材料和试剂

1.带灯丝的硼硅酸盐移液管玻璃（Warner Instruments，目录号：64-0793）
2.注射器，5毫升（VWR，目录号：BD309646）
3.注射器过滤器，0.2 µm（VWR，目录号：10218-486）
4. 23G针（VWR，目录号：89134-098）
5. Tergazyme （Alconox ，目录号：1304-1）

设备

电子列出quipment是除了标准膜片-钳电设备（例如，放大器，数字转换器，探头，显微操纵，显微镜，以及移液管牵拉）。贴剂的具体细节-在本文中使用的夹具钻机在别处详细描述（Kolb的等人，20 16和20 19 ）。
清洁盘（根据 SI 中的 CAD 文件进行 3D 打印或铣削，并适当更改显微镜载物台）
压力控制箱（d上autopatcher.org etailed计划，零件清单，从直接命令Neuromatic设备，neuromaticdevices.com）

软件

根据所需的自动化水平，下载 (1) 和 (2) 以实现完全自动化，或仅下载 (2) 以启用“一键清洁”以进行手动贴片钳和清洁。
Autopatcher软件（可从 autopatcher.org 下载）。钍是软件使细胞检测，全自动化gigasealing和磨合功能。
Push-to-clean 软件（可在Github下载，https://github.com/mightenyip/Pipette-Cleaning-Software）。的术语“推到干净”被定义为以其他方式手动钻机电生理学，包括一个按钮-致动移液管清洁功能。该按钮启动一系列移液器位置和压力变化，以清洁移液器以供重复使用。

程序

之前的第一个实验
制造根据计划和显微镜载物台的尺寸（清洁盘图URE 1C，CAD文件中的补充信息附录B的内部），使用按需生产服务（例如，Protolabs从，protolabs.com），或购买一个商业供应商（例如，神经设备）。

在现有的补丁安装压力控制箱-钳电钻机
该p ressure控制箱可以从头开始按照由提出的计划来构建Kodandaramaiah等。( 20 16 ) 。原理图、说明和零件清单也可从autopatcher.org下载。
可直接从Neuromatic Devices ( neuromaticdevices.com )购买与清洁兼容的压力控制盒。

从 autopatcher.org 下载并安装软件。执行初始软件设置。补充信息附录 A中提供了详细说明。
寄存器的根据操纵器的制造商和COM端口（小号EE补充信息图URE小号小号1-小号2 ）。
注册该压力控制箱到指定的COM端口（小号EE补充信息图URE小号小号1-小号2 ）。

每次实验前
准备生物样品小号的补丁-钳记录。我们或其他已发表的报告中已对移液器清洁进行了验证的实验准备方法作为参考。
对于体外HEK 293 细胞，请遵循 Kolb等人。( 20 16 ) 。移液器清洗适用于野生型细胞、稳定转染细胞系和瞬时转染（Kolb等人，20 16 和20 19 ）
对于啮齿动物神经元培养记录，请遵循Kaech和 Banker ( 2006 )以及Kolb等人。( 20 16 ) 。Kolb等人验证了此准备工作的清洁。（2016 年和 2019 年）。
对于急性脑组织切片记录，请遵循姜等人。( 20 15 ) 。Kolb等人的以下报告证实了此准备工作的清洁。（2016 年和 2019 年）。
对于麻醉制剂中的体内小鼠记录，请遵循Bagal等人的方法。（2013 年）。Kolb等人验证了此准备工作的清洁。（2016 年和2019 年）和Stoy等人。(2020) 。
对于急性人脑组织切片，请遵循 Ting等人的方法。( 20 18 )和彭等人。（2019 年）。Peng等人验证了此制剂的清洁。(2019) 。
对于人类大脑类器官，请遵循Mariani等人。( 2015 )和钱等人。( 20 16 ) 。我们已经在未发表的实验中验证了该制剂中的清洁。

准备电钻机的补丁-钳实验，并在适当的实验用吸管。补丁详细指南-钳钻机设置，去噪，和故障诊断中别处提供（PERIN和马克拉姆，2013;王等人，2015; Kodandaramaiah等人，2016）。

