材料和试剂

答。rna酶H1和H2的表达与纯化

1. 阿米康® 超离心过滤器，0.5 ml 10K（EMD密理博，目录号：UFC5010BK）

2. 阿米康® 超离心过滤器，0.5 ml 3K（EMD密理博，目录号：UFC5003BK）

3. Econo柱（2.5*20 cm）（Bio-Rad，目录号：7374252）

4. E。大肠杆菌RosettaTM 2（DE3）pLysS SinglesTM感受态细胞–Novagen（Sigma，目录号：71401）

5. Ni NTA琼脂糖（Qiagen，目录号：1018244）

6. 谷胱甘肽超流树脂（Takara，目录号：635607）

7. 预分解蛋白酶plus（自制；也可使用商业酶）

8. 氨苄西林（Bioshop，目录号：AMP201.100）

9. LB肉汤磨坊（Bioshop，目录号：LBL407.500）

10. 白蛋白，牛血清（Bioshop，目录号：ALB001.100）

11. 溶菌酶（Bioshop，目录号：LYS702.5）

12. 咪唑（OmniPur）（密理博，目录号：5710-OP）

13. 甘油（Bioshop，目录号：GLY001.4）

14. IPTG（Bioshop，目录号：IPT002.5）

15. 核糖核酸酶H2提取缓冲液（见配方）

16. 核糖核酸酶H1裂解缓冲液（见配方）

17. 核糖核酸酶H1洗涤缓冲液（见配方）

18. 核糖核酸酶H1洗脱缓冲液（见配方）

19. RNase H大小列缓冲区（见配方）

20. 核糖核酸酶H储存缓冲液（见配方）

21. 蛋白酶抑制剂（见配方）

B。蛋白酶抑制剂和添加剂

1. TLCK（西格玛，目录号：T7254）

2. 苯甲脒（Bioshop，目录号：BEN601.25）

3. 胃蛋白酶抑制剂A（Bioshop，目录号：PEP605.25）

4. 1,10-菲咯啉（Sigma，目录号：131377-5G）

5. PMSF（Fisher Scientific，目录号：19538125）

6. 抑肽酶（Bioshop，目录号：APR200）

7. 亮肽（Bioshop，目录号：LEU011.50）

8. NP40（Nonidet P40替代品，Fluka目录号：74385）（可替代Sigma，目录号：74385）

9. DTT（Bioshop，目录号：DTT002.100）

C。核糖核酸酶H1和H2活性测定

1. rNTP（NEB，目录号：N0450S）

2. UTP公司α-P32（Perkin Elmer，目录号：BLU007H250UC）

3. T7 RNA聚合酶（NEB，目录号：M0251L）

4. 子系统控制器20× (（见食谱）

5. 柠檬酸三钠（Bioshop，目录号：CIT001.205）

D。胚胎采集果蝇

1. 飞瓶

2. 俄勒冈州R苍蝇（DrÉ里克洛écuyer实验室；可通过布鲁明顿果蝇库存中心购买）

3. 琼脂A（Bioshop，目录号：FB0010）

4. 糖（红道）

5. 苹果汁

6. 替戈塞普，1 KG（尼泊金）（Diamed.ca，目录号：GEN20-258）

7. 自制NITEX筛子（可从https://flystuff.com/)

8. 漏斗

9. 苍蝇笼（苍蝇笼、食物和瓶子可从https://flystuff.com/)

