材料和试剂

5 ml 圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器卡扣盖（Corning，Falcon，目录号：352235）
50 ml 离心管，锥形底部（Corning，Falcon，目录号：352070）
40 µm 细胞过滤器（Corning，Falcon，目录号：352340）
300 µl 胰岛素注射器，带 31 G 针头（BD Biosciences，目录号：328440）
1 ml注射器（VWR，目录号：612-0106）
针，25 G × 5/8（BD Biosciences，目录号：305122）
K2-EDTA Microtainer 管（BD Biosciences，目录号：365974）
1.7 ml Posi-Click 微量离心管（Denville，目录号：C-2170）
酒精制备垫（Covidien，WEBCOL，目录号：89029-964）
LC/MS 样品瓶（ThermoFisher，目录号：C4000-11）
LC/MS 瓶盖（ThermoFisher，目录号：C5000-54B）
ZORBAX Extend-C18，2.1 × 150 mm，1.8 μm（安捷伦，目录号：759700-902）
L-谷氨酰胺，13 C 5 ，99%（Cambridge Isotope Laboratories，目录号：CLM-1822-H）
L-谷氨酰胺，15 N 2 ，98%（Cambridge Isotope Laboratories，目录号：NLM-1328）
钠Ç hloride（Sigma-Aldrich公司，目录号：S5886）
用于 UHPLC 的水，用于质谱分析（Sigma-Aldrich，目录号：900682）
用于 UHPLC 的甲醇，用于质谱分析（Sigma-Aldrich，目录号：900688 ）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（PBS），不含钙和镁（Corning，目录号：21-031-CV）
胎牛血清（FBS），美国农业部测试（Cytiva，HyClone，目录号：SH3091003）
ACK 裂解缓冲液（ThermoFisher，Gibco，目录号：A1049201）
7-AAD（BD Biosciences，BD Pharmingen，目录号：559925）
三丁胺，用于液相色谱（Fisher Scientific，目录号：60-046-943）
冰醋酸，用于液相色谱（Fisher Scientific，目录号：A35-500）
盐水（见ř ecipes）
流动缓冲液（见ř ecipes）
细胞裂解缓冲液（见ř ecipes）
流动相缓冲液A（见ř ecipes）
流动相缓冲液B（参见ř ecipes）

设备

小鼠约束装置（Braintree Scientific Inc.，Tailveiner Restrainer，目录号：TV-150 STD）
显微解剖剪刀（Roboz S urgical，目录号：RS-5906SC）
窄型镊子（Fine Science Tools，目录号：11002-12 ）
迫击炮（VWR，目录号：89038-144）
杵（VWR，目录号：89038-160）
带有S-4xUniversal转子的冷藏摆斗离心机5910R（Eppendorf，目录号：5942000315）
带有 FA-45-30-11 转子的冷冻微量离心机 5430R（Eppendorf，目录号：5428000010）
分析天平（Mettler Toledo，目录号：ME54）
BD FACSAria II 细胞分选仪（BD Biosciences ）
SpeedVac 真空浓缩器（ThermoFisher ，目录号：RVT450 ）
LP Vortex Mixer（ThermoFisher，目录号：11676331）
6470 三重四极杆质谱仪（安捷伦）

软件

BD FACSDiva 软件，版本 8.0.2 (BD Biosciences)
Excel（微软）
Mass Hunter，版本 B.08.00（安捷伦）

程序

图 1 提供了整个过程的示意图。

图 1. 过程示意图概述

代谢示踪剂的制备和注射
通过将13 C 5 -谷氨酰胺或15 N 2 -谷氨酰胺粉末溶解在盐水中以 54.3 m g/ml的浓度制备示踪剂。在 37 °C 的水浴中轻轻加热直至溶解。每只小鼠，将200μl的示踪溶液是neede d。
注射前将鼠标放在加热灯下的笼子里 5到10 分钟（或使用其他方法来舒张血管，例如加热垫或将尾巴浸泡在温水中）。确保动物不会过热。
将动物放入约束装置中。
用酒精准备垫擦拭尾巴。
用 31 G 针头将 200 µl 示踪剂溶液吸入 300 µl 胰岛素注射器中。
在侧尾静脉中缓慢注入示踪剂溶液。
启动计时器设置为 10 分钟。

