材料和试剂

过滤移液管头1 - 10个，1 - 20，1 - 200 100 - 1 ，000微升（STARLAB ，目录号小号：S1120-3810 [P10] ; S1120-1810 [P20] ; S1120-8810 [P200] ; S1122 -1830 [P1000] ) 或等效物
10 cm 板（组织培养处理的 100 mm 培养皿；Corning，目录号：430167）或同等产品
24 -孔板（TC处理的24孔板;康宁® Costar公司® ，目录号：3527）或等效
带螺旋盖的微量离心管带有刻度，带盖闩 1.5 毫升
15米升锥形离心管（默克，康宁® ，目录号：CLS430791）或等效
Nunc TM EasYFlask TM 75 cm 2细胞培养瓶（ThermoFisher ，目录号：156472）或等效物
无菌注射器（20毫升）中，克eneric
的Millex -HV小号yringe ˚F ILTER ü尼特，0.45微米，PVDF 33毫米，伽马灭菌（默克，目录号：SLHV033RB）或等效
96 孔 V 型底板（96 孔 TC 处理的微孔板，康宁，目录号：3894）或等效物
干冰
乙醇绝对含量≥99.8%（Avantor ，VWR Chemicals，目录号：20821.467DP）或等效物
HEK 293T/17 细胞（ATCC，目录号：CRL-11268）
带有人 ACE2 和 TMPRSS2 的工程化 HEK 293T/17 细胞（NIBSC 代码 CFAR#101008）
质粒：
转移载体：pCCL.SFFV.eGFP
慢病毒转移载体编码pCCL骨架中SFFV 启动子下游的eGFP 。

第二代慢病毒包装质粒：pCMVR8.74 （Addgene ，目录号：22036）
糖蛋白表达质粒：pCDNA-SARS-CoV-2-S (D614G)ΔERR
pCDNA骨架中CMV 启动子下游的 SARS-CoV-2 尖峰糖蛋白。糖蛋白包含 D614G 取代和删除其羧基末端的最后 19 个氨基酸以去除其内质网滞留信号 (ΔERR)。

Iscove 的改良 Dulbecco 培养基（Merck ，Sigma-Aldrich，目录号：I3390）补充有 2mM L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清（FBS）（Biosera ，目录号：FB-1001/500）
嘌呤霉素（InvivoGen ，目录号：ant-pr-1）或等效物
减少血清培养基 Opti-MEM TM （Thermo Fisher Scientific ，Gibco TM ，目录号：31985047）
GeneJuice转®转染试剂（Merck公司中号illipore，目录号：70967）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：D8537）或等效物
细胞解离缓冲液基于无酶 PBS（Thermo Fisher Scientific ，Gibco TM ，目录号：13151014）以避免 hACE2 和 TMPRSS2 的表面裂解
聚凝胺转染试剂 10 mg/ml（Merk，目录号：TR-1003-G）
活力染料（Thermo Fisher Scientific ，eBioscience TM Fixable Viability Dye eFluor TM 780，目录号：65086514）或等效物

设备

II 类生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：HeraSafe TM 2030i）
水浴（Avantor ，VWB2系列，VWB2 2，目录号：462-0554）或当量一个升ë NT
孵化仪（Eppendorf，型号：CellXpert ® C170）或同等学历
移液器（的Eppendorf研究®加，P2，P20，P200 ，和P1000）或同等学历
细胞计数器（Chemometec ，AUT ö配合小区的一个lyzer NucleoCounter中® NC-250 TM ）用溶液18 AO.DAPI（Chemometec ，目录号：910-3018）或等效
板离心机（赛默飞世小号系统求解，型号：贺利氏Multifuge X3R）或等效
配备蓝色和红色激光的流式细胞仪
该协议使用了 BD LSRFortessa TM X-20 细胞分析仪，但不限于此设备。在没有流式细胞仪的情况下，可以使用装有 488 nm 激发激光的荧光显微镜。

软件

FlowJo TM软件，版本 10.7.1 (BD Bioscience)
可以使用用于 Flow Cytom e try 分析的替代软件。

程序

通过瞬时转染产生尖峰 LV
第 1 天：细胞接种

种子2.0 × 10 6细胞 HEK293T/17 细胞每 10 厘米板在 10 毫升培养基中，补充有 2 mM L-谷氨酰胺和 10% FCS，目标是在转染当天达到 80% 汇合。

第 3 天：转染

准备两个标有 Tube 1 和 Tube 2 的无菌 1.5 ml 微量离心管。
添加5.56微克pCMVR8.74的，2.77微克的pCDNA-SARS-CoV的-2-S （D614G）ΔERR ，和4.17微克的pCCL.SFFV.eGFP ，共计12.5微克DNA的，向管1（相当于2:1:1.5 质粒比例，用于可扩展的生产）。
在管 2 中制备转染混合物，如表1所示。

