材料和试剂

细胞培养容器、板和管
1. 25 - cm 2细胞培养瓶（Corning，目录号：CLS430639）
2. 100 - mm 板（SARSTEDT，目录号：82.1472.001）
3. 6 孔细胞培养板（Corning，目录号：83.3920）
4. 24 孔细胞培养板（Corning，目录号：83.3922）
5. 15 - ml 和 50 - ml Falcon 管（BD Falcon）
6.带网格的细胞计数幻灯片
7. 1.5 - ml Eppendorf 管
8.环保丁腈手套（SuperMax ）
9.过滤器尖端，升流-保留：1000微升，200微升，20微升，10微升（爱思进，产品目录号：31000LRS，3200LRS，320LRS，310LRS ，分别地）
10. 5 - ml 血清移液管（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
11. 10 - ml 血清移液管（SARSTEDT，目录号：86.1254.001）
12. 0.22 - µm 细胞培养基过滤装置（康宁，目录号：CLS430513-12EA）

细胞
BHK-21细胞（b ABY仓鼠肾细胞小号，ATCC：CCL-10）
细胞保持在 25 - cm 2细胞培养瓶中，并带有完整的 DMEM (DMEM–高葡萄糖并辅以 10% 热灭活 FBS –配方 1 ) 在 37 °C 下，在含有 5% CO 2的加湿气氛中。达到汇合后，将细胞传代培养以保持细胞活力。对于第是，除去培养基并用冲洗3细胞毫升温PBS无钙和镁。使用 1 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液分离细胞 1 分钟。4毫升完全DMEM，转移添加到一个新的15 -毫升锥形管，并离心将细胞在300 5分钟×克。重悬细胞沉淀在新鲜的完全培养基和分裂1 ：在新的培养瓶中20。

静脉病毒
所述Icoaraci白蛉（豆24262-ICOV）瓦特作为距离Pedro博士获得洛斯（研究所伊万德罗恰加斯/ SVS / MS）。
该病毒从肝，脾，肾，心脏的分离泳鼠属鼩在贝伦，帕拉州，巴西，并随后在2日龄瑞士小鼠脑内接种。将样品冻干并储存在-80 °C 。使用前，在0.5 ml Puck's 培养基中重新配制样品。

细胞培养试剂
1. 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T4049），储存在 -20°C
2.含有 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（Lonza，目录号：12-604Q）
3. 100 ×青霉素-链霉素溶液（HyClone - GE，目录号：SV30010）
4. Puck 培养基（PAN Biotech，目录号：P04-51100）
5.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza，目录号：17-516Q）
6.胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10270106）
7. UltraPure TM DNase/RNase-free蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：10977-035）
8.甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：M7027）
9. 100 - bp DNA 阶梯，500 µg/ml（Promega，目录号：G201A）
10. 6 ×克EL样染料（Promega公司，目录号：G190A）
11.用于常规凝胶电泳的标准琼脂糖（UniScience ，目录号：AGR-LE-100）
12.溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E7637）
13. Tris-base（Promega，目录号：H5131）
14.冰醋酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
15. UltraPure TM 0.5 M EDTA（乙二胺四乙酸，二钠盐二水合物），pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：15575020）
16.结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C0775）
17.巯基乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：T0632），室温储存
18.指示按ZOL TM RNA MiniPrep试剂Plus试剂盒（ZYMO研究，目录号：R2070）
19. ImProm -II TM逆转录系统（Promega，目录号：A3800）
20.随机引物（Promega，目录号：C1181）
21. GoTaq ® DNA聚合酶（Promega公司，目录号：M3001）
22.完成 DMEM（见食谱）
23.半固体培养基（见食谱）
24.结晶紫溶液（见配方）
25. 10 × TAE 缓冲液（1 L）（见配方）
26. 1 × TAE 缓冲液（1 L）（见配方）
27. 1.5％一garose凝胶（见配方）
28. 100 - bp DNA 阶梯（50 µg/ml）（见配方）
29. 3％小号裂果巯基乙（见配方）

设备

1. P1000（吉尔森，目录号：F123602）
2. P200（吉尔森，目录号：F123601）
3. P20（吉尔森，目录号：F123600）
4. P2（吉尔森，目录号：F144801）
5. 4°C 实验室冰箱（伊莱克斯，型号：IF55）
6.实验室冷冻室设置在-20°C（Prosdocimo ，型号：F21）
7.实验室冷冻室设置在-80°C（松下，型号：MDF-U56VC-PA）
8. 37°C 培养箱，含5% CO 2 （Sanyo inCU -Safe ，型号：MCO-17AC）
9.层流罩（Esco Class II BSC-AirStream ）
10. 5418（Eppendorf）室温离心；此处设置为 24°C
11.离心机（ThermoFisher Scientific，型号：D-37520）
12. NanoDrop TM ND-1000 分光光度计（ThermoFisher Scientific）
13.天平（BEL分析设备，型号：S622）
14. Veriti 96孔吨有源冰箱Ç ycler仪（Applied Biosystems PCR仪器，型号：9902）
15.迷你凝胶迁移系统（Loccus Biotecnology ，型号：LCH-7X8）
16.电泳p奥尔š upply（GIBCO BRL，Life Technologies公司，250）和电力电缆
17.紫外透照仪（Fisher Scientific，型号：88A）