细胞分离和制备
注射示踪剂后正好 10 分钟，对小鼠实施安乐死。
使用带有 25 G 针头的 1 ml 注射器通过心脏穿刺获得外周血。
将血液转移到 K2-EDTA 管中并置于冰上。
分离股骨和胫骨，将它们清洗干净以去除肌肉组织，然后将骨头放入含有 5 ml 冰冷流动缓冲液的预冷研钵中。
注意：Ť他砂浆应当由安乐死鼠标之前将其放置在一个冰桶15分钟预冷。
从冰桶中取出含有骨头的砂浆，然后用杵垂直施加力将骨头压碎。将砂浆放回冰桶。
注意：避免研磨骨头，因为这会产生会干扰细胞分选的小碎片。
使用 1 ml 微量移液器将细胞溶液上下吹打数次，以打散任何可见的细胞团块。
将细胞悬液转移到 50 ml 锥形管中，该管带有 40 µm 细胞过滤器，置于冰桶中。
在含有骨碎片的研钵中再加入 5 ml 流动缓冲液，再次用研杵压碎，直到骨碎片完全变白。
使用 1 ml 微量移液器将细胞溶液上下吹打数次，以打散任何可见的细胞团块。
将细胞悬浮液转移到 50 ml 锥形管中，其中含有 40 µm 细胞过滤器，其中包含第一次粉碎的细胞。
将细胞悬液在冷藏摆斗离心机中以 350 × g 、4 °C离心 5 分钟。
倒出或吸出上清液。
将细胞溶液重悬在 5 ml 冰冷的 ACK 裂解缓冲液中（以去除红细胞）并在冰上孵育 5 分钟。
添加 20 ml 流动缓冲液。
在冷藏摆斗离心机中以 350 × g 、4 °C离心 5 分钟。
倒出或吸出上清液。
在含有 7-AAD 1/200 稀释度的2-3 ml 流动缓冲液中重悬细胞，并将细胞溶液转移到带有细胞滤网帽的 5 ml 流动管中。
注意：在原始研究（van Gastel 等人，2020 年）中，我们仅使用 GFP（标记白血病细胞）和 7-AAD 进行细胞分选。也可以用针对细胞表面标志物的荧光标记抗体对细胞进行染色。在这种情况下，最好先将细胞重悬在含有抗体的较小体积 (500 µl) 中，在冰上避光孵育 10 分钟，然后加入 1.5-2.5 ml 含有 7-AAD 的流动缓冲液。如果使用适当的抗体稀释度，通常不需要去除未结合的抗体。建议进行试点实验，以EN确保足够的染色与实现10分钟染色时间和无须洗。
立即进行细胞分选

细胞分选
恩肯定样本输入和分拣机被冷却到4的单元的样品收集器℃，该激光器的电压设置了与补偿之前将在实验开始执行。这可以在向小鼠注射示踪剂之前完成，也可以在样品制备过程中由不同的人完成。
确定目标群体（图 2），并将至少 10,000 个细胞分选到含有 500 µl 冰冷盐水的微量离心管中。理想情况下，分选 50,000-200,000 个细胞。限制排序时间一个最大的30分钟。请务必记下为每个样品获得的细胞编号。
分选完成后立即将细胞置于冰上。

图2 。代表性的流式细胞仪实验。从小鼠骨髓中分选活 AML 细胞 (7-AAD - GFP + ) 的门控策略。上图显示了活细胞的门控策略；底部图显示在具有低鼠标选通AML细胞（左），中（中央），或高（右）白血病负荷。P1 门，白细胞；P2门，单细胞；P3门，活细胞；P4的栅极，AML细胞即进行排序。

从细胞中提取代谢物
将细胞在冷藏的台式微型离心机中以 500 × g ，4 °C离心 2 分钟。
轻轻吸出上清液，留下 <20 µl。为避免吸入细胞沉淀，如果分选的细胞数量很少，细胞沉淀可能几乎不可见，请将吸引器尖端放在离离心机中心最近的管侧（因此离细胞沉淀最远）。
加入 200 µl细胞裂解缓冲液，冷却至 -20 °C。上下吸管混合均匀。
将样品储存在 -70 °C至 -80 °C。

从外周血血浆中提取代谢物
将血液样本在冷藏台式微型离心机中以 2,500 × g 、4 °C离心 5 分钟。
将上清液转移到微量离心管中。
将 5 µl 血浆转移到单独的微量离心管中（其余的血浆可以储存在-70 °C至 -80 °C）。
加入 100 µl细胞裂解缓冲液，冷却至 -20 °C。上下吸管混合均匀。
将样品储存在 -70 °C至 -80 °C。

液相色谱-质谱 (LC-MS) 的样品制备
准备流动相缓冲液 A 和缓冲液 B。
从 -70 °C到 -80 °C 的储存中取出样品，并在设置为 4°C 的 SpeedVac 真空浓缩器中干燥。
在 40 µl 流动相缓冲液 A 中重悬干燥的样品。
在 4 °C 下涡旋10 分钟。
将样品在4 °C 下以 10,000 × g离心10 分钟。
将上清液移入 LC-MS 小瓶并装入自动进样器。