10. 苍蝇食品（内部准备）

11. 甲醇（Bioshop，目录号：MET302.4）

12. 胚胎裂解缓冲液（见配方）

13. 苹果汁盘（见食谱）

14. 1× PBS（见配方）

15. 1× PBT（见配方）

E。细胞培养

1. S2细胞（Invitrogen，目录号：R69007）

2. GibcoTM-Schneider果蝇无菌培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：21720-024）

3. FBS（赛默飞世尔科技，目录号：16140-089）

F。核酸提取与制备

1. 蛋白酶K（Biobasic，目录号：PB0451）

2. 重型锁相凝胶（VWR，目录号：10847-802）

3. 脱氧核糖核酸酶I（无核糖核酸酶）（NEB，目录号：M0303L）

4. AmbionTM RNase III（赛默飞世尔科学公司，目录号：AM2290）

5. 核糖核酸酶A（Qiagen，目录号：19101）

6. UltraPureTM DNase/RNase游离蒸馏水（赛默飞世尔科技，目录号：10977015）

7. Covaris microTUBE AFA光纤预裂扣盖6*16 mm（Covaris，目录号：520045）

8. 苯酚氯仿异戊醇（Bioshop，目录号：PHE512.400）

9. 氯仿（Bioshop，目录号：CCL402.1）

10. 试剂酒精（Sigma，目录号：277649-1）

11. Tris（Bioshop，目录号：TRS001.10）

12. 冰醋酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：351271-212）

13. EDTA（Bioshop，目录号：EDT002.500）

14. 醋酸钠（Bioshop，目录号：SAA304.5）

15. 氯化钠（Bioshop，目录号：SOD002.10）

16. 1× 核糖核酸酶H缓冲液（见配方）

17. TE（见配方）

G。滴水

1. 抗DNA–RNA杂交[S9.6]抗体（Kerafast，目录号：ENH002，杂交瘤可通过ATCC获得，HB-8730）

2. 免疫沉淀用DynabeadTM蛋白G（赛默飞世尔科学公司，目录号：10004D）

3. 核自旋® 凝胶和PCR（Macherey Nagel，目录号：740609.250）

4. DNA清洁与浓缩TM（Zymo Research，目录号：D4014）

5. BSA，分子生物学级（NEB，目录号：B9000S）

6. 10× 滴胶缓冲液（见配方）

7. 1× 滴胶缓冲液（见配方）

8. 滴洗液缓冲液（见配方）

H。库准备和qPCR

1. 下一个® Illumina的复合寡糖® (索引引物组1）（NEB，目录号：E7735S）

2. 下一个® 用于Illumina的UltraTM II定向RNA文库准备工具包® (NEB，目录号：E7760S）

3. RNase H（新英格兰生物实验室（NEB），目录号：M0297L）

4. 通电SYBR绿色PCR主混合物（赛默飞世尔科技，目录号：A25741）

一。琼脂糖和SDS-PAGE凝胶的制备和染色

1. SYBRTM金核酸凝胶染色剂（赛默飞世尔科技，目录号：S11494）

2. SYPRO Ruby解决方案（Lonza，目录号：50562）

3. 甘氨酸（Bioshop，目录号：GLN001.10）

4. 0.5× TBE（见配方）

5. 10× DNA加载缓冲液（见配方）

6. SDS-PAGE缓冲液（见配方）

7. 蛋白质装载缓冲液（见配方）

J。质粒

1. pHis-MBP-hRNaseH1（Alecki等人，2020年）

2. pGEX6P1-hsRNASEH2BCA（Addgene，目录号：108693）3。vg pETBlue（Alecki等人，2020年）

设备

1. 用于凝胶内荧光成像和磷光成像的Typhone Imager（GE Healthcare）

2. 用于实时PCR的Viaa7 PCR系统（Thermo Fisher Scientific）

3. Covaris E220（Covaris）用于核酸超声

4. 离心机Avanti® J-E（贝克曼库尔特）

5. AKTA FPLC（或等效色谱系统）

6. HiLoad 20/60 Superdex 200列（GE Healthcare，目录号：GE28-9893-36）（可从Sigma获得）

7. Superdex 200 10/300 GL尺寸排除列（GE Healthcare，目录号：28990944）

8. 超声波仪（Sonics，Vibra cellsTM）（细胞裂解探头超声波仪）

9. Nutator旋转平台，轻轻混合管

10. 细菌振动器

11. 10cm培养皿

12. 速冻用液氮

13. -80°冷冻机

14. 纳米滴分光光度计

15. 水浴

16. 24°C培养箱

17. 27°C S2细胞摇瓶培养箱；S2细胞也可以在室温下在平板上生长

程序

答。rna酶H1和H2的表达与纯化

1. 核糖核酸酶H1的表达和纯化（图3A-3D）

答。转换E。大肠杆菌Rosetta细胞与pHis-MBP-hRNaseH1。第二天，接种2毫升乙氨苄西林（100纳克）/µl）只有一个菌落，让它在37岁时正常生长°在摇动的培养箱里。

b。将（a）中的1 ml培养物添加到200 ml LB氨苄西林中，并使其在37℃O.N.下生长°在摇动的培养箱里。

c。将（b）中的100 ml培养物添加到1 L LB氨苄西林中，并在37℃下用0.1 mM IPTG诱导RNase H1表达4 h°C。

d。在4000℃下离心20分钟收获细胞× g、 4个°C。

e。丢弃上清液，在液氮中冷冻细胞颗粒，并在-80℃下储存至少几个小时°C。

f。在冰上解冻细胞颗粒，并添加含有0.1 mg/ml溶菌酶的20 ml RNase H1裂解缓冲液，100µ核糖核酸酶A，100µg DNA酶I和蛋白酶抑制剂。

g。在冰上孵育30分钟。

h。将细胞置于冰上，以60%的振幅超声12次，打开15秒，关闭15秒。

一。在20000℃下离心20分钟× g、 4个°C。

j。保留上清液作为粗提物。上清液可在液氮中冷冻并在-80℃下储存°用于将来的净化。

k。在50 ml试管中用15 ml RNase H1裂解缓冲液在207℃下离心2 min，洗涤3 ml Ni-NTA珠3次× g。

l。将粗提物添加到珠子中，并在4℃培养°在一个螺母上。从这个步骤开始，所有的洗涤和洗脱必须在4点钟进行°以确保最低限度的蛋白质降解。

m。用核糖核酸酶H1裂解缓冲液洗涤Econo柱，并将珠子和粗提物转移到柱中。

n。保存流通（如果所有的核糖核酸酶H1蛋白没有结合到珠，流通可以与Ni-NTA树脂第二次孵育）。

o。用补充有蛋白酶抑制剂的15毫升核糖核酸酶H1洗涤缓冲液洗涤4次，收集每次洗涤液。

第。用含蛋白酶抑制剂的3ml核糖核酸酶H1洗脱缓冲液洗脱蛋白5次；收集1毫升的部分。

问。荷载2.5µl在10%SDS-PAGE凝胶上，按照制造商的说明用SYPRO Ruby染色（图3B）。

r。将具有类似浓度的洗脱液汇集并用1L冷冻RNase H储存缓冲液透析。

s。在AKTA FPLC上平衡HiLoad 20/60 Superdex 200尺寸排除柱，23 CV 20 mM Tris-HCl pH 7.0，含150 mM NaCl和0.2 mM PMSF，4°C级