程序

图1示出了用于步骤病毒生产，孔定量吨通货膨胀和感染。一的程序的详细说明以下项目中找到。

图1不同的步骤的生产，孔定量吨通货膨胀，和感染Icoaraci白蛉。在 Mind the Graph 平台中创建的图。

Icoaraci 静脉病毒的生产
板4×10 6 BHK-21在100细胞中-毫米板（7毫升/板）。为了获得良好的病毒浓度，SE编大约30块板。在这一步中，使用不超过五次传代的 BHK 细胞。
恰好 24 小时后，用 2 ml 温热的 PBS 清洗细胞一次，然后进行病毒吸收（下一步）。
d ilute在1米病毒升不含FBS的DMEM [感染复数（MOI）0.01]和吸收接种物在室温下2小时。接种量不足以覆盖整个板表面，因此请每 20 分钟小心移动一次板，让接种物穿过板。
去除接种物，加入 7 ml L DMEM（补充有 10% FBS）（配方 1），并在 37°C下孵育3 天。
收集上清液并在 4°C 下以18,000 × g离心1 小时以浓缩病毒。
弃去上清液，用 300 µl PBS 重悬沉淀。分割卷之间3个冷冻管并储存于-80℃直至滴定。

孔定量牛逼的通货膨胀的Icoaraci白蛉
病毒滴度使用噬斑测定法测定。为此，在6孔板中加入 1.5 × 10 6 BHK-21 细胞/孔。细胞应最多使用到第3 代。
24小时后，感染细胞（〜80％confluenc ë ）用200μ升，在室温下2小时10倍ICOV股票的系列稀释，如前一节中所描述的，并孵育。同样，接种量不足以覆盖孔表面，因此请每 20 分钟小心移动一次板，让接种物穿过板。
使用移液器完全去除接种物，并用 2 ml 由完全 DMEM 加 1% 甲基纤维素组成的半固体培养基覆盖单层（配方 2）。在这一步中，确保完全去除接种物非常重要，以便半固体培养基均匀分布在整个细胞单层中。
三天感染后，修复和染色用2M细胞升含有10％甲醛的0.1％结晶紫溶液（配方3）下轻微搅拌12 ħ在室温下。
洗涤所述孔微妙用流水，除去固定剂/染料和允许所述板以干燥在室温下颠倒24小时。病毒噬斑可以在白色进行计数-光透射仪，和效价表示为空斑形成单位小号（PFU）/米升（图2）。
图2.孔定量吨的通货膨胀Icoaraci白蛉。从48小时感染后，收集上清液，稀释至三种不同浓度（10 - 2 ，10 - 3 ，和10 - 4 ），并且如上所述在一个BHK-21单层滴定。3天后，将细胞固定并用结晶紫染色。

腹腔巨噬细胞的获得和培养
根据国家动物实验控制委员会制定的规则，小鼠菌落维持在UFRJ免疫学系。本项目中使用的动物实验方案经动物使用伦理委员会批准（方案编号 046/20）。
从8凌晨腹膜巨噬细胞ķ -old C57黑6（C57BL / 6）小鼠中引发与2米升3％氢氧化钠巯基乙（腹膜内注射，配方8）4天，并且被细胞获得后安乐死通过注入8米升在DMEM到腹膜腔。将小鼠头部向下倾斜45 °角，将肠道置于头侧，远离给药区域。然后将针以 30 – 45 °角插入腹部右下象限，用于接种巯基乙酸盐或获得巨噬细胞。
将细胞在4°C 下以 400 × g离心10 分钟。
将细胞重悬在 1 ml DMEM 中，并在显微镜下使用血细胞计数器计数（在 Neubauer 室中用 DMEM 稀释10倍）。
将巨噬细胞铺在 24 孔板（每孔2 × 10 5 个细胞）或 6 孔板（每孔4 × 10 6 个细胞）的玻璃盖玻片上。
后一个1 -在37℃。1 H附着，洗涤细胞，用PBS，并添加完全DMEM。巨噬细胞在 37°C、5% CO 2气氛中保持 1 天，然后进行感染。

感染
对于腹腔巨噬细胞 ICOV 感染，在 37°C 下使用 MOI 为 1 进行吸附 1 小时。
稀病毒在不含FBS的DMEM，并使用100μ升用于24孔板和1m升6孔板中。
用移液管取出接种物，加入 1 ml（24 孔板）或 2 ml（6 孔板）完全 DMEM。
随后的处理时间，条件，或用于该实验模型，提出可能会发生变化的其他额外的感染。例如，在利什曼原虫感染，我们允许寄生虫到用于病毒吸附后4小时进行交互，然后裂解细胞用于通过qPCR分析基因表达。

