材料和试剂

1.移液管头和管（爱思进，不同尺寸，和类型）
2.本氏烟草叶
3. TRIzol TM Reagent（Invitrogen，目录号：15596026）
4. PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Ta K aRa，目录号：DRR047A）
5. FastPfu DNA聚合酶（TransGen Biotech，目录号：AP221-01）
6.液氮
7. ģ EL样染料
8. TAE 缓冲液（Dunker等人，2021 年）
9.琼脂糖（Invitrogen，目录号：75510019）
10. Marker III（TIANGEN Biotech，目录号：MD103）

设备

热循环仪（B io -R ad ，型号：S1000 ）
冷冻离心机（Thermo Fisher，型号：Legend Micro 17R ）
电泳系统（北京六一生物科技有限公司，DYY-7C）
的Pipetman移液管（吉尔森，型号小号：P1000，P100，P20，P2 ，目录号小号：F123602，F123615，F123600，F144801）

软件

BioEdit ( https://bioedit.software.informer.com/ )
Primer Premier 5 ( https://primer-premier-5.software.informer.com/)

程序

引物设计和模板生成
为了检测线粒体或叶绿体转录物中特定或多个 RNA 编辑位点的RNA 编辑，可以使用 Primer 5 或其他引物设计软件，根据编辑位点上游和下游约 100 bp 的序列设计正向和反向引物（注1），具有一个推荐〜20个核苷酸和〜60的熔融温度的引物长度℃下。
根据制造商的说明和方案（MacRae，2007）（注 2），使用TRIzol TM试剂从植物组织中分离总 RNA 。
根据制造商的说明，使用 PrimeScript RT Reagent Kit 和 gDNA Eraser (Perfect Real Time) ( Ta K aRa ) 将大约 800 ng 总 RNA 逆转录为 cDNA ，最终体积高达 20 μl （注 3）。

目标编辑位点的 PCR 扩增和 DNA 测序
使用高保真 DNA 聚合酶对跨越目标 RNA 编辑位点的片段进行 PCR 扩增。
设置 PCR，将以下组分添加到 0.2 ml 的PCR 管中，最终体积可达 30 μl ：
ddH 2 O 18.4 μ l
5×FastPfu 缓冲液 6 μl
2.5 mM dNTP 2.4 μ l
正向引物 (10 μM) 0.8 μl
反向引物 (10 μM) 0.8 μl
FastPfu DNA 聚合酶 (2.5 U/μ l ) 0.6 μ l
模板 1 μ l
运行 PCR 反应：
1 个循环 95°C，2 分钟
34 个循环 95°C，20 秒；55°C，20 秒；72°C，20 秒
1 个循环 72 °C，2 分钟
用一半的 PCR 产物进行凝胶电泳(2% 琼脂糖),以确认扩增是否特异且大小正确。
使用 DNA 测序服务提供商提供的扩增引物对另一半 PCR 产物进行 DNA 测序（注 4）。

图 1.线粒体和叶绿体特定位点 RNA 编辑分析的工作流程

数据分析

如图 1 所示，评估了 cDNA 序列的 C 到 T 差异。RNA 编辑的程度通过使用 BioEdit 软件进行的序列分析中各个核苷酸峰的相对高度来估计。编辑水平计算为编辑效率 %= T/(C+T) × 100%。
在这里，我们展示了我们之前发表的作品的一个例子（Yang等，2020）。我们分析了C到的几个线粒体基因üRNA编辑程度NbMORF8沉默的烟草本塞姆氏利用GFP沉默的叶与叶的控制。我们以一个站点为例来说明使用 BioEdit 对峰进行的定量测量（图 2）。
通过 BioEdit 软件打开测序文件。
将黑色十字放在目标核苷酸峰（分别为核苷酸 T 和 C）的顶部并读取第二个数字，该数字显示了峰高。
计算编辑程度为效率%= T/(C+T) × 100%

图 2. Bioedit 对 RNA 编辑范围的分析。蓝色箭头标记目标核苷酸峰，黑色空心框标记峰高读数。

笔记

建议 PCR 片段的大小在 150 - 300 bp范围内。
总 RNA 的质量至关重要。因此，建议使用针对不同植物物种优化的最佳 RNA 分离方法。
由于基因组DNA的序列代表一个目标转录物的未经编辑的版本，它擦除的基因组DNA，以避免其干扰是很重要的与所述RNA编辑的分析。
建议对 PCR 产物进行正向和反向测序，因为一侧的测序质量有时不足以进行进一步分析。在我们的案例中，DNA 测序是由一家测序公司使用 Applied Biosystems 3730XL 进行的。

致谢

该工作得到了中国农业研究系统（CARS-09）、国家自然科学基金（31125022和31930094）、国家外国专家局创新学科人才引进计划（111项目）的支持中国事务 (B18042)。该协议改编自杨等人。（2020）我们之前发表在植物生理学上。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突小号。

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