（平衡可在夜间进行）。

t。将样品浓缩至≤ 如有必要，5毫升。离心机≥ 10,000 × g，4分钟时持续10分钟°C去除任何沉淀物并在Superdex 200柱上加载。

美国。在4处运行Superdex 200列°C。收集1.5毫升部分。

五。运行5µl在10%SDS-PAGE凝胶上，用SYPRO Ruby染色。

w。将不含降解产物的含有RNase H1蛋白的部分汇集在一起，并在4℃O.N.透析两次°C对2L冷冻RNase H储存缓冲液。

十。按照制造商的说明，用Amicon ultra柱10000 MCWO浓缩蛋白质2-3倍，以获得0.5-1的蛋白质浓度µ克/µl。

是的。等分，在液氮中冷冻，在-80℃下保存°C。

z。运行2.5µl在10%SDS-PAGE凝胶上，用SYPRO Ruby染色，以确认制剂的质量（图3D）。

aa级。使用消光系数=81050 M-1cm-1和MW=32 kDa测定纳米滴上的蛋白质浓度。对于1L培养物，预计约9mg纯化RNase H1。

图3。人核糖核酸酶H1和H2蛋白的制备。答。核糖核酸酶H1和H2的表达与纯化综述。B-C。核糖核酸酶H1（B）和核糖核酸酶H2的SDS-PAGE凝胶，以及（C）在Ni-NTA或GST柱上的诱导和纯化。D。纯化透析后RNA酶H1和H2蛋白SDS-PAGE凝胶，SYPRO-Ruby染色。E-F。与核糖核酸酶H1（E）或核糖核酸酶H2（F）孵育后转录的DNA的琼脂糖凝胶，表明这两种酶都是活性的并降解RNA-DNA杂交。

2. 核糖核酸酶H2的表达和纯化（图3A-3D）

答。转换E。大肠杆菌Rosetta细胞与pGEX6P1-hRNASeh2BCA。接种两个5毫升的LB氨苄青霉素发酵剂（100 ng/µl）只有一个菌落，37岁时生长正常°他颤抖着。

b。第二天，用10mL培养液接种1L-LB氨苄西林，在37℃下培养4h°在一个螺母上。

c。让培养物在室温下静置1小时以冷却。节省500µ在SDS-PAGE凝胶上作为未导入部分。

d。用0.1 mM IPTG O.N.在20°他颤抖着。

e。在15000℃下离心20分钟收获细胞× g、 4个°C。

f。将小球重新悬浮在15 ml 1× 含有0.2%吐温-20、10 mM MgCl2和蛋白酶抑制剂的PBS。

g。在液氮中冷冻，37℃解冻°C（3次）促进细胞溶解。

h。在冰上超声30次，打开30秒，关闭30秒，振幅为60%。

一。在20000℃下离心20分钟× g、 4个°C将细胞碎片制成颗粒。

j。将上清液作为粗提物保存并运行10µl在12%SDS-PAGE凝胶上验证诱导。粗提物可在液氮中冷冻并在-80℃下储存°用于将来的净化。

k。用1.5毫升谷胱甘肽超流珠洗3次× 核糖核酸酶H2提取缓冲液。

l。将粗提物添加到珠子中，并在4℃培养°在一个螺母上。其余步骤应在4点执行°C。

m。用10毫升1洗两次珠子× 核糖核酸酶H2提取缓冲液，含蛋白酶抑制剂和一次4毫升1× 不含蛋白酶抑制剂的核糖核酸酶H2提取缓冲液。

n。将珠子重新悬浮在2 ml 1× 萃取缓冲液补充25µg预分解蛋白酶plus（我们自己准备预分解；也可使用商业酶）。

o。在4℃培养°在一个螺母上。

第。收集含有分裂前裂解释放的核糖核酸酶H2的流通液。

问。用1重复孵育× 核糖核酸酶H2提取缓冲液和预分解蛋白酶。

r。分析10µl输入和清洗，1µ每次洗脱，10µ12%SDS-PAGE凝胶上的l珠。

s。按照制造商的说明用SYPRO Ruby染色凝胶（图3C）。

t。将含有蛋白质的洗脱液汇集在一起，按照制造商的说明，用Amicon ultra柱3000 MCWO将其浓缩5倍。最终浓度应为~30 mg/ml，体积为~750µl。

美国。用含有150 mM NaCl和0.2 mM PMSF的2 CV 20 mM TrisHCl pH 7.0平衡24 ml Superdex 200 10/300 GL尺寸排除柱。

五。将核糖核酸酶H2加载到柱上并收集500-µl分数。

w。运行5µl在12%SDS-PAGE凝胶上，用SYPRO Ruby染色。

十。将含有核糖核酸酶H2复合物的所有组分汇集在一起，并在4℃O.N.透析°C对1L冷冻RNase H储存缓冲液。

是的。等分，在液氮中冷冻，在-80℃下保存°C。

z。运行0.1、0.5和2.5µl在12%SDS-PAGE凝胶上，靠近标准稀释的BSA，并用SYPRO Ruby染色以测定蛋白质浓度（图3D）。

aa级。对于2L培养物，预计约5mg纯化RNase H2三聚体。

3. 核糖核酸酶H1和H2的活性测试（图3E-3F）

含有易于形成R-环的序列的质粒被转录并用作测量RNase H1或RNase H2降解R-环的能力的模板。我们使用一个质粒将vg预克隆到pETBlue中（Alecki等人，2020）。答。在冰上组装（表2）。

