材料和试剂

1. 10毫克/毫升SpCas9纯化（在内部从BL21 CodonPlus（DE3）-RIL细胞[安捷伦230245]，但可也可从集成DNA技术购买）（Alt键-R ® ，目录号：1081058，贮存温度： -80°C)
2. tracrRNA（集成DNA技术）（Alt键-R ® ，目录号：1072533，贮存温度：-80℃）
3.来自 vfCRISPR 的P hotocaged crRNA (cgRNA)，靶向PPP1R2 （BioSynthesis，序列：GAC UU CC U CUAUGGUGGCGUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG；U对应于用 NPOM-dT photocaged 核苷酸替代尿嘧啶，储存温度：-80°C）
4. HEK293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216，储存温度：液氮蒸气）
5.无核酸酶双链体缓冲液（Integrated DNA Technologies，目录号：11-01-03-01，储存温度：4°C）
6. PPP1R2 Fwd PCR 引物（Integrated DNA Technologies，储存温度：-20°C，序列：5' - GTTTCCGAGGCAGCAGTTG - 3'）
7. PPP1R2 Rev PCR 引物（Integrated DNA Technologies，储存温度：-20°C，序列：5' - GCATGATAAACGTCATCGCCC - 3'）
8. DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，DNeasy，目录号：69504）
9. QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，QIAquick，目录号：28104）
10. Q5 ®高保真2X预混（新英格兰生物实验室，Q5 ® ，目录号：M0492，储存温度：-20℃）
11. NEBuffer TM 3.1（New England BioLabs，目录号：B7203S，储存温度：-20°C）
12.蛋白酶K，分子生物学级（New England BioLabs，目录号：P8107S，储存温度：-20°C）
13. E-凝胶TM用SYBR琼脂糖凝胶TM安全DNA凝胶染色，4％（赛默飞世，E-凝胶TM ，目录号：A45206，贮存温度：室温下）
14. 100 bp DNA 阶梯（New England BioLabs，目录号：N3231S）
15. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
16. KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
17.甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
18. NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
19.铝箔（雷诺包装）
20.核酸酶-游离水（未DEPC-吨reated）（Invitrogen公司TM ，目录号：AM9932 ）

设备

C1000 Touch TM热循环仪（Bio-Rad，型号：1851148 ），或任何可进行聚合酶链反应 (PCR) 的替代热循环仪
E-Gel ® iBase TM Power System（Thermo Fisher，E-Gel TM ，目录号：G6465）或替代凝胶电泳系统
JAXMAN 365 nm LED 手电筒（亚马逊、JAXMAN、https: //www.amazon.com/JAXMAN-Ultraviolet-365nm-Detector-Flashlight/dp/B06XW7S1CS/ ）
Typhoon TM FLA 9000（GE Healthcare），或任何可对溴化乙锭或 SYBR Gold 琼脂糖凝胶成像的替代凝胶成像仪

程序

在PPP1R2处生成用于体外切割或 EMSA的靶 DNA
从HEK293T细胞用净化的基因组DNA（gDNA中）的的DNeasy血液和组织试剂盒按照生产商的说明进行操作。在试剂盒提供的 200 μl AE 中洗脱。将 gDNA 储存在 -20 °C。
将 10 μ M 的 Fwd 引物与 10 μ M 的 Rev 引物混合，制备 PCR 引物混合物，两者均在水中稀释。
设置 PCR 反应。
在热循环仪上启动热循环协议。
按照制造商的说明，使用QIAquick PCR 纯化试剂盒提取 PCR 扩增的目标 DNA 。用试剂盒提供的30 μl EB洗脱。

准备 10 ml Cas9 稀释缓冲液
1.配制由 20 mM HEPES、500 mM KCl和20% 甘油组成的溶液。
2.加入足量的 1 M NaOH 使 pH 值达到 7.5。

准备 10 μ M Cas9
稀5微升10毫克/毫升Cas9与25微升Cas9稀释缓冲液，使30微升的10 μ中号SpCas9。

将可光激活的 crRNA 与 tracrRNA 退火形成 cgRNA
1.重悬光笼crRNA和tracrRNA分别至100 μ与双工缓冲微米。
2.混合3微升的100 μ中号光笼与crRNA 3微升的100 μ中号tracrRNA在PCR管中。
3.在带有加热盖的热循环仪中在 95°C 下加热3 分钟。
4.在台式上冷却 5 分钟。
5.混合在24微升双工缓冲液使30微升10的μ中号退火CR / trRNA。

体外切割以测试 cgRNA 的光激活能力
1.将以下成分按顺序混合在一起。在加入 cgRNA 和 Cas9 之前彻底混合 NFW 和 NEBuffer TM 3.1，然后再次混合。准备 11 个相同的体积，全部在单独的 PCR 管中。
2.在台式（室温）上放置 30 分钟以形成 RNP 复合物。用铝膜覆盖，因为光笼式 gRNA 对光敏感。
3.添加2 PCR扩增的微升（〜60飞摩尔）PPP1R2靶DNA的每个管RNP（11中总计）。用移液器充分混合。˚F或高效率的反应，Cas9 / cgRNA应该在至少相对于靶DNA过量100倍。靶DNA也应与琼脂糖凝胶容易看见一个凝胶成像仪。
4.设置两个热循环仪 –一个到 37°C，另一个到 95°C。
5.移动一个管到所述37℃热循环仪，打开盖子，并等待1分钟。在管子上方 10 厘米处打开 365 nm LED 手电筒 1 秒；然后，立即转移至管95℃5分钟和然后到冰（其对应于“1秒”样品）（图1）。