表1 。瞬时转染混合物。

试剂

μ l /10 cm板

基因果汁

30

的OptiMEM ®

470

使用移液器混合GeneJuice / OptiMEM ®转染混合物，并在室温下孵育 5 分钟。
P ipette500μl的转染混合物的入含有质粒构建体管（管1），轻轻混匀溶液5使用相同的移液管倍，避免形成气泡。
在室温下孵育溶液 15 分钟。
P ipette的DNA / GeneJuice转/ OptiMEM中以逐滴方式溶液到HEK293T / 17细胞在整个板的总表面。
地方板在37培养箱℃，5％CO 2 16 - 18小时。

第 4 天：媒体变化

Ç arefully从板除去培养基16 - 18小时后转染。
小号低一个DD7毫升新鲜的补充有2培养介质2mM L-谷氨酰胺和10％FCS吹打媒体到所述板的一侧，以细胞的避免脱离。
地方板放回培养箱中在37℃，5％CO 2 16 - 18小时。

第 5 天：病毒上清液收获

收获的包含病毒的上清液的慢病毒载体假型与SARS-CoV的-2-S （D614G）ΔERR入15ml ˚F爱尔康先前由要么将其放置在冰箱中或上10分钟，湿冰上冷却。
以 400 × g离心5 分钟以去除细胞碎片。
用0.45 µm 微滤澄清病毒上清液，以去除病毒聚集体。
为避免多次冻融循环，将病毒上清液分装到 0.2 - 0.5 ml 无菌 1.5 ml 带螺旋盖微量离心管中。
以后使用时，使用干冰和乙醇快速冷冻小瓶，然后将它们储存在-80°C。
如需立即使用，请将小瓶储存在冰上直至需要。

通过感染性测定法进行 Spike-LV 滴定
第一天：

接种允许细胞在一个24孔板：
预暖含有10％FCS，1％IMDM的GlutaMAX ，和1微克/毫升嘌呤霉素。这将被称为培养基。
收获稳定的 HEK293T/17-hACE2+TMPRSS2+细胞先前解冻并培养至少两代（解冻后第一代加入1 µg/ml 嘌呤霉素）（图 S1）如下：
取出并丢弃细胞上清液。
通过移液 5 ml PBS 轻轻清洗细胞以去除任何多余的培养基。
将 3 ml基于无酶 PBS的细胞解离缓冲液添加到烧瓶中并孵育 5 分钟。
轻轻敲击烧瓶的两侧，促使细胞脱离。
添加7毫升培养介质烧瓶中，将收集的细胞，在与吸液管到一个新˚F爱尔康。
以 400 × g离心5 分钟。
丢弃上清液并用手指轻弹F alcon 以轻轻去除细胞沉淀。
加入 5 ml 培养基重悬细胞。
确定细胞密度：
1)将 1:6 - 1:8 的重悬细胞以1:6 - 1:8 的比例接种到一个新的 T75 烧瓶中，该培养瓶含有 9 ml 培养基，推荐的最小接种量为3.3 × 10 4细胞/cm 2 。

2）进到小号TEP 1下滴定细胞接种。

确定使用的细胞密度的自动细胞分析仪NucleoCounter中® NC-250 TM 。
以5.0 × 10 4细胞/毫升重悬细胞，每份病毒载体上清液为 8 毫升，待滴定定量。
将 0.88 µl/ml 的聚凝胺添加到重悬细胞中；的每个孔最终体积将为1.1毫升，导致8:1的最终浓度微克/毫升的p olybrene。
混合的重悬细胞与板1毫升/孔在总共7个孔中（6口井矢量感染和一个井为一无矢量控制）。
向剩余的空孔中加入 1 ml PBS。
准备用于感染许可细胞的 Spike LV 稀释液：
如果使用冷冻的 Spike-LV，请在 37 °C 的水浴中解冻并立即使用。如果使用放置在冰上的新鲜 Spike-LV，通过移液几次混合病毒载体，避免形成气泡。
在 V 型底 96 孔板中，在预冷培养基中制备以下 1:4 连续稀释的 Spike-LV六点：
移液管将200μl穗-LV成一个孔在V形底板（例如，A1孔）。
吸移管150微升预冷的完整IMDM到5中V底板每隔其它公（例如，瓦特ELL小号A3，A5，A7，A9 ，和A11 ）。
提示：使用在平板上每其它公允许96孔板中，并使用多通道移液器24孔板之间移动（参见图1 ）。

