚本是根据SPARTAN软件（https://www.scottcblanchardlab.com/software）中的avgFretTime.m脚本进行修改的，并且需要两个输入文件。在responding_molecules.traces和response_times.xlsx 。此脚本输出的Rate_constants.csv将具有适合的周转时间以及方程式中使用的其他优化参数。
在减去激活缓冲液注入时间（对应于前半个循环时间）和平均周转时间后，绘制响应时间的分布。在Ciftci等人中，我们将PRISM（GraphPad Software，Inc.）用于所有直方图，并将Origin（OriginLab Corp.，Northampton，MA，USA）用于人口等高线图。（2020年）。Ciftci等人的数据。（2020）是至少3个独立实验的平均值。
有关分析方法的更详细说明，请参见Ciftci等人的材料和方法“ smFRET轨迹分析”部分。（2020年）。的步骤和实例数据A概括视图显示在图URE 3和图URE分别为4。

图3 。数据分析流程图

图4.从“数据分析”中描述的步骤生成的示例数据。（步骤1-2）针对串扰校正荧光强度，并使用“ gettraces”模块拾取单个分子。（第3步）使用“自动跟踪”模块提取供体和受体分子的荧光强度以及所提取分子的相应FRET效率。（步骤4-5）荧光轨迹被检查其反相关和响应模式使用“sorttraces”模块，并相应地分类为应答或无应答的分子。没有反相关和/或显示多个施主或受主光漂白步骤的轨迹被排除在进一步分析之外。（步骤6）的响应时间被手动检测并记录在Excel工作表。（步骤7）的平均周转时间是使用计算出的“周转时间”脚本。

菜谱

重悬缓冲
10 mM的Tris-HCl ，pH 8.0

2毫米EDTA

0.5 M蔗糖

洗涤缓冲液
10 mM Tris-HCl，pH 7.4

200毫米氯化钠

1 mM三（2-羧乙基）膦（TCEP）

40毫米咪唑

洗脱缓冲液
10 mM Tris-HCl，pH 7.4

200毫米氯化钠

1 mM三（2-羧乙基）膦（TCEP）

250 mM咪唑

体积排阻色谱（SEC）缓冲区
50 mM HEPES / Tris ，pH 7.4

200毫米氯化钾

cysGlt Ph SEC缓冲区
20 mM HEPES / Tris，pH 7.4

200毫米氯化钠

0.1 mM L-天门冬氨酸

1毫米DDM

休息缓冲
50 mM HEPES / Tris，pH 7.4

200毫米氯化钾

非激活缓冲区
50 mM HEPES / Tris pH 7.4

200毫米氯化钾

1 µM L-天冬氨酸

激活缓冲区
50 mM HEPES / Tris，pH 7.4

200毫米氯化钠

1 µM L-天冬氨酸

T50缓冲器
10 mM Tris / HCl，pH 7.4

50毫米氯化钾

cysGlt Ph重悬缓冲液
20 mM HEPES / Tris，pH 7.4

200毫米氯化钠

1 mM EDTA，pH 7.4

增溶缓冲液
50 mM HEPES / Tris，pH 7.4

200毫米氯化钠

1毫米TCEP

1 mM L -asp

致谢

我们感谢Roger Altman为smFRET设备所做的准备。资金：OB和SCB的NINDS R37NS085318，SCB的AHA 19PRE34380215到HDC 7R01GM098859的SCHA该项目已获得Maire Sklodowska-Curie拨款协议MEMDYN No 660083（GHMH）的欧盟Horizon 2020研究与创新计划的资助。这项工作最初以Ciftci等人的身份出版。（2020）。

利益争夺

渣打银行持有Lumidyne Technologies的股权。

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