图1.我Ñ体外裂解设置。(a) 将 Cas9、gRNA 和目标 DNA 添加到标有适当孵育时间的试管中。(b) 试管首先放入 37°C 培养箱中。在光照和 37°C 孵育指定时间后，将每个管转移到 95°C 培养箱中以热灭活 Cas9。(c) 使用市售 LED 手电筒进行曝光。首先打开管子，将手电筒置于管子上方 10 cm 处，打开灯 30 s。

6.使用其他三个管重复进行 5 秒、10 秒和 30 秒的光照（分别对应于“5 秒”、“10 秒”和“30 秒”样本）。
7.移动另一个管的37℃热循环仪，开盖，并等待1分钟。在管子上方 10 厘米处打开 365 nm LED 手电筒 30 秒，然后关闭手电筒并将管子盖上盖子再孵育 30 秒；转移到95℃持续5分钟，并然后到冰（其对应于“1分钟”样品）。
8.用 30 秒光照的其他五个管重复，然后在 37°C 下孵育1.5 分钟、4.5 分钟、9.5 分钟、19.5 分钟和 29.5分钟；转移至95℃5分钟，并然后以冰（其分别对应于“2分钟”，“5分钟”，'10分钟，'20分钟和'30分钟的样品，）。
9.所述一个剩余的样品不应当被暴露于光而直接移动到95℃5分钟和然后到冰（其对应于“没有光”样品）。
10.向所有 11 个管中加入 0.5 μl蛋白酶 K，并在 55°C 下孵育 15 分钟。
11.负载5微升每个管的（在时间持续时间的升序）用15混合微升的琼脂糖4％的水到每个孔ë - G ^ e1和10分钟运行。将 100 bp 阶梯添加到最左侧的车道。也可以使用替代的琼脂糖凝胶电泳系统。
12.可视化台风与TM FLA 9000使用的SYBR金设置。也可以使用替代的凝胶成像仪（图 2）。

图2 。我ñ体外裂解结果。在 444 bp 处迁移的顶部条带对应于PPP1R2的未切割 PCR 产物。底部条带由两个未解析的条带形成，均迁移约 220 bp，对应于 444 bp 顶部条带的裂解产物。每个泳道对应于无光照或不同的光照/孵育条件。

EMSA
1.将以下成分按顺序混合在一起。在加入 cgRNA 和 Cas9 并再次混合之前，彻底混合 NFW 和 NEBuffer TM 3.1。准备 2 个相同的体积，均在 PCR 管中作为样品 {B} 和 {C}。
2.通过用水代替 Cas9 和 cgRNA（阴性对照）来制备样品 {A}。
3.在台式（室温）上放置 30 分钟以形成 RNP 复合物。盖与铝膜因为光笼gRNA小号是光敏感的。
4.将 2 μl (~60 fmol) PCR 扩增的PPP1R2目标 DNA 加入三个管中。用移液器充分混合。˚F或高效率的反应，Cas9 / cgRNA应该在至少相对于靶DNA过量100倍。靶DNA也应与琼脂糖凝胶容易看见一个凝胶成像仪。
5.加入 0.5 μl蛋白酶 K 至 {C}，55°C 孵育 15 分钟。
6.负载5微升各管（以上升时间持续时间的顺序）15混合微升的琼脂糖4％的水到每个孔ë - G ^ e1和10分钟运行。将 100 bp 阶梯添加到最左侧的车道。也可以使用替代的琼脂糖凝胶电泳系统。
7.使用 SYBR Gold 设置，使用Typhoon TM FLA 9000 进行可视化。也可以使用替代的凝胶成像仪（图 3）。

图3 。EMSA 结果。泳道1是该阶梯; 泳道2是样品{A}（没有RNP的阴性对照）；泳道3是样品{B}（EMSA）；泳道 4 是样品 {C}（蛋白酶 K 消化的样品）。没有切割产物，因为 cgRNA 没有暴露在任何光线下，这表明即使在没有光激活的情况下，带有 cgRNA 的 Cas9 也能与 DNA 结合。

致谢

这项工作是由美国国立卫生研究院（R35 GM 122569到TH，资金支持和T32 GM 73009和F30 CA 254160到RSZ）和美国国家科学基金会（PHY 1430124至TH）。TH 是霍华德休斯医学研究所的研究员。
该协议源自：Liu, Y.、Zou, RS、He, S.、Nihongaki, Y.、Li, X.、Razavi, S.、Wu, B. 和 Ha, T. (2020)。按需提供非常快的 CRISPR。科学368(6496)：1265-1269。

利益争夺

作者和约翰霍普金斯大学已经提交了关于通过 cgRNA 对 Cas9 活动进行时空控制的方法的专利申请 PCT/US20/57256。

参考

Adli, M. (2018)。用于基因组编辑及其他方面的 CRISPR 工具包。国家通讯社9(1): 1911。
Hellman, LM 和 Fried, MG (2007)。用于检测蛋白质-核酸相互作用的电泳迁移率变化测定 (EMSA)。国家议定书2(8)：1849-1861。
Liu, Y.、Zou, RS、He, S.、Nihongaki, Y.、Li, X.、Razavi, S.、Wu, B. 和 Ha, T. (2020)。按需提供非常快的 CRISPR。科学368(6496)：1265-1269。
马拉菲尼，洛杉矶（2015 年）。原核生物中的 CRISPR-Cas 免疫。自然526（7571）：55-61。
Singh, D.、Sternberg, SH、Fei, J.、Doudna, JA 和 Ha, T.（2016 年）。通过 RNA 引导的核酸内切酶 Cas9 实时观察 DNA 识别和排斥。国家通讯社 7：12778。
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