表2。体外转录分析

最终浓度

体积(µ（左）

Tris HCl 1 M pH 8.0

40毫米

2

氯化镁100毫米

8毫米

4

氯化钠1 M

25毫米

1.26

亚精胺100 mM

2毫米

1

DTT 1米

30毫米

1.5

ATP 1毫米

40牛米

2

CTP 1毫米

40牛米

2

GTP 1毫米

40牛米

2

UTP 1毫米

8牛米

0.4

UTP公司α-第32页

2.6牛米

0.2

DNA（vgcorePRE-pET）100纳克/µ我

5

T7 RNA聚合酶（NEB）

0.125

不含H2O-DNase/RNase

30.3

最终卷

50

b。30℃孵育30分钟°C。

c。在65℃加热样品10分钟，停止反应°C。

滴定核糖核酸酶H1或核糖核酸酶H2。

d。在冰上组装（表3）。

表3。纯化rna酶H1或rna酶H2的活性检测

每反应(µ（左）

不含H2O-DNase/RNase

5

10× 核糖核酸酶H缓冲液

1

转录vgcorePRE-pET

3

核糖核酸酶H1或核糖核酸酶H2

1

最终卷

10

在储存缓冲液中制备RNase H1（10倍步骤）或RNase H2（5倍步骤）的连续稀释液。

e。37℃孵育1小时°C。

f。添加1µ长10× DNA装载缓冲液。

g。装入1%琼脂糖0.5× TBE凝胶。

h。用SYBRGold和image染色。

一。将凝胶在H2O中培养15分钟。

j。在75 mM NaOH中培养凝胶20分钟。

k。在0.5 M Tris-HCl 1.5 M NaCl中培养凝胶15分钟。

l。将凝胶在6分钟内孵育30分钟× 子系统控制器。

m。将凝胶O.N.转移到HYBOND膜上（向下转移），芯线为20× 子系统控制器。

n。将膜暴露在磷光成像仪屏幕上。

o。在台风或等效的磷光成像仪上扫描（图3E-3F）。

B。胚胎采集

注意：此站点(https://openspim.org/Drosophila_embryo_sample_preparation)提供了一个更详细的解释如何收集胚胎。

1. 把5瓶苍蝇转移到一个笼子里，笼子里有一个10厘米长的苹果汁盘子，上面涂上酵母膏，让苍蝇产卵。为了收集足够的胚胎，使用2-4个笼子。

2. 让苍蝇在苹果汁盘上产卵1小时，然后开始定时收集。

3. 更换苹果汁盘子，让苍蝇产卵4小时。

4. 更换苹果汁平板，让胚胎在平板上的培养箱中老化2小时或10小时，以收集2-6小时或10-14小时的果蝇胚胎。

5. 取出酵母，加入用H2O稀释1:2的家用漂白剂，将胚胎孵育2分钟，使其脱胚。

6. 将胚胎移植到自制的筛子上（我们在50毫升试管的盖子上切一个大洞，在上面粘上尼龙网（细胞过滤器（40-100））µm筛孔大小）也可使用）并用水冲洗。

7. 用纸巾擦干多余的液体，并将胚胎转移到预先称重的1.7毫升试管中。

8. 记录胚胎的重量，在液氮中冷冻，在-80℃下保存°C。

C。从果蝇胚胎中提取核酸注释：

答。为了有足够的材料来做一个滴滴顺序实验，从500开始μl或200mg胚胎

b。在用甲醇清洗胚胎之前，胚胎会粘在塑料上。为了尽量减少材料的损失，在甲醇洗涤之前，只使用玻璃瓶和玻璃移液管；8毫升的玻璃闪烁小瓶在这一步效果很好。在核酸制备的所有步骤中，都使用低结合管和尖端。

