材料和试剂

1.线虫感兴趣的菌株 ( https://cgc.umn.edu/ )
2. OP50大肠杆菌菌株 ( https://cgc.umn.edu/ )
3.用 OP50 播种的 NGM 板
4. PBS/磷酸盐缓冲盐水，1 ×粉末，pH 7.4（Fisher Scientific，目录号：BP661-10）
5. Tris Base （Sigma - A ldrich，目录号：648311）
6. EDTA （Sigma - Aldrich，目录号：E9884 ）
7. EGTA （Sigma - Aldrich，Calbiochem，目录号：324626）
8.亚精胺三盐酸盐（Sigma - Aldrich，目录号：S2501）
9. PIPES （Sigma - Aldrich，目录号：P1851）
10. BME/β-巯基乙醇（Sigma - Aldrich，目录号：M6250）
11. DTT/二硫苏糖醇（Fisher Scientific ，目录号：FERR0861）。在 4 °C 下储存，或在 -20 °C 下分装
12. H 2 O 2 /过氧化氢30%，含稳定剂（Sigma - Aldrich，目录号：H1009）
13. H 3 BO 3 /硼酸粉末99 。5% （Fisher Scientific ，目录号：18-609-176）
14.甲醛溶液，37% （Sigma - Aldrich，目录号：252549）。储存在 4 °C
15. Triton X-100 非离子洗涤剂（Sigma - Aldrich，目录号：X100）
16. BSA （Sigma - Aldrich，目录号：A2153）。在 4 °C 下储存，或在 -20 °C 下分装
17. NaN 3 /叠氮化钠（Sigma - Aldrich，目录号：S2002）
18. GT335（AdipoGen Life Sciences，目录号：AG-20B-0020-C100）。储存在-20 °C
19. Alexa-fluor 568 偶联的驴抗小鼠二抗（Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A10037）。商店中的黑暗中在4 ℃下
20.次氯酸钠 5.65-6% 溶液（Fisher Scientific，目录号：SS290-4）或 Clorox 漂白剂（~7.5% 次氯酸钠）
21.钾ħ ydroxide（KOH）（Fisher Scientific公司，目录号：P251-500）
22.琼脂糖（Fisher Scientific ，目录号：16-520-050）
23. 2 × Ruvkun 缓冲液（见配方）
24. Tris-Triton 缓冲液（见配方）
25. 20 × BO 3缓冲液（见配方）
26. 1 × BO 3 + 0.01% Triton 缓冲液（见配方）
27.抗体缓冲液 A （见配方）
28.抗体b uffer乙（见配方）
29. M9溶液（见ř ecipes）
30. 5中号KOH（见ř ecipes）
31. Tris-Triton 缓冲液 +1% β-巯基乙醇（见配方）
32. 1 M DTT 解决方案（见配方）
33. 1× BO 3 + 0.01% Triton 缓冲液 + 10 mM DTT（见配方）
34. 1× BO 3 + 0.01% Triton 缓冲液 + 0.3% H 2 O 2 （见配方）
35.大号iquid 2％琼脂糖（参见ř ecipes）

设备

注：设备类似的项目描述如下是必需的。
Platform Rocker （Fisher Scientific ，Thermo Scientific Vari-Mix，目录号：09-047-113Q ）
中号icrocentrifuge（Fisher Scientific公司，Thermo Scientific的SORVALL图例21，目录号：75-77-2488）
具有 63 × (NA 1.4) 或 100 × (NA 1.4)油浸物镜的复合落射荧光或共聚焦显微镜
数字米icroscope相机（的显微镜相机的示例，我们已经成功地用于该协议包括：
Retiga-SRV Fast 1394 数码相机
Photometrics Cascade 512B CCD 相机
滨松 C11440-42U ORCA-Flash4.0 LT 数码 CMOS 相机
摄影测量 CoolSNAP HQ2-FW 相机
中号icroscope载玻片（Fisher Scientific公司，目录号：22-265446）
Carl Zeiss 高性能盖玻片（Fisher Scientific，目录号：10474379）
ģ小姑娘巴斯德吸管（Fisher Scientific公司，目录号：13-678-20A）
Ë yelash寸步不离地牙签