加载软件的一推清洁的补丁-钳实验（补充资料附录C）。

配制2% w/v Tergazyme清洁液。
在室温去离子水中制备 2% w/v Tergazyme溶液。
混合溶液直至所有Tergazyme粉末溶解。
注意：因为Tergazyme是一种酶洗涤剂，酶成分会随着时间的推移而降解。制造商建议制作新鲜溶液并在 8 小时内使用它们以获得最大功效。

填写清洗和冲洗沐浴水库小号与过滤解决方案
使用带有 0.2 µm 过滤器和 23G 针头的注射器，用新鲜制作的 2% w/v Tergazyme （或用于冲洗的细胞外溶液）填充适当的浴槽。
注意不要到溢出清洗槽贮存器，因为这可能会导致Tergazyme溶液流入实验室中，潜在地损坏的细胞。
注意：为确保有清洗槽和实验浴之间没有流体交换，插入吸移管到清洁槽的前端和监测方波脉冲的电压钳位。如果不接地清洗槽接地实验洗澡间没有电接触，你会看到电容瞬态，类似于当吸管尖是在空气中。如果有电接触，您将看到一个方波脉冲，类似于当尖端浸入实验浴中时。要解决此问题，使用任务擦拭以去除一个，直到电接触被消除从清洗槽的液量小。

在软件界面中，参考细胞和清洁浴校准操纵器（图 6）。
选择并保存目标单元上方的“exp Bath location”位置。
选择并保存“浴槽上方的位置”位置，直接位于清洁浴槽的上方。
选择并保存“清洗槽位置”位置，吸头安全地浸入清洗液中。
如果需要，选择并保存“洗涤浴”位置，将尖端安全地浸入冲洗溶液（即细胞外溶液）中。
图 6. 用于移液器清洁的移液器校准。push-to-clean 软件用于每次清洁尝试的位置。(A) 中的图像是指 (B) 中保存的位置值。简而言之，(1) 是指直接位于目标细胞或组织上方的位置，(2) 是指清洁和冲洗槽上方的 z 位置，(3) 是指尖端浸没在清洁溶液中的位置，以及 (4) ) 指的是移液器吸头浸没在冲洗液中的位置。

补丁-钳实验
尝试补丁-对靶细胞钳

启动使用吸管清洗的通过点击“清除”按钮软件界面。软件实现的功能如下：
在轻微正压 (+50 mbar) 下，移液器从细胞缩回至“浴槽上方位置”位置。
移液器从“浴槽上方位置”位置移动到“清洗槽位置”位置，直到移液器吸头与清洗液接触。
注意：将移液器接触到清洁溶液的表面可以检测到移液器尖端方波脉冲电容的变化。这通常可以在移液器明显接触表面之前观察到。移液器与流体接触的可见确认也足以开始清洁。
将移液器吸头置于清洁槽中，吸力 (-345 mbar) 5 秒。
施加五轮交替抽吸脉冲（-345 毫巴，持续 1 秒）和正压（+700 毫巴，持续 1 秒）。
P ositive压力施加（700毫巴）5秒吨ö排液任何残留的清洁从移液管尖端的解决方案。
移液器从清洗槽缩回到“槽上方位置”位置，然后到“exp 槽位置”位置或“洗涤槽”位置（可选）。

冲洗移液器（可选）
在正压 (+ 200 mbar) 下，移液器从“清洗槽位置”位置移动到“槽上方位置”位置。
移液器从“浴槽上方的位置”位置朝“洗涤浴槽”位置向下移动，直到移液器吸头与清洁溶液接触。
在冲洗浴中使用移液器尖端，施加 3 秒的吸力（-345 毫巴），然后施加 10 秒的正压（+700 毫巴）。
在正压 (+200 毫巴) 下，将移液器从“洗涤浴”位置缩回到“浴槽上方位置”位置。

尝试补丁-钳记录上的下一个目标细胞

重复步骤甲- d直到所述的端部的的实验或失败的移液管（例如，尖端破损，堵塞，清洗溶液，或用户错误的蒸发）。
注意：如果该移液管似乎被堵塞（即，在移液管尖端或在电阻的增加观察到可见的内部堵塞）或破裂（即，可见破碎尖端或降低电阻），然后替换它并重复校准。

