材料和试剂

1. Eppendorf 管（Denville Scientific，目录号：C2170；储存在 RT）
2.不透明管（Argos Technologies，目录号：T7456-001；储存在 RT）
3. PCR管中（Corning热电偶套管金PCR 0 2米升，1 × 8条，目录号：3741；在RT存储）

4.感兴趣的蛋白质
5. Tris Base（Fisher Bioreagents ，目录号： BP152-1；储存在RT）
6. MES（2-（N-吗啉代）乙esulphonic苯磺酸一水合物）（阿尔法Aesar公司，目录号：A16104-22;储存于RT）
7. MOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）（Sigma Aldrich，目录号：M3183-500g；储存于室温）
8. HCl（盐酸）（Fisher Chemical，目录号：A144-500；在室温下储存）
9.乙酸（Fisher Chemical，目录号：A38-212；在室温下储存）
10. NaCl（Fisher Scientific，目录号：S271-500；储存于室温）
11. MgCl 2 ·6H 2 O （Fisher Scientific，目录号：M33-500；储存于室温）
12.葡萄糖（Sigma Aldrich，目录号：G8270-1kg；储存于室温）
13. SDS（Fisher BioReagents ，目录号：BP8200500；储存于室温）
14. EDTA（乙二胺四乙酸）（Sigma Aldrich，目录号：EDS-500g ；储存于室温）
15. DTT（二硫苏糖醇）（Gold Biotechnology，目录号：DTT50；储存在-20 °C）
16. β-巯基乙醇（Arcos Organics，目录号：AC125472500；储存于室温）
17. NuPAGE 3-8%Tris 醋酸蛋白凝胶，1-0毫米，12 孔（Thermo Fisher Scientific，目录号：EA03752BOX；4 °C储存）
18. Alexa-647 标记的 TFO寡核苷酸（Invitrogen；在 -20 °C 下储存在不透明管中，避免重复解冻-冷冻循环，TTTCTTTCTTCTTTCTTTTCTT ）
19.单-与TFO结合位点（TBS）链DNA底物（Invitrogen公司;存储在-80 ℃下，顶和底链）
20.短的单-链DNA寡核苷酸（Invitrogen公司;储存在-20 ℃）
21. ATP（Roche Applied Science，目录号：10519987001；储存在-80 °C）
22.运行缓冲液（见配方）
23. GSM 缓冲液（见食谱）
24.反应缓冲液（见配方）
25.透析缓冲液（见配方）
26.三重形成缓冲液（见配方）
27.退火缓冲液（见配方）
28. 1 × TE 缓冲液（见配方）

设备

电源（伯乐，型号：的PowerPac HC 1645052）
Novex Bolt 迷你凝胶罐（Invitrogen，型号：A25977）
加热块（American Scientific Products，型号：H2025-1）
PCR仪（Eppendorf，型号：Mastercycler EP Gradient Model 5341）
ChemiDoc MP（BioRad ，型号：12003154）

软件

Image Lab ( BioRad , https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z )或类似的软件，如 ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij / )
Microsoft Excel（微软，https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel）
GraphPad Prism 7（GraphPad ，https : //www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

DNA三链体的制备和蛋白质透析（2 - 1 d实验前）
生成 dsDNA（实验前2天）
根据 DNA 片段的长度，订购寡核苷酸或通过限制酶消化或 PCR 扩增生成片段。
用于双链体的形成的寡核苷酸退火，与退火缓冲液混合的顶部和底部链寡核苷酸一个1 μM每种寡核苷酸的最终浓度。在 90°C的加热块中孵育10 分钟，然后关闭加热块使其缓慢冷却至室温。
三链 DNA形成（实验前 1 天）
将 Alexa-647 标记的寡核苷酸在1 × TE 中重悬至 100 μM，并在不透明管中分装。在三重形成前立即用三重形成缓冲液稀释至 1 μM 。
在 dsDNA 与 TFO 的摩尔比为 1.2:1 的不透明管中准备 DNA 三重反应。准备相同体积的免费 TFO 混合物。
在 57°C下孵育 15分钟，然后将加热块中的管转移到冷藏室或冰箱中，冷却至 4°C o/n 。DNA 三链体和游离寡核苷酸可以分装并储存在 -20 °C，但避免重复解冻-冷冻循环。
蛋白质透析（实验前1天）
透析蛋白质至少 4 小时或最好是过夜。如果感兴趣的蛋白质对盐浓度敏感，则可以在透析过程中进行调整，并在开始分析前立即将其稀释至 100 mM NaCl，以避免沉淀或过度聚集。在下面的例子凝胶，的活动过度的突变体MFD （MFD使用D7AAA）。Mfd是一种大肠杆菌转录修复偶联因子 (TRCF)，对于修复转录的 DNA 链上的 DNA 损伤至关重要。的沿易位能力的DNA为c ommon所有TRCFs -并且因此至MFD （Adebali等人，2017;和Deaconescu Suhanovsky 2017）。

DNA 易位分析（实验当天）
准备的反应混合物（实验天）
解冻试剂（DNA三链体，游离TFO，单-链DNA，DTT，和ATP）和制备反应缓冲液。
测量透析蛋白的浓度并准备与 10 nM 的DNA 三链体（或游离 TFO）和 50 nM 的单链 DNA 寡核苷酸的反应（图 2）；千万不能在这个步骤中添加ATP。蛋白质浓度可根据需要进行调整。添加透析缓冲液而不是蛋白质溶液来控制样品以确保一致的盐浓度。