1. 转移500μ1或200毫克胚胎放入玻璃瓶中。

2. 用4毫升1.5毫升的水冲洗胚胎× 公共广播公司。

3. 取出PBS，用4毫升1× PBT公司。

4. 将胚胎移植到一个装有3毫升的瓶子里× PBS和3毫升正庚烷。

5. 摇动几秒钟以混合这两个阶段。

6. 去除下相（PBS），保持相间完整。

7. 加入3毫升甲醇，剧烈摇晃1分钟。

8. 拆下顶部和中间相。

9. 用3毫升甲醇清洗胚胎。

10. 将胚胎移植到15毫升试管中，用4毫升1× 公共广播公司。

11. 再将胚胎置于4ml胚胎裂解缓冲液中，于50℃孵育2h°C。每隔15分钟，将试管倒置混合。

12. 离心机转速4000× g保持15分钟。将上清液转移到50 ml试管中。

13. 加入4毫升苯酚/氯仿/异戊醇。孵育1小时的章动器在4°C。

14. 离心机转速4000× g保持15分钟。将上相转移到50 ml试管中。

15. 加入4毫升苯酚/氯仿/异戊醇。孵育1小时的章动器在4°C。

16. 离心机转速4000× g保持10分钟。将上相转移到干净的50 ml试管中。

17. 加入4毫升氯仿/异戊醇。孵育1小时的章动器在4°C。

18. 离心机转速4000× g保持10分钟。将上相转移到干净的50 ml试管中。

19. 为了沉淀核酸，加入200μl 3 M KOAc pH 5.2和2.8 ml异丙醇。孵育30分钟的章动器在4°C。

20. 将白色细丝轻轻转移到1.7毫升含有1毫升70%乙醇的微管中。用1毫升的移液管尖或从200毫升的吸液管上切下一端-µl移液管尖端转移细丝而不断裂。

21. 在不离心的情况下，用1 ml 70%乙醇清洗3次。

22. 尽可能去除乙醇。

23. 1000℃离心1分钟× g并除去乙醇。可重复此步骤以去除残余乙醇。

24. 根据颗粒的大小，将核酸颗粒风干1-4小时（直到其变得透明）。

25. 在4分钟时在1ml TE O.N.中重新悬浮°在一个螺母上。在这个步骤中，核酸是粘性的。核酸可以在-20℃保存几周°C在核酸酶消化和纯化前进行滴注。

D。果蝇S2细胞核酸的提取

1. 果蝇S2细胞在含10%FBS的Schneider培养基中室温培养。

2. 转移2×107个细胞放入50毫升试管中。

3. 在500磅的温度下把细胞压碎× 5分钟。

4. 取上清液，用10ml 1.5ml洗涤细胞颗粒× 公共广播公司。

5. 在500磅的温度下把细胞压碎× 5分钟。

6. 将细胞重新悬浮于3 ml TE中并转移至3个1.7 ml试管中。

7. 加26μl 20%十二烷基硫酸钠和60%μg每管加入蛋白酶K。将试管倒置几次，轻轻搅拌。

8. 37℃孵育O.N°C。

9. 转移至2毫升锁相管。

10. 加入1体积苯酚/氯仿/异戊醇。摇动并在14000下离心× 5分钟。

11. 将上清液转移到含有2.4体积100%乙醇和1/10体积3 M NaOAc pH 5.2的50 ml管中。

注：可以用果蝇胚胎用KOAc代替NaOAc。

12. 轻轻翻转试管以沉淀核酸。

13. 将核酸转移到含有1毫升70%乙醇的1.7毫升试管中。

14. 在不离心的情况下，用1毫升70%乙醇清洗5次，尽可能多地去除乙醇。

15. 去除所有乙醇。

16. 1000℃离心1分钟× g并除去所有乙醇。可重复此步骤以去除残余乙醇。

17. 将核酸颗粒风干几个小时，直到颗粒变透明。

18. 在4分钟时在1ml TE O.N.中重新悬浮°在一个螺母上。在这个步骤中，核酸溶液是粘性的。核酸可以在-20℃保存几周°C在核酸酶消化和纯化前进行滴注。

E。核酸酶消化和超声波处理

注：纳米滴上的所有测量均使用dsDNA参数进行。为测量纳米滴上的浓度并在凝胶上运行而收集的样品为：1）在核糖核酸酶a处理前和2）在核糖核酸酶a处理后；3）超声处理后；4，5）在RNase III+/-RNase H治疗后。

1. 在纳米滴上定量核酸（浓度应在2%左右μ克/μl和A260/A280

≥ 2.0).

2. 运行1μ1%琼脂糖上的l核酸× 用TAE凝胶验证gDNA是否完整。用SYBR金染凝胶。gDNA应该在10kb以上，RNA涂片应该在100bp到1.5kb之间可见。

3. 核糖核酸酶A消化：在0.5 M NaCl和0.1 mg/ml核糖核酸酶A存在下培养250 mg核酸，最终体积为1.5 ml，在37℃下培养3 h°C。

4. 转移到2毫升的锁相管中，加入1体积的苯酚/氯仿/异戊醇。

5. 用力搅拌并在14000下离心× 5分钟。

6. 转移500μl上相至1.7 ml试管，试管中含有1 ml 100%乙醇和50%μl 3 M NaOAc pH 5.2。

7. 轻轻翻转以沉淀核酸。

8. 将核酸转移到一个1.7毫升的试管中，试管中含有400个核酸μl 70%乙醇。

9. 去除所有乙醇。

10. 根据颗粒的大小，将核酸干燥10-30分钟。

11. 在500分钟后重新使用μ轻轻上下移液，在冰上培养至少30分钟。

12. 在纳米滴上测量核酸的浓度，并将体积调整到40 ng以下的浓度/μl（A260/A280应为1.8–2.0）。保存1μl在琼脂糖凝胶上运行，以验证游离RNA的完全降解。

13. 使用Covaris E220进行超声波处理：将样品分成130份-µl等分（~5µg）在130里做超声波检查-µ科瓦里斯微管。使用以下参数进行超声波检测（表4）：

表4。使用Covaris E220的超声波参数

峰值入射功率（W）

140

占空因数

10%

每脉冲周期数

200

治疗

80

14. 把超声波处理过的核酸放在一起。

15. 保存1μ我要装上凝胶来验证超声波。从超声前10 kb以上的带，超声后应观察到平均大小为300-400 bp的涂片。

16. 核糖核酸酶H和核糖核酸酶III消化：将步骤14中的核酸分成两份。在两份等分试样上加100µ长10× 核糖核酸酶H缓冲液和2单位的核糖核酸酶III。使体积达到1毫升。向一份等分试样（经核糖核酸酶H处理）中添加10μ核糖核酸酶H1和10μ核糖核酸酶H2。

17. 将两种消化液在37℃下培养°C。

18. 转移到2毫升的锁相管中，加入1体积的苯酚/氯仿/异戊醇。

19. 用力搅拌并在14000下离心5分钟× g。

20. 转移500μl上相至1.7 ml试管，试管中含有1 ml 100%乙醇和50%μl 3 M NaOAc pH 5.2。

21. 轻轻翻转以沉淀核酸。

22. 在16000下离心15分钟× g。

23. 去除上清液并用400%的水冲洗颗粒μl 70%乙醇。

24. 在16000下离心5分钟× g并除去所有乙醇。

25. 使核酸颗粒干燥约10分钟。

26. 400分钟后恢复μ轻轻上下移液，在冰上培养至少30分钟。

27. 在纳米滴上测量浓度并保存1μ我想在凝胶上跑步。此测量值用于计算4.4所需的体积µg用于滴水（滴水步骤F2a）。

28. 在1%琼脂糖1上分析程序每个步骤（步骤E1-E5）的试验小份× TAE凝胶和SYBR金染色（图4A）。核酸可以在20℃保存几天°C滴液前。

图4。滴注和核酸制备. 答。果蝇胚胎核酸的制备。从胚胎中提取的总核酸（左）。核糖核酸酶A消化后和超声波处理前的核酸（中）。超声波和核糖核酸酶III+/-核糖核酸酶H消化后的核酸（右）。B。在2-6小时和10-14小时果蝇胚胎上进行滴注实验的输入和洗脱。在洗脱液中观察到微弱的涂片，但在经RNase H处理的样品的洗脱液中没有观察到。