数据分析

从补丁数据-用吸管清洁钳实验可以以同样的方式作为传统的补丁来处理-使用软件工具，如钳实验pClamp （Molecular Devices公司）或Matlab的（Mathworks公司）。一个有用的分析来表征吸移管清洗的效力是一个产量的曲线，与该尝试的在x轴数和千兆欧密封或全-在y轴的细胞产量（图2A，图3A，图4A，以及图5B)。通过将产量曲线与理想产量进行比较，其中 100% 的细胞试图修补导致整体-细胞膜片-钳配置，可以诊断清洁产量、堵塞、断裂或其他故障模式的问题（图 4A） . 可以使用 Kolmogorov-Smirnov 检验从收益率曲线数据中比较方法和实验。此外，重要的是要验证清洁不会导致修补产量下降。成功率曲线，显示获得的整体概率-细胞在限定清洁尝试次数也是有用的（图1B-C，图5A）。可以使用线性回归（例如，MATLAB 中的mnrfit函数）对来自这些图的数据进行建模。优势比、95% 置信区间和p 值测试与初始性能的偏差。

笔记

如何将移液器清洁用于多移液器实验？彭等人。（2019）最近表明，在啮齿类和人脑切片的多移液管连通的研究可通过使用吸移管清洗，以既增加产量和延长每组织测试连接的数量大大加快[见˚F igures 3和5彭等人. ( 20 19 ) ] 。这些系统依赖于常规实现同步全-与所有可用的移液器细胞记录有效测试间的神经连接，但获取的同时整体-在所有可用的移液器细胞记录是困难的，依赖于实验者技能（NB的，由研究PERIN和马克拉姆（20 13）发现，具有12移液管钻机，新手用户实现平均4.8± 1.7的12条可能整个-每尝试细胞记录，而专家实现9.6± 1.4的12个可能整个-每尝试细胞记录） . 实施单轮移液管清洗用2％w / v的的Alconox和没有漂洗导致显著改进的成功率（即，所述的实际同时的整体的可能数目的比率-细胞记录）相对于没有清洁两个8-和 10 机械手膜片钳记录设置，分别从 85 ± 13%到 97 ± 5%和 79 ± 11%到 92 ± 6% ( Peng et al. , 20 19 ) 。进一步更，一旦第一轮同时整体的-获得细胞记录，将吸移管清洗允许额外周围神经元进行修补，从而增加可在单个样品中的140±被测试的连接的总数目为24％至244± 52 %使用 8 移液器装置（Peng等人，20 19 ）。我们荷兰国际集团该方法能实现更快，对于理解神经元连接所需的大数据集的更有效的收集（Goriounova等人，20 18; Gouwens 。等人，20 19 ）。
移液器清洁如何用于高通量筛选？发现和表征候选药物的大规模努力也在进行中（Dunlop等人，20 08；Bagal等人，20 13 ），为神经科学设计改进的遗传工具（Piatkevich等人，20 18；Yang等人，20 18 年）。, 20 19 ) ，并了解离子通道蛋白中的人类突变（Swanger等人，20 16；Ogden等人，20 17 ）。然而，许多这些项目是由传统的贴片的吞吐量低限于-钳实验（公园。等人，20 13 ;卓等人。，20 19 ）。对于大多数的筛选实验中，不清洗手动膜片钳具有吞吐量8 - 10全-每实验者细胞记录每天（米利等人，20 09 ）。使用我们的自动膜片钳系统用2％w / v的Tergazyme ，我们已经证明的10个整个例行吞吐量-每吸管细胞记录每小时和高达100个整体的每日吞吐量-细胞记录（图URE 5）（Kolb的等。, 20 19 ) 。为了进一步展示移液器清洁在功能筛选中的效用，我们使用瞬时转染了通道视紫红质-2 (ChR-2) 的 HEK 293 细胞进行了试点实验。在该实验中，46个整体-从51次获得的贴片细胞记录-钳尝试与使用2％w / v的清洗单个移液管Tergazyme （图URE 3）。
使用这种方法的预期收益是多少？我们的补丁的产量和录音质量-钳记录媲美手动移液器更换。对于HEK 293细胞的实验，全-细胞记录收率为70一致地-使用90％patcherBot 。在全自动Tergazyme清洗系统中执行高产量、高通量实验的能力也使我们能够迭代改进我们在 HEK 293 细胞中的自动化方法。例如，我们在随机实验中比较了 2% w/v Tergazyme溶液与 2% w/v Alconox和盐水，其中操作员对清洁溶液的身份不知情（图 2）。以下该实验中，我们随机改变移液管压痕的深度到细胞膜，发现增加整个的最佳范围-细胞记录收率〜90％（图2）。