图2 。吹打方案对所述DNA TFO位移测定。该反应是在没有 ATP/H 2 O 的情况下制备的。当混合物预孵育时，为每个时间点准备具有 GSM 缓冲液和对照（DNA Triplex 和 TFO）的管。ATP / H 2 O的添加引发反应，并且样品在被取出的指示的时间点，并用GSM缓冲停止。

DNA 易位分析（实验当天）
用 4 μl GSM 缓冲液为每个时间点准备一个管。包括一个 DNA 三链体和一个免费的 TFO 控制。
预运行 3 - 8% Tris -Acetate 凝胶和冰袋，在 75 V 的冷藏室中运行 90 分钟。
将管转移到 PCR 机器上并设置为首选温度。预孵育 5 分钟后，向反应中加入 5 mM ATP（或 H 2 O）。
在每个时间点取 16 μl反应液，并在准备好的管中与 GSM 缓冲液混合。在最后一个时间点，将 4 μl GSM 缓冲液添加到 DNA 三链控制中。
负载15微升上的预运行凝胶每个反应的（加载样品时，因为它们要小心Ñ OT ，并在75 V.制作确保运行额外150分钟的光照射包含染料）保持在最小值（涡卷铝箔凝胶罐或在暗室中运行凝胶）。运行时间可以调整，但保持运行缓冲液凉爽对于避免因过热而熔化三重体至关重要。对于非常不同的模板尺寸小号，调整的百分比的的凝胶丙烯酰胺。
将凝胶盒转移到装满水的托盘中，以防止在从凝胶盒中取出凝胶时撕裂凝胶。使用您选择的荧光团的设置对它们进行成像，在本例中为Alexa-647（BioRad ChemiDoc MP、Alexa647、10 秒曝光）。如果要对多个凝胶进行成像，请保持曝光时间恒定，而不是依赖于自动曝光（图 3B和 3C ）。

数据分析

DNA 三链体的定量
在 Image Lab 中打开图像文件并使用分析工具箱中的车道和波段工具分配车道 [参见图 3A 中的标签 (1) 和 (2)]。在“车道剖面”下手动选择波段并调整峰值边界 [参见图 3A 中的标签 (3)]。将数据复制到 Excel 文件。
可以使用大量软件测量条带强度；ImageJ是一种常用且免费提供的软件。
移除除一个条带之外的所有条带并扩展边界，使其覆盖整个车道。这测量加载的 DNA 总量并作为加载控制。将数据复制到同一个 Excel 文件中。
计算的三重的剩余百分比的每个在时间点的相对至t = 0和归一化与所述样对照。或者，可以直接量化游离 TFO 的积累。
分析完所有凝胶后，将数据复制到 GraphPad Prism 并绘制与剩余三重体相对应的信号。时间（图 3D）。

图3 。DNA 三链体的定量。(A) ImageLab软件，其中突出显示了车道选择（1 和 2）和车道轮廓（3）。（B）RAW图像扫描之后被用来量化该DNA三链体。（C）将凝胶增强通过增加对比度更好visuali ž免费TFO的通货膨胀。(D) 绘制了 TFO 三重的归一化百分比与. 使用Graphpad Prism 7 的时间。

笔记

添加单链 DNA 寡核苷酸作为DNAse陷阱；Mfd对 ssDNA 的亲和力比对dsDNA低得多。
TFO 结合位点的位置可以变化，这取决于要测试的蛋白质。
时间点可以根据要测试的蛋白质而变化。
蛋白质浓度可调；100 - 500 nM是一个很好的起点。高蛋白质浓度可能是一个限制因素，因为多个分子可能会加载到DNA 上并抑制易位。
该分析方法可在各种温度下进行，但如果温度上升，三链解离可以随着时间的推移，创建背景的显著量和可能抑制荷兰国际集团的蛋白质，如果这对单链DNA具有高亲和性。
凝胶在带冰袋的低温室中以低电压运行，以防止过热，这可能导致三重解离。
由于未使用加载染料，因此必须小心加载样品。没有加载染料和低电压使得很难看到凝胶是否正常运行。上样染料被省略，因为它们会根据所使用的染料发出强烈的荧光信号，并且会阻碍DNA 条带的可视化。例如，联合Ø马西-基于染料强烈的荧光465纳米或595纳米时，与蛋白质结合。由于停止缓冲液中存在葡萄糖，因此样品会沉入凝胶袋中。
总体而言，该测定具有很高的可重复性且易于执行。

食谱

运行缓冲液
40 mM Tris-醋酸盐，pH 5.5 5 mM NaAc 1 mM MgCl 2
GSM 缓冲液
15% (w/v) 葡萄糖
3% (w/v) SDS
250 mM MOPS
反应缓冲液
50 mM Tris-HCl ，pH 8 10 mM MgCl 2 1 mM DTT
透析缓冲液
10 mM Tris-HCl ，pH 8 100 mM NaCl 10 mM MgCl 2 2 mM BMe

三重形成缓冲液
10 mM MES ，pH 5.5 12.5 mM MgCl 2
退火缓冲液
10 mM Tris-HCl ，pH 8 50 mM NaCl 1mM EDTA ，pH 8
1 × TE 缓冲液
10 mM Tris-HCl ，pH 8 1 mM EDTA ，pH 8

致谢

Deaconescu实验室的工作得到了美国国立卫生研究院GM121975归因于 AD的赠款的支持。此处描述的协议源自布鲁格等人的工作。(2020) 。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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