软件

ImageJ（美国国立卫生研究院，https: //imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

可选：用于固定的动物同步
为了比较对照品系和突变品系的结果，动物的年龄匹配很重要。然而，该步骤可以省略，如果实验的目的是为了跨越的所有发育阶段检测的表位线虫线虫。
生长线虫上的6厘米NGM板与OP50接种使用标准方法大肠杆菌（参见wormbook.org为标准生长条件和指令M9溶液，NGM板，并培养OP50的）。
当存在许多妊娠雌雄同体时，通过将 0.5 ml M9 溶液移到板上，倾斜板以将雌雄同体洗掉，并将蠕虫悬浮液移入 1.5 ml 离心管中，从而将蠕虫从板上洗掉。添加20 μ升的5M的KOH和100 μ升的5.65 - 7.5％次氯酸钠（漂白剂;我们使用的Clorox任选地，5.65。- 6％次氯酸钠溶液作品一样好）。孵育约 5-10 分钟，偶尔倒置管以保持蠕虫悬浮。这一步溶解了成体，但保留了被坚硬蛋壳包围的胚胎。
每隔几分钟，通过在解剖显微镜下观察试管或将其置于光线下并用肉眼观察，检查成虫是否消失。当悬浮液中很少见成虫时，在台式离心机中以 ~900 × g （~ 3 , 000 rpm）旋转管子约 20秒，以通过次氯酸盐消化成人释放出的胚胎（卵）颗粒。
可选：通过移液除去大部分上清液，但假〜100微升，使该沉淀物是不受干扰。然后加入 900 μl M9 溶液并重悬洗涤，除去大部分次氯酸钠。次氯酸钠可诱导氧化应激，从而改变某些基因的表达。在台式离心机中以 ~ 900 × g (~ 3 , 000 rpm)旋转管子~ 20 s以沉淀胚胎 (鸡蛋)。
通过移液去除大部分上清液，但保留 ~100 μl 。
PIP ETTE上下轻轻地重新悬浮在100胚胎的粒料微升。（如果很少有蠕虫在次氯酸钠处理中存活，请考虑使用 M9 溶液清洗一两次（步骤A 4 ）以去除次氯酸钠）。
将胚胎悬浮液滴到带有 OP50 草坪的新鲜 NGM 板上。将液滴放在 OP50 的草坪外，并倾斜板以将液滴散开，以便液体（仍包括次氯酸钠）更快地浸入 NGM 板和/或蒸发。（如果胚胎继续在次氯酸盐混合物中浸泡太久，它们将无法存活）。尝试添加荷兰国际集团大约每板100-200胚胎到每个5层的板。如果您没有足够的胚胎，请增加通过漂白同步的起始板的数量。
孵育在20 ℃下为大约三天达到成年的第一天。温度或时间可以根据老化速度和蠕虫菌株繁殖的差异进行调整，以提供松散同步的年轻成虫种群或所需的幼虫阶段。
注：牛逼他的方法只隔离包含在成人雌雄同体的子宫的胚胎。胚胎发育发生在成年雌雄同体子宫内，因此胚胎在发育方面可能相隔几个小时。因此，使用这种方法，胚胎将只是松散地发育同步。为了更紧密的同步，必须使用其他方法。