液相色谱-质谱分析
在 Agilent MassHunter Acquisition 软件上创建化合物数据库，并包括您希望分析的化合物，包括有关化合物名称、化学式、母离子质量、产物离子质量、碎裂能、碰撞能量和保留时间的信息。所有这些信息都可以在安捷伦 dMRM 代谢组学数据库中找到。对于所有新化合物，必须运行标准以优化所有这些参数。向列表中添加代谢物的稳定同位素（如15 N-UMP）时，使用与轻代谢物（14 N-UMP）相同的保留碎裂能、碰撞能和保留时间。
设置液相色谱方法如下：设置 ZORBAX Extend-C18, 2.1 × 150 mm, 1.8 μm 柱，用 0.25 ml/min 的缓冲液 A 平衡柱 15 分钟。每次运行以0.25 ml/min 的缓冲液 A 流速开始，持续 2.5 分钟，然后是从 100% 缓冲液 A 到 80% 缓冲液 A：20% 缓冲液 B 的线性梯度，持续 5 分钟。˚F ollow用线性梯度小号80％缓冲液A：20％缓冲液B至55％缓冲液A：45％缓冲液B 5.5分钟; 55% 缓冲液 A：45% 缓冲液 B 至 1% 缓冲液 A：99% 缓冲液 B 7 分钟；和1% 缓冲液 A：99% 缓冲液 B 4 分钟。运行完成后，100％乙腈的回洗应当用于清洁柱10分钟，接着通过再平衡100％缓冲液A的8分钟。
确保仪器在使用前清洁和校准。打开 Agilent 6470 三重四极杆质谱仪，并在使用前预热至少 30 分钟。建立质谱方法如下：安捷伦喷射喷雾电离；雾化器，45 磅/平方英寸；毛细管电压, 2 , 000 V ; 喷嘴电压，500 V ；鞘气温度，325°C ；和鞘气流速，12 L/min。设置仪器收集大量数据的液相色谱方法，其中所述代谢物的前24分钟的持续时间被预期以洗脱。
编写一个序列，将上述化合物数据库、液相色谱和质谱协议应用于将要运行的每个样品。在序列中包括从自动进样器到 LC-MS 的每个样品的 15 µl 注射液和随后的针头清洗，以确保样品之间没有交叉污染。

数据分析

将数据导入 Agilent Mass Hunter 软件。
单击每个样品中的每个代谢物，以确保峰在正确的保留时间洗脱，具有适当的母离子和子离子质量，并且峰完全积分。
导出每个积分峰的离子计数。
在 Excel 工作表中打开结果。
通过将每个同位素体的离子计数 (IC) 除以特定代谢物的所有同位素体的 IC 总和，计算每个同位素体的丰度分数。例如，要计算谷氨酰胺的 M+2 同位素体丰度分数（其中 M 表示未标记代谢物的质量），请使用以下公式：

从典型的体内代谢追踪实验中获得的代表性数据的示例见表 1。
外周血浆中 M+5 谷氨酰胺（使用13 C 5 -谷氨酰胺时）或 M+2 谷氨酰胺（使用15 N 2 -谷氨酰胺时）的丰度分数用于排除标记不充分的样品。成功的实验将显示血浆中完全标记的谷氨酰胺的丰度为 0.40-0.60。如果血浆中完全标记的谷氨酰胺的丰度分数低于 0.40，则排除该小鼠的所有样品。

表 1.体内代谢追踪实验获得的数据示例。给小鼠注射15 N 2 -谷氨酰胺，并在外周血和从骨髓中分离的 AML 细胞中研究了谷氨酰胺衍生的氮对其他氨基酸合成的贡献。作为起始材料，使用 5 µl 外周血浆或 50,000 个 AML 细胞。在的MassHunter得到的离子计数，被导出到Excel，其中的兴趣，平均值的同位素异数体的丰度分数，计算和标准偏差（STDEV）。应小心解释为低丰度代谢物同位素丰度分数时（见图中的AML细胞脯氨酸的结果例如），它往往给样品之间的大的可变性。