F。点滴注意事项：

答。对于滴注，所有步骤都使用低保留管和移液管头进行。

b。为了测序，我们平行进行了3次上述滴注实验，并在最终纯化后汇集洗脱液。

1. 胎圈准备

答。洗40μl蛋白G动态珠两次，含1× 含5 mg/ml BSA的PBS。

b。在第1卷的第2卷中重新使用珠子× 含5 mg/ml BSA的PBS，加入10μg S9.6抗体。

c。在4℃培养°在一个螺母上。

d。将珠子用1× 含5 mg/ml BSA的PBS。

e。将抗体结合珠放在冰上或4°C。

2. 滴水

答。每滴稀释4.4μg先前纯化的DNA（步骤E27），基于440中的纳米滴测量μ特加50μ长10× 滴胶缓冲液。

b。节省50μl用于输入，并用S9.6-O.N.在4℃孵育剩余样品°C旋转。

c。使用磁性支架捕获珠子30 s，去除上清液，将珠子重新悬浮在700中μl 1级× 滴注结合缓冲液，在RT下旋转培养10分钟。

d。重复洗两次，共洗3次。

e。将珠子重新悬浮250分钟μl滴洗液缓冲液和140μg蛋白酶K。

f。50℃孵育45分钟°C类；每5分钟翻转一次管子。

g。收集上清液（IP/洗脱）。

3. 输入和IP净化

注：核酸在两个连续的柱上纯化，第一个柱用于从样品中去除SDS。

答。输入和IP在Macherey-Nagel（MN）PCR净化柱上使用NTB缓冲液按照试剂盒说明进行纯化。用50%乙醇进行洗脱μl MN洗脱缓冲液。

b。输入和洗脱在Zymoresearch DNA纯化柱上按照试剂盒说明进行纯化。洗脱输入和IP 50μl 10 mM Tris-HCl pH 8.0。对于测序，用8.5洗脱IPμl 10 mM Tris-HCl pH 8.0，将3个IPs混合在一起。

c。运行2μl每个样品放在1.5%琼脂糖溶液中× TAE凝胶并用SYBR金染色至少1小时。涂片应在IP中可见，但在RNase H处理的IP中不可见（图4B）。我们在零下二十点把样品存放一夜°第二天准备图书馆。也可以将样品储存在-80°C几个星期直到图书馆准备。

G。库准备和qPCR

1. 使用NEBNext准备库® 用于Illumina的UltraTM II定向RNA文库准备工具包®.

笔记：

一。RNA-DNA杂交的DNA部分从第二条合成链开始测序；RNA部分在RNA酶H消化的第二链合成中被去除。

二。PCR循环次数根据核酸量按照制造商的说明确定（步骤G1a）。

答。估计IP中的物质量并输入生物分析仪。核酸的量应该在1ng以上才能形成文库（图5A）。

图5。滴灌库准备. 在（A）和（B）文库制备之前，从10-14小时胚胎中输入和洗脱。洗脱液由生物分析仪定量。同样量的输入和RNase H洗脱用于制备文库。由于我们无法确定存在的核酸量，因此使用经核糖核酸酶H处理的核酸的整个免疫沉淀样品来制备文库。

b。调整IP的输入量。对于RNase H处理的IP，回收的物质量无法定量。我们使用整个样本，并且能够生成一个高复杂度的库，尽管读取的次数通常是2-5次× 低一点。

c。使用Illumina的NEB RNA Ultra II制备文库，从第二链cDNA合成步骤开始（表5）。

表5。改进的第二链合成反应
第二链合成反应

体积

输入和IP

20μ我

含dUTP混合物的第二链合成反应缓冲液（10×)

8μ我

第二链合成酶混合物

4μ我

随机引物

1μ我

核糖核酸酶H（NEB），1.6 U

0.3μ我

无核酸酶水

46.7μ我

d。冰上组装，16℃孵育1小时°C。

e。对于接下来的步骤，请按照套件说明进行操作。

2图书馆的质量控制

答。使用qPCR，验证R-环在3个阳性位点的富集和在2个阴性位点的缺失（图6；引物序列见表6）。一。稀释1μ我每10个图书馆μ长0.1× 特。

二。使用S2细胞的gDNA建立具有标准曲线的qPCR板。这种gDNA可按D节所述制备，用RNase A消化，并储存在-80°C。我们以10倍的步骤制备稀释系列，从25 ng到0.025 ng/μl使用2μl每一组底漆的qPCR标准（标准曲线为50-5-0.5-0.05 ng总gDNA）。三、qPCR反应（5）μl总容积，在384孔板中运行）包括2.5μ启动SYBR绿色主混合，2μl S2细胞稀释文库或标准基因组DNA，0.25μl各底漆稀释至1μ我在水里。