清洗过的移液器可以使用多久？我们还发现，使用patcherBot （图 5）（Kolb等人，20 19 ），Tergazyme清洁对重复使用 100 次以上的单个移液器是有效的。由于补丁典型的吞吐量-钳电生理学实验是在10个范围-每天30录音，很可能只吸液管需要更换每天一次，除非在移液管破损或堵塞的情况。
清洗方法如何失效？使用我们的改进的2％w / v的清洗单个移液管Tergazyme清洁溶液，我们实现了102个全-在122次补丁细胞记录-钳尝试在13小时自动化实验。在我们试图找到 2% w/v Tergazyme清洁的故障点时，移液器破损或内部堵塞比无法清洁移液器更有可能导致故障。内部移液器堵塞被认为是由移液器溶液中颗粒的环境灰尘形成的。木屐趋于形成作为的函数的施加和更可能发生在长的实验正压的持续时间。可以从收益率曲线的平坦部分诊断堵塞，这不太可能是偶然的。一些木屐是可逆的（参见图 4 中的代表性迹线）。移液器在吸头破损后也可能出现故障，这通常发生在靶细胞丢失的情况下。要确定清洗的近似故障点，考虑每个补丁-钳尝试为具有概率的独立事件等于千兆欧密封记录失败率，并确定清洁尝试直到数量的概率小于或等于0.01。例如，对于一千兆欧密封的30％（失败率即，千兆欧密封成功率= 70％），的序列的似然4点的故障，以千兆欧密封具有<1％的概率。
清洁是否会将残留的酶或清洁剂转移到细胞中？补丁的一个担忧-兴趣实施清洁钳实验者是从清洗后的吸管残留的清洗液污染的可能性。我们最初的研究通过两种类型的实验解决了这个问题（Kolb等人，20 16 ）。首先，我们对新鲜的移液器和用 2% w/v Alconox清洁的移液器进行了电喷雾电离质谱 (ESI-MS) ，发现没有检测到Alconox残留物。对于本实验，我们使用了 2% w/v Alconox ，检测限为 147 ng/ ml 。其次，我们进行补丁-对HEK钳实验293个细胞中表达γ氨基丁酸A型受体（GABA甲R），这是已知的洗涤剂的细胞外应用敏感。在这些实验中，我们没有发现清洁的和新鲜的移液器之间GABA A R 电生理学有任何统计学上的显着差异。
是否需要冲洗步骤（程序步骤 C.冲洗移液器）？有趣的是，彭等人最近的实验。（2019）（使用人脑切片）和由我们的实验室（使用小鼠脑切片，图5）提供了证据，该漂洗步骤（操作步骤，步骤C.冲洗移液管（可选））是不必要的。因此，在此方法描述中，我们将其标记为“可选” 。” 但是，如果在特定实验中仍然存在污染的可能性，我们建议按照程序步骤 C 中所述进行冲洗。根据需要使用以下修改冲洗移液器（可选）以最大程度地降低风险：
在冲洗步骤中增加时间和周期，以通过稀释去除残留的Tergazyme 。
降低清洗液中Tergazyme的浓度。2% w/v Tergazyme溶液可有效清洁移液器多达 100 次，而产量没有可测量的降低（图 4）。这表明较低浓度的Tergazyme仍然对移液器清洁有效，但可能会在每个移液器的最大清洁次数方面进行权衡。
增加的灌注率的外部溶液，使任何残留的Tergazyme从试验室中迅速地除去。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院 (NIH) 赠款 R01NS102727、R01DA029639、U01MH106027 和 R01 EY023173 的支持。我们也承认该协议源自的原始研究论文，Kolb等人。（20 16 和20 19 ）。

利益争夺

MCY 和 IK 与制造移液管压力控制系统的Neuromatic Devices签订了咨询协议。IK，当时，和CRF是在美国专利10830758发明涉及移液管清洗技术和授权给Sensapex 。

伦理

对于使用急性啮齿动物脑切片进行清洁的代表性工作，所有动物程序均符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南，并获得乔治亚研究所动物护理和使用机构委员会的批准。技术（A100359，Exp：2022 年 12 月）。当使用清洁方法小号的要求伦理委员会批准的实验，请遵循的适当的法律和制度的指导。

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