固定
收集蠕虫从3 -通过洗涤它们关闭与M9 5非饥饿，未污染的板，并将它们传送至1.5ml离心管中。需要来自多个板块的许多蠕虫，因为在随后的每个步骤中都会丢失一些蠕虫。由于蠕虫坚持的塑料吸管尖端的内部，全光照摹无菌玻璃巴斯德移液器在这一步转移蠕虫可以帮助防止该蠕虫的损失。
通过重悬在 1 ml M9 中，在约 60 分钟内洗涤四次，以便排出肠道中的细菌。在洗涤之间，通过以~900 × g (~3 , 000 rpm)离心2 分钟来沉淀蠕虫，然后使用移液器小心地取出大部分上清液。是一定要留下蠕虫不变的沉淀。
在冰上冷却蠕虫并以~900 × g (~ 3 , 000 rpm)离心2 分钟。去除上清液以减少体积至 500 μl，然后加入 500 μl冰冷的2 × Ruvkun 缓冲液至终浓度为 1 × . 添加 54 μl 37% 甲醛（终浓度 ~2%）。甲醛固定可能会对某些表位产生负面影响，其浓度（在 ~1 - 4%范围内）可能需要通过反复试验来调整。通过颠倒混合的管或吸移。
在液氮或干冰/乙醇中快速冷冻。此步骤可能有助于破解或渗透坚韧的蠕虫角质层。冷冻样品可以储存在 -80 °C 。
在自来水下融化冷冻的蠕虫颗粒。
在冰上孵育，偶尔颠倒管子，30 分钟。
在 Tris-Triton 缓冲液中洗涤蠕虫两次，方法是在~900 × g (~ 3 , 000 rpm)下离心2 分钟，小心地取出上清液，并重悬在1 , 000 μl Tris-Triton 缓冲液中。Triton 清洁剂有助于防止蠕虫粘附在移液器、管子和彼此上。
通过在~400 × g (~ 2 , 000 rpm)下离心2 分钟来沉淀蠕虫。在这一步之后，动物应该被认为是脆弱的。从这一点开始，当成粒蠕虫时，离心机不要超过~400 × g (~ 2 , 000 rpm) 。去除上清液，小心避免沉淀，并将蠕虫重悬在 5 00 μl Tris-Triton 缓冲液 +1% β-巯基乙醇中。在 37 °C培养箱中的摇臂平台上轻轻搅拌孵育 2-8 小时。β-巯基乙醇可以减少蛋白质中的二硫键，从而改善角质层的渗透性。与β-巯基乙醇在高温下孵育也可能有助于使 DNase、蛋白酶和过氧化物酶等酶变性，这些酶可能会破坏表位。
通过在离心机中沉淀，小心去除上清液，并用1 , 000 μl 1 × BO 3 + 0.01% Triton 缓冲液重悬，将蠕虫洗涤一次。BO 3缓冲液具有有利于后续步骤中的氧化还原反应的碱性 pH 值。
粒料蠕虫，去除上清液留下沉淀不受干扰，且在500重悬蠕虫微升的1 × BO 3 + 0.01％的Triton缓冲液+ 10 mM的DTT。在室温下在摇杆平台上轻轻搅拌孵育 15 分钟。DTT 还可以通过进一步减少二硫键来改善角质层渗透性。
一旦通过造粒在离心机，小心地除去上清液，并用重悬洗蠕虫1 ，000微升的1 × BO 3 + 0.01％的Triton缓冲液。
粒料瓦特的ORM，取出上清液留下的沉淀不受干扰，且在500重悬蠕虫微升的1 × BO 3 + 0.01％的Triton缓冲液+ 0.3％H 2 ö 2 。在室温下轻轻搅拌孵育 15 分钟。H 2 O 2可以氧化巯基以防止二硫键重整。
一旦通过造粒在离心机，小心地除去上清液，并用重悬洗蠕虫1 ，000微升的1 × BO 3 + 0.01％的Triton缓冲液。
离心沉淀，除去上清液，并用1 , 000 μl Antibody buffer B 重悬。在室温下轻轻搅拌至少洗涤 15 分钟，以除去任何残留的 BO 3缓冲液或 H 2 O 2 。通过以~400 × g (~ 2 , 000 rpm)旋转2 分钟形成沉淀，并在 ~100-300 μl抗体缓冲液 A 中重悬，具体取决于存在的蠕虫数量。蠕虫现已固定，可以在 4 °C的抗体缓冲液 A 中安全储存长达一个月。