笔记

所需的生物学重复次数取决于样品之间的变异性。对于基于小鼠白血病移植的模型，个体小鼠之间的变异性通常小于更复杂的系统，如原代小鼠白血病或人类 PDX 系。在我们的研究中，我们从每组 10 只小鼠开始，分成 2-3 个单独的实验。根据执行尾静脉注射的人的技能，由于血液中示踪剂水平不足，需要排除 10-40% 的样本。
该协议需要三名研究人员在程序AE期间共同工作。我们通常以交错的方式向小鼠注射示踪剂，每 30 分钟注射 1 只小鼠。人A喷射鼠标，进行安乐死，分离血液和骨骼，并粉碎骨头（直到小号TEP B10）。该序列可由训练有素的研究人员在 30 分钟内完成。人物B然后接管，离心机的细胞，进行红细胞裂解，准备用于FACS的细胞，并将它们带到在冰箱的细胞分选仪（小号TEPS B11至B18;需要大约20分钟），在那里吨他ÿ手了样本，以人C，谁负责的细胞分选。然后，B 人采集前一个样本，该样本应在分选 30 分钟后完成，并从细胞中提取代谢物（程序D；需要不到 10 分钟）。从外周血（代谢物提取步骤E），同时在离心和温育步骤（等待通常是由个人B进行小号TEPS B11，B13 ，和B15），尽管这也可以通过一个额外的人来执行。如果进行额外的细胞表面染色，则根据所需的染色时间调整顺序，但通常仍可由三个人完成。一个训练有素的团队将能够在一个下午分离和处理 10 只小鼠的样本。
在某些情况下，从一只小鼠身上获得的细胞数量可能太少而无法进行充分的分析（例如，在某些化疗后的白血病小鼠中）。在这种情况下，也能够裂解细胞在80％的甲醇（更小的调整的音量小号干燥该样品之前TEP D3）和不同的小鼠的合并样品。
我们的方案使用标记谷氨酰胺的静脉推注来研究其在小鼠白血病细胞中的代谢命运，而其他研究则使用了重复推注或连续输注示踪剂 ( Broekaert and Fendt, 2019; Muir et al. , 2017 )。白血病细胞中的代谢物标记取决于几个因素，包括血液中前体池的富集、其他器官中标记谷氨酰胺的代谢使稳定同位素进入白血病细胞的方式复杂化，以及建立所需的时间。复杂的标签模式（Faubert 和 DeBerardinis，2017 年）。施用单次示踪剂的主要优点是易于递送和所需示踪剂的量相对较少，从而降低了实验成本。此外，如果在推注后不久对白血病进行采样，则其他组织中代谢的复杂影响可能会最小化。在我们最初的研究中，我们确定了注射示踪剂后分离白血病细胞的最佳时间点，例如，在注射示踪剂 15 分钟后，我们在小鼠外周血中检测到了其他几种标记代谢物（van Gastel等, 2020)。
大剂量注射的缺点包括整体标记程度较低，以及缺乏一些需要更长时间才能形成的特定标记模式。另一个问题是推注可能会增加血液中的总前体池，这本身可能会改变白血病细胞的代谢。虽然我们发现注射后外周血中的总谷氨酰胺水平几乎翻了一番（50% 未标记和 50% 标记），但骨髓中 AML 细胞中的谷氨酰胺水平并未因推注而发生实质性变化（见图3）。谷氨酸，天门冬氨酸，在AML细胞和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的水平也没有改变。

图 3. 标记谷氨酰胺推注对代谢物水平的影响。与未注射的对照小鼠相比，推注13 C 5 -谷氨酰胺后小鼠外周血 (PB) 血浆和骨髓 AML 细胞中的代谢物水平。Gln ，谷氨酰胺；Glu 、谷氨酸：天冬氨酸、天冬氨酸；GSSG ，氧化型谷胱甘肽。

食谱

盐水
0.9% NaCl 水溶液（LC-MS 级）
流量缓冲区
PBS 中的 2% FBS
注意：可以将 EDTA 添加到 2 mM 的流动缓冲液中，以防止细胞间相互作用并减少 FACS 中的双峰事件。
细胞裂解缓冲液
80% 甲醇（LC-MS 级）
20% 水（LC-MS 级）
流动相缓冲液 A
97% 水（LC-MS 级）
3% 甲醇（LC-MS 级）
10 mM Trib u t y lamine（LC-MS 级）
15 mM 冰醋酸（LC-MS 级）
酸碱度 5.5
流动相缓冲液 B
甲醇（LC-MS 级）
10 mM Trib u t y lamine（LC-MS 级）
15 mM 冰醋酸（LC-MS 级）

致谢

该协议基于我们之前发表的研究（van Gastel等人，2020 年）。NvG 得到了 Alex's Lemonade Stand Foundation 和 Tap Cancer Out 的资助。JBS 得到了 NCI F99/K00 博士前到博士后过渡奖学金 (K00CA234839) 的支持。DTS 得到了哈佛干细胞研究所和哈佛路德维希中心以及哈佛 Gerald 和 Darlene Jordan 医学主席的支持。

利益争夺

DTS 是 Agios Pharmaceuticals、Magenta Therapeutics、Editas Medicines、Clear Creek Bio 和 LifeVaultBio 的董事和股权持有人；他是命运治疗和品红色治疗的创始人和顾问FOG制药，VCanBio ，和旗舰创业。NvG 和 DTS 是与这项工作相关的专利的发明者。

伦理

小鼠实验得到哈佛大学艺术与科学学院动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。

参考

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