iv.qPCR在Viaa7仪器上运行，具有40个周期，Tm=60°C、延长时间=1分钟。

图6。库准备后的qPCR。3个阳性和2个阴性位点通过qPCR证实了输入、IP和RNase-H处理IP的滴注和文库制备。

表6。qPCR引物
底漆名称

顺序

啤酒花F

CTACAGCGAAGGTTT公司

R回路（正极）

啤酒花

CTTGATCTCAGGGGTGCGAT公司

德克F

gcgatgaccagagagagag公司

R回路（正极）

德克河

CTTGGACTCATCAGTGGCAT公司

tRNA赖氨酸F

GCCAAGCTCATTTCTACGATCT公司

R环（高转录基因，阳性）

tRNA赖氨酸受体

GTCCGACACGCCGATA公司

特别提款权

ACAGCTGATGTCGCTCACAT公司

无R回路（负）

特别提款权

CGCTGAATGATCACGAGGTGA公司

F20层（CG12754）

tcaagcgaccctaaat公司

无R回路（负）

F20右

AACGCCAACAGAAATG公司

b。使用生物分析仪

一。运行1μl生物分析仪上的每个库（图5B）。

二。碎片的平均大小应该是400bp。

三。在HiSeqTM测序系统上对文库进行测序，每个样本的深度为5000万次读取。这里使用配对末端测序，读取长度为50碱基。

数据分析

Alecki等人（2020）中描述的滴水序列分析的工作流程与标准ChIPseq分析类似。基本的工作流程是修剪适配器、质量控制FASTQ文件、与基因组比对、去除PCR重复和调用峰。该协议与ChIP-seq在峰值调用前按串分割数据的步骤不同，并针对输入和RNase-H处理的样本调用峰值。所有分析步骤都可以在Galaxy（useglaxy.org）上执行，也可以使用简单的bash脚本。该工作流程确定了一组严格的可重复峰，这些峰符合R-环的严格标准（即它们对RNase H敏感）。

笔记：

答。其他人描述了使用RNase H处理样品中读取计数的两倍减少来过滤滴落序列峰（Crossley et al.，2020），而不是比较滴落与RNase H处理滴落中的峰值。这种方法可能更灵活，以适应核糖核酸酶H消化不理想的测序实验，应予以考虑，特别是如果核糖核酸酶H过滤去除大量峰值（>10%）。

b。我们将两个链的峰值一起调用，或者在将bam文件分为正向（F）和反向（R）链之后调用。链特异性分析的信息量更大，因为它可以推断产生RNA的转录方向。一部分峰在两条链上都有Rloop信号（约10%的峰）；我们不知道这些是否是技术工件（Alecki et al.，2020）。有些，特别是在胚胎分析的情况下，可能是混合细胞群的结果。可能需要将其移除以进行下游分析（Crossley et al.，2020），这可以使用bedtools使F和R股相交。

c。Crossley等人（2020年）最近描述了一种合成峰值策略，可用于标准化滴灌序列数据，允许在不同条件下进行定量比较。当比较不同基因型的果蝇时，这可能特别有价值。

1. 使用Trimmomatic（Bolger et al.，2014）或fastp（v0.20.0）（Chen et al.，2018）修剪适配器并去除低质量读数。

2. 使用Bowtie2（v2.3.1）将读数与果蝇基因组对齐（Langmead和Salzberg，

2012年）（-fr–无混合–无联合）。

3. 使用Samtools（v。1.4.1）（Li等人，2009）将Bowtie2生成的sam文件转换为bam文件，对bam文件进行排序，并为每个文件创建bam索引。

4. 使用Picard(http://broadinstitute.github.io/picard). 标记重复项以筛选PCR重复项。

Sambamba（v0.7.1）（Tarasov等人，2015）也可用于此步骤。

5. 使用samtools视图基于samflags生成特定于链的bam文件（对于所有示例：DRIP、RNase H DRIP和Input），如下所示：

前股：samtools视图–f 99；samtools视图–f 147，后跟samtools merge。

反向股：samtools视图–f 83；samtools视图–f 163，后跟samtools merge。要在Galaxy中执行此过程，请使用samtools视图并选择“读取的筛选/子采样选择”；然后设置“需要设置这些标志”的正确组合。例如，对于前向链，首先输出设置了这些标志的–f99读取：–read is paired–read is mapped in a proper pair=mate strand=read is the first in a pair；然后输出–f147读取并设置这些标志；

–read is paired–read映射到适当的一对–read strand=read是一对中的第二个；samtools merge如上所述用于合并f99和f147（F股）以及f83和f163（R股）。

6. 使用MACS2（v2.1.1）（Zhang等人，2008）调用滴灌峰值与输入峰值，使用宽峰值设置，滴灌作为治疗，输入作为对照。例如，对于与果蝇基因组的dm6版本对齐的成对末端bam文件的峰值调用：

（macs2 callpeak–t drill.bam–c drill\u input.bam–f BAMPE–g 1.4e+08–n drill–outdir drill\u peaks–宽）。

7. 使用MACS2调用滴灌峰值与RNase H处理的滴灌峰值，以滴灌为处理，RNase H处理为对照。

8. 使用BEDTools（Quinlan和Hall，2010）intersect保留IP与输入的峰值，以及IP与RNase H IP的峰值（BEDTools intersect–a IP\u与\u peaks.bed中的\u–b IP\u与\u RNaseHIP peaks.bed–u>过滤的\u peaks.bed）。

9. 使用BEDtools intersect只保留两个复制品中的峰。

笔记

1.