一抗结合
1.重悬固定蠕虫轻轻颠倒试管，然后在30转移微升固定蠕虫使用一个移液管尖端，已被切割，以扩大开口（新的1.5ml管吨他可以防止对脆弱固定蠕虫损伤）。目视确认存在许多蠕虫，如有必要，调整音量。应该有数百条蠕虫。
2.加入 170 μl Antibody buffer A和适量的所需一抗。例如，我们经常使用稀释度为 1:450 的 GT335（一种结合翻译后多聚谷氨酸化蛋白（如微管蛋白）的分支点谷氨酸的单克隆抗体）。如果我们有三个线虫菌株进行比较，我们会将 1.33 μl GT335稀释到 510 μl抗体缓冲液 A 中，然后将 170 μl稀释液添加到 30 μl蠕虫悬浮液中，以 1:450 的最终体积稀释200微升。根据抗体文档，在室温或 4 °C的冷藏室中孵育过夜。（孵育时间可以减少，但建议至少2 小时以允许通过角质层和组织扩散。）稀释和孵育温度可能需要凭经验确定。尤其是在尝试新抗体时，还值得加入不添加一抗的对照。使用摇杆提供温和的搅拌。
3.用抗体缓冲液 B将蠕虫洗涤两次，在离心机中沉淀，小心除去最后的 ~50 - 100 μl上清液，然后重悬在 500 μl抗体缓冲液 B 中。然后将蠕虫沉淀，去除上清液，并重悬蠕虫在至少 500 μl抗体缓冲液 B 中进行第三次，并在室温下轻轻摇动孵育至少 2 小时至过夜以消除所有未结合的一抗。
4.通过在离心机中沉淀来清洗蠕虫一次，小心地除去最后~50 - 100 μl上清液之外的所有上清液，并重新悬浮在 500 μl抗体缓冲液 A 中。将蠕虫沉淀并去除上清液，留下大约最后 50 μl 。

二抗结合
加入 150 μl在抗体缓冲液 A 中稀释的二抗，最终体积为 200 μl 。我们通常使用的Alexa-568氟-缀合的驴抗小鼠二抗以稀释的1：2 ，000 ：1或2 ，500在20的最终体积0 μ虫悬浮液升。将管子放在纸板冷冻箱中或用铝箔盖住以避光，并在室温下在摇杆上孵育 2 小时。
通过在离心机中沉淀，在几个小时内洗涤蠕虫五次，小心去除除最后 ~50 - 100 μl 上清液之外的所有上清液，重新悬浮在 500 μl 抗体缓冲液 B 中，轻轻摇动以去除未结合的二抗。如果观察到过多的非特异性二抗染色，继续用抗体缓冲液 B 清洗蠕虫几个小时和/或在抗体缓冲液 B 中放置过夜。固定染色的蠕虫可以在 4°C 下储存一个月或更长时间。
通过在载玻片上加入一滴 2% 琼脂糖液体并立即将另一张载玻片放在上面以形成平坦的薄层，从而制作琼脂糖垫。通过使用已被切割以稍微扩大开口以将 3-5 μl液滴转移到琼脂糖垫上的移液器吸头，取出顶部载玻片并安装蠕虫进行成像。使用粘在牙签上的睫毛轻轻定位，并在成像前盖上盖玻片。使用睫毛手动清除固定或染色过程中可能残留的任何碎屑或沉淀物。如果很少有染色的蠕虫被转移到载玻片上，让蠕虫沉降到管的底部，然后减少管中的体积或直接从颗粒中吸取蠕虫而不是重新悬浮，然后再尝试再次安装蠕虫。