病毒检测半定量 PCR 分析小鼠巨噬细胞感染
为了检测和确认腹腔巨噬细胞中的病毒感染和复制，必须进行半定量 PCR。
后4,24 ，感染，分离物或48小时，并使用指示按纯化的总RNA ZOL TM RNA MiniPrep试剂Plus试剂盒符合荷兰国际集团到制造商的说明。
孔定量泰特使用的RNA纳米滴。预期浓度应为 100 - 200 ng/µl，260/280 比率应为1.8 - 2.0 ，确保良好的 RNA 质量。
第一链 cDNA 合成是在包含Improm -II 逆转录酶、dNTP 混合物和随机引物的反应中进行的，如制造商的说明中所述。
使用 ICOV N 蛋白基因的 10 µM 引物（有义 5'-AGGTGAGGCTGTAAATCTTG -3' 和反义 5'-TCACATCATCCTTCCAAGTG-3'）、2.5 U GoTaq DNA 聚合酶、1.5 mM MgCl 2 、NTPs 进行 RT-PCR 、2 µl cDNA和 1 ×合适的缓冲液，终体积为 50 µl。在PCR循环是如下：95℃1分钟，48℃1分钟，和72℃下，在40个扩增循环1分钟。
PCR 产物在 1.2% 琼脂糖凝胶上分离，该凝胶含有0.5 µg/ml 溴化乙锭和 1 × TAE 缓冲液（配方 5），电压为 80 - 100 V，并在紫外透射仪中拍照。该产品有 100 bp (图 3)。
图 3.来自野生型 C57BL/6 小鼠的腹膜巨噬细胞以 5 个寄生虫/细胞、Icoaraci Phlebovirus (ICOV)的比例感染了L. (L.) amazonensis 的静止期前鞭毛体，或同时感染了两者4个小时，24小时，或48小时。提取总 RNA 并通过半定量 PCR 分析Icoaraci N 蛋白。

食谱

完整的 DMEM
制作 500 ml 完整 DMEM：
445 毫升 1 × DMEM
50 毫升 10% FBS（热灭活）
5 ml 1 ×青霉素-链霉素 (100 × )
半固体培养基
完整的 DMEM 加 1% 甲基纤维素
添加1克甲基纤维素至100μm升蒸馏水中的耐高压加热的烧瓶中。
在高压灭菌之前，添加搅拌棒以混合溶液并保持无菌。为了完全溶解，将溶液在 4 ℃下过夜°C，然后将烧瓶留在磁力搅拌器中。
注意：如果形成块状溶液，冷却溶液的温度并再次混合。应重复该过程直至溶液均匀。
将冷甲基纤维素添加到冷的完整 DMEM (v/v) 中并彻底混合以确保均匀的混合物。使用前，请等待气泡消散，温度升至室温。
结晶紫溶液
0.1% 结晶紫的 PBS 溶液
10% 甲醛
10 × TAE 缓冲液 (1 L)
称取 48.5 g Tris-base、11.4 ml 冰醋酸和 20 ml 0.5 M EDTA pH 8.0
添加蒸馏水水达到1升
在室温下储存
1 × TAE 缓冲液 (1 L)
将 100 毫升 10 × TAE（配方 5）添加到900 毫升蒸馏水中
在室温下储存
1.5% 琼脂糖凝胶
在高压灭菌的玻璃瓶中称量琼脂糖粉 (1.5 g)
添加 100 毫升 1 × TAE
热在微波直到所述琼脂糖均匀地溶解
在室温下冷却几分钟
100 - bp DNA Ladder (50 µg/ml)
为240微升DNA梯子在1.5 -在冰上毫升管中，加入176微升超纯TM DNA酶/ RNA酶的蒸馏水
加入 40 µl 6 ×凝胶上样染料和 24 µl 100 - bp DNA 阶梯，浓度为 500 µg/ml
4°C 保存
3%巯基乙酸钠
在高压灭菌的玻璃瓶中称量巯基乙酸钠粉末 (3.0 g)
加水高达100米升
过滤与所述溶液一0.22 -微米的细胞培养基过滤单元
在室温下储存

致谢

我们感谢佩德罗费尔南多·达科斯塔Vasconcellos教授为提供白蛉ES ，这对开展这项工作的基础。我们感谢 Clarissa Damaso教授对病毒学方法的支持。我们也感谢分子寄生虫学实验室的所有成员进行有益的讨论。这项研究是由支持的国家委员会科学和技术发展（的CNPq ）和Fundação卡洛斯·查加斯·菲略德安帕罗à Pesquisa做埃斯塔做里约热内卢（FAPERJ）。

竞争利益

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有的动物实验均按照全国委员会的动物实验控制和使用的动物伦理委员会批准的方案进行（协议ñ Ö 。046/20 - ID：01200.001568 / 2013-87有效期：2022年8月30日）。

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