该滴注方案包括4个步骤，最关键的是制备用于免疫沉淀的核酸。我们鼓励用户在进行测序之前进行多次滴滴qPCR以确保重复性。

2.

时间线（表7）。

表7。drop-seq对果蝇细胞作用的时间线

胚胎和组织培养

第1天

胚胎采集

组织培养细胞裂解

第2天

胚胎裂解与核酸提取

核酸提取

第3天

核酸制备I+珠制备

第4天

核酸制备Ⅱ+免疫沉淀

第5天

洗珠+洗脱+纯化

第6天

库准备和qPCR

3. 胚胎采集

注意胚胎可以在-80℃下收集和储存°几个月。这个协议可以在一周内完成，但也可以在几个步骤中停止。核酸可以储存在-20°从组织培养细胞或胚胎中提取后，制备核酸（免疫沉淀前）和qPCR或文库制备前几天。

4. 核酸提取与制备

对于细胞裂解后在无蛋白核酸上进行的滴注方案，必须温和地进行细胞裂解和纯化，以避免通过RNA和互补DNA的假退火破坏R-环或产生新的RNA-DNA杂交。因此，从提取到超声，不要高速离心核酸。再悬浮的核酸，不要漩涡；取而代之的是轻轻地上下移液。

5. 滴水

在免疫沉淀之前，可以将其他物种的核酸作为对照的峰值纳入，以使不同样品或实验条件之间的结果正常化（Chen等人，2016）。

食谱

1. 胚胎裂解缓冲液

50 mM Tris-HCl pH 8.0

100毫米乙二胺四乙酸

100毫米氯化钠

0.5%十二烷基硫酸钠

5毫克/毫升蛋白酶K

2. 1× 核糖核酸酶H缓冲液50 mM Tris-HCl

75毫米氯化钾

3毫米MgCl2 10毫米DTT pH 8.3

3. 10× 滴胶缓冲器

100 mM NaPO4 pH 7.0

1.4毫米氯化钠

0.5%Triton X-100

4. 1× 滴胶缓冲器

10× 滴注结合缓冲液在TE中稀释

5. 滴洗缓冲液

50 mM Tris-HCl pH 8.0

10毫米乙二胺四乙酸

0.5%十二烷基硫酸钠

6. TE公司

10毫米Tris pH 8.0

1毫米乙二胺四乙酸

7. 苹果汁盘

3.5%琼脂4%糖

40%苹果汁

0.30%尼泊金在乙醇中稀释（最终体积的2.5%）

8. 核糖核酸酶H2提取缓冲液

1× PBS公司

0.2%吐温-20

10毫米氯化镁

9. RNase H1裂解缓冲液25 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 5 mM咪唑pH 8.0用NaOH调节

10. 核糖核酸酶H1洗涤缓冲液

50毫米Tris-HCl

300 mM NaCl 20 mM咪唑pH 8.0，用NaOH调节

11. 核糖核酸酶H1洗脱缓冲液

50毫米Tris-HCl

300 mM NaCl 250 mM咪唑pH 8.0，用NaOH调节

12. RNase H大小列缓冲区

20 mM Tris-HCl pH 7.0

150毫米氯化钠

使用前立即添加0.1 mM PMSF

13. 核糖核酸酶H储存缓冲液

20 mM Tris-HCl pH 7.5

50毫米氯化钠

1毫米DTT

0.1毫米乙二胺四乙酸

20%甘油

使用前立即添加0.1 mM PMSF

14. 蛋白酶抑制剂和添加剂（表8）

注：用于制备核糖核酸酶H1和H2蛋白质的缓冲液中含有新添加的蛋白酶抑制剂NP40和DTT，但大小柱缓冲液中只添加了PMSF和DTT。

表8。蛋白酶抑制剂和添加剂清单

最终浓度

特尔克

13.5µ米

苯甲脒

100µ米

胃蛋白酶抑制剂

3µ米

菲咯啉

55µ米

PMSF公司

100µ米

抑肽酶

1.5µ米

亮肽

23µ米

NP40型

0.05%

DTT公司

1毫米

15. 0.5× 待定

44.5毫米Tris

44.5 mM硼酸

1 mM EDTA pH 8.0

16. 10× DNA装载缓冲液

20%甘油

0.1 M EDTA pH 8.0

1%十二烷基硫酸钠

0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯氰醇

17. 子系统控制器20×

3 M氯化钠

0.3柠檬酸钠，pH 7.0，用盐酸调节

18. 1× 泰

40 mM Tris-HCl

20毫米醋酸纤维

1毫米乙二胺四乙酸

19. 1× PBS公司

137毫米氯化钠

2.7毫米KCl

10毫米Na2HPO4

1.8毫米KH2HPO4

20. 1× PBT公司

1× PBS公司

0.1%Triton X-100 21。3 M KOAc pH 5.2 3 M醋酸钾pH 5.2，用冰醋酸调节

22. 3 M NaOAc pH 5.2 3 M乙酸钠pH 5.2，用冰醋酸调节

23. SDS-PAGE运行缓冲区

25毫米Tris-HCl

192 mM甘氨酸

0.1%十二烷基硫酸钠

24. 蛋白质负载缓冲液

6× SDS样品缓冲液，以1的最终浓度添加到样品中×

0.35 M Tris，pH 6.8

30%甘油

1%十二烷基硫酸钠

0.0001%溴酚蓝

致谢

本研究方案改编自Ginno等人，2012年，先前发表于Alecki等人，2020年。

作者实验室的工作由加拿大卫生研究院（CIHR）资助。

相互竞争的利益相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的利益。

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