数据分析

因为 Alexa-fluor 568 发出红色荧光，我们通常会获取双色图像来捕捉表达绿色荧光蛋白标记的转基因动物的红色免疫荧光。GFP荧光出现定影后调光器和比活的动物染色治疗，但通常可以用于提供可视陆标来解释组织，细胞，或亚细胞以红色免疫荧光是d结构etected 。我们使用单色 CCD 或 CMOS 相机通过光学切片获取落射荧光或共焦数据，并在使用 ImageJ 软件创建的 z 投影中单独或组合观察颜色通道。
ř esults通常在各试验一致，但一些变化是蠕虫（图2）的染色的强度可以预期的。为了自信地报告检测到免疫荧光的组织、细胞或亚细胞结构，重要的是要在多只动物中看到一致的染色。我们通常首先用显微镜检查许多动物并捕获至少 10 只动物的图像以进行定量分析（染色的存在或不存在、染色结构的面积/区域或染色的荧光强度）。我们已经使用接受这种抗体染色方法的动物的图像分析来检测不同基因型的谷氨酰化差异（O'Hagan等人，2011），其他人已经检测到基于环境调节的差异（Kimura等人，2018 年）。

图2 。GT335 一抗和 Alexa-fluor 568 偶联二抗染色的代表性图像。GT335 通过标记分支点谷氨酸来检测翻译后谷氨酰化（Wolf等，1992）。在这张C. elegans成年雄性鼻子的图片中，GT335 单克隆一抗的间接免疫荧光（洋红色），用 Alexa-fluor 568 偶联二抗标记，标记了amphid 通道神经元的纤毛中间段，以及 CEP （头部）纤毛。PKD-2::GFP（绿色）标记鼻子中雄性特异性 CEM（头部雄性）感觉神经元的纤毛。该落射荧光图像是使用 Photometrics Cascade 512B CCD 和蔡司 Axioplan2 显微镜与 100 × (NA 1.4) 油浸物镜拍摄的。ns 表示非特异性染色——一团碎片和荧光二抗粘在口腔开口处。结构的不一致或可变染色有时表明它可能是非特异性的。口腔是观察非特异性染色的常见位置。根据二抗的不同，有时会在环或其他表皮结构上观察到非特异性染色，并且可能在省略一抗的对照中看到。我˚F可用，ü瑟遗传突变体缺乏的抗原表位或感兴趣的蛋白质来验证实验中使用的抗体。

食谱

2 × Ruvkun 缓冲器
160 毫米氯化钾
40 毫米氯化钠
20 mM EGTA
10 mM 亚精胺-HCl
30 mM PIPES 缓冲液，pH 7.4
50%甲醇
储存在4 °C
PIPES 缓冲液 pH 7.4 通常通过将 302.37 g PIPES 粉末添加到 600 ml ddH 2 O 中并通过添加大约 153 ml 10 N NaOH 使pH 达到 7.4 来制成1 M储备液，然后通过添加 ddH 2 O达到体积。在 pH 值高于 6.5 之前不会轻易溶解。
Tris-Triton 缓冲液
100 mM Tris-HCl，pH 7.4
1% 海卫 X-100
1 mM EDTA
Tris-HCl pH 7.4 溶液通常通过在 ddH 2 O 中稀释 Tris 碱并通过缓慢加入 HCl 将 pH 值调至 7.4制成 1 M 储备液。
20 × BO 3缓冲器
1 MH 3 BO 3
0.5M 氢氧化钠
用 ddH 2 O稀释至 1 ×
1 × BO 3 + 0.01% Triton 缓冲液
在 1 × BO 3缓冲液中以 1:100 的比例稀释 Tris-Triton 缓冲液
抗体缓冲液 A
1 × PBS
1% BSA
0.5% 海卫 X-100
0.05%叠氮化钠
1 mM EDTA
储存在4 °C
抗体缓冲液 B
1 × PBS
0.1% BSA
0.5% 海卫 X-100
0.05%叠氮化钠
1 mM EDTA（与抗体缓冲液 A相同，但仅含 0.1% BSA）
储存在4 °C
注意：抗体稀释液应从冷藏或冷冻的等分试样中新鲜制备，以尽量减少冻融循环。
M9缓冲器
3 克 KH 2 PO 4
6 克 Na 2 HPO 4
5 克氯化钠
1 毫升 1 M 硫酸镁4
ddH 2 O 至 1 L
高压灭菌
5M 氢氧化钾
将 28.05 g KOH 颗粒添加到大约 75 ml ddH 2 O。
一个llow溶解，偶尔晃动。溶解 KOH 会产生热量，所以不要盖紧盖子。然后用 ddH 2 O 定容至 100 ml 。
Tris-Triton 缓冲液 +1% β-巯基乙醇
在通风橱中工作，将 100 µl β-巯基乙醇加入 15 ml 锥形管中。
添加的Tris-的Triton缓冲到一个10毫升的最终体积。
1M DTT解决方案
在通风橱中工作，溶解1.55克DTT粉末的10毫升升的DDH 2 O.
分装成 1 ml 等分试样，并在 -2 °C 下储存。
1× BO 3 + 0.01% Triton 缓冲液 + 10 mM DTT
在通风橱中工作，将 100 µl 1 M DTT 溶液添加到 15 ml 锥形管中。
加1×BO 3 + 0.01％的Triton缓冲到一个10毫升的最终体积。
1× BO 3 + 0.01% Triton 缓冲液 + 0.3% H 2 O 2
在通风橱中工作，将 100 µl 过氧化氢 30% 溶液添加到 15 ml 锥形管中。
加1×BO 3 + 0.01％的Triton缓冲到一个10毫升的最终体积。
大号iquid 2％琼脂糖
将 2 g 琼脂糖添加到 100 ml ddH 2 O。
微波加热直至琼脂糖完全溶解。
在仍为液体时使用。

致谢

这项工作由新泽西州脊髓研究委员会 (NJCSCR) CSCR15IRG014 资助。在我们最近的研究出版物使用这种方法，电源等。（2020 年），以及之前的出版物（Topalidou 和 Chalfie，2011 年；O'Hagan等，2011 年和2017 年）。该方法是对 Finney 和 Ruvkun 方法（Finney 和 Ruvkun，1990）的最小修改。

伦理

线虫的使用不需要机构批准。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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杜尔，JS （2006 年）。免疫组织化学。蠕虫书19:1-61。
Finney, M. 和 G. Ruvkun ，（1990 年）。在UNC-86基因产物夫妇细胞谱系和细胞身份线虫。单元格63(5)：895-905。
Kimura, Y., Tsutsumi, K., Konno, A., Ikegami, K., Hameed, S., Kaneko, T., Kaplan, OI, Teramoto, T., Fujiwara, M., Ishihara, T., et艾尔。(2018)。感觉纤毛中微管蛋白谷氨酰化的环境反应性受 p38 MAPK 通路调节。科学报告8 (1): 8392。
Miller, DM 和 Shakes , DC ( 1995 ) 。免疫荧光显微镜。方法细胞生物学48：365-394。
Nance, J.和Frøkjær-Jensen, C. （2019 年）。在秀丽隐杆线虫转基因工具箱。遗传学212（4）：959-990。
O'Hagan, R., Silva, M., Nguyen, KCQ, Zhang, W., Bellotti, S., Ramadan, YH, Hall, DH 和 Barr, MM (2017)。谷氨酰胺化调节运输，使功能特化，并塑造纤毛的结构。Curr Biol 27(22): 3430-3441 e3436。
O'Hagan, R., Piasecki, BP, Silva, M., Phirke, P., Nguyen, CQ, Hall, DH, Swoboda, P. 和 Barr, MM ( 2011 ) 。微管蛋白去谷氨酰胺酶 CCPP-1 调节秀丽隐杆线虫感觉纤毛的功能和稳定性。Curr Biol 21（20）：1685-1694。
Power, KM, Akella, JS, Gu, A., Walsh, JD, Bellotti, S., Morash, M., Zhang, W., Ramadan, YH, Ross, N., Golden, A., Smith, HE, Barr, MM和O'Hagan, R. （2020 年）。NEKL-4/NEK10 和 TTLL 基因的突变抑制由 CCPP-1 脱谷氨酰胺酶功能丧失引起的神经元纤毛变性。PLOS 遗传学16(10)：e1009052。
Topalidou, I. 和 Chalfie, M. ( 2011 ) 。表达共同选择基因的不同神经元中的共享基因表达。Proc Natl Acad Sci USA 108 (48) ：19258-19263。
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