图1 。在 96 孔板和 24 孔板之间转移

将 50 µl 从含有 Spike-LV 的第一个孔 (A1) 移入后续孔 (A3)。
与混合轻轻一吸10次，是小心，以避免形成气泡。
移动到第三阱（A5），然后继续连续稀释直至达到6个孔（A11）。
使用多通道与每个其他尖端占用，吸移管100 μ升载体稀释到在24孔板已镀每个孔的HEK293T / 17-hACE2 + TMPRSS2 +细胞（图1 ）。
将平板以 1 , 000 × g离心20 分钟，以通过接种来增强转导。
将板放回37°C的孵化器中，5% CO 2 72 小时。

第 3 天：确定转导效率和滴度计算

如果正确的风险评估到位，将24 孔板轻弹到实验室盒中，然后可以对其进行消毒或实验室水槽，从而丢弃培养基。在纸上吸干盘子以除去多余的液体。
加入200 μ升/孔的细胞解离缓冲液和孵育10分钟。
轻轻敲击板以分离细胞。
添加400 μ升的PBS /孔，将细胞重悬，通过移液，并收获200 μ升成一个新的V形底96孔板中。
提示：ü唱盘上的每个其它公允许96孔板中，并使用多通道的24孔板之间移动吸管（图1 ）。

将板以 400 × g离心5 分钟。
以适当的方式（参见步骤 1 ）快速轻弹平板，弃去上清液，然后在纸上吸干以除去多余的液体。
加入250 μ升在400 PBS /孔和离心机板×克5分钟。
同时，为 Fixable Viability Dye eFluor TM 780（0.1 µl + 99.9 µl PBS/孔）准备主混合物。
以适当的方式（参见步骤 1 ）快速轻弹平板，弃去上清液，然后在纸上吸干以除去多余的液体。
在 100 µl/孔染色主混合物中重悬细胞。
在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。
添加150 μ升在400 PBS /孔和离心机板×克5分钟。
丢弃PBS，印迹板，和重悬的细胞在50 μ升PBS的使用P 200个尖端。
使用以下带通滤波器在流式细胞仪上获取平板：
RL2 780/60 用于可固定活力染料eFluor TM 780。
BL1六十○分之五百三转导的荧光标记，eGFP的。
注：如果该用户不熟悉细胞的流式细胞仪分析，这是ADVI黑貂是一个训练有素的流式细胞仪操作员协助小号从这一步起。

数据分析

FlowJo分析
识别门控策略的百分比的eGFP阳性的人口中被描绘

图2 A，开始的活细胞栅极，随后由前向与侧散射栅，和所述单峰鉴定。然后单峰被绘制为直方图，以确定的百分比的eGFP阳性细胞（图2 B）。

确定每个孔中转导细胞的百分比
当计算滴度，仅转导效率的小于20％的转导的细胞应予以考虑。此方法假定每个单元进行一次积分。使用 >20% 的风险对具有多个整合位点的细胞进行计数，从而导致对滴度的低估。0.5% 和 20% 之间的转导效率用于比较包含水疱性口炎病毒糖蛋白 (VSV-G) 的对照 LV 和使用 CoV-2 S ΔERR假型化的LV 之间的载体生产，有或没有普遍的 D614G 突变。的D614G突变被发现约60％（以增加效价图2 C）。滴定计算作为示例列于表1中。

图2 。在稳定的 HEK293T/17 - hACE2+TMPRSS2+上对假型慢病毒载体进行流式细胞术分析。(A) 门控策略从活细胞 (eF780) 与 FSC-A 开始以识别活细胞，然后是 SSC-A 与 FSC-A 以识别 HEK293T/17 细胞，以及SSC-W 与 FSC-A以识别单线态鉴别。（B）瞬时产生VSV-G LV，S ΔERR COV-2 LV ，和S （D614G）ΔERR COV-2 LV被连续从100μl的在4倍稀释为稀释6点和上控制HEKT293T / 17细胞中加入（蓝色群体）和 CoV-2 S 允许的 HEK293T/17-hACE2+TMPRSS2+ 细胞（红色群体）在 8 µg/ml 聚凝胺存在下。呈现了转导群体的交错直方图。(C) 图表示通过对 HEK293T/17 和 HEK293T/17-hACE2+TMPRSS2 细胞的感染性测定量化的三种假型糖蛋白的病毒滴度。提供的数据是重复测定的±SD 。

使用以下公式计算功能滴度作为每毫升感染单位 ( IU / ml)：

注意：要获得更准确的滴度，请取多次稀释的平均值。

表2 。慢病毒载体滴度的计算。慢病毒载体的病毒滴度计算假用VSV-G，COV-2 S ΔERR LV ，和COV-2 S （D614G）ΔERR感染在两个HEK293T / 17细胞和HEK293T / 17-hACE2 + TMPRSS2 +细胞。高于2 0 % 和低于 0.5% 的转导效率以灰色字体突出显示，并从滴度计算中省略。平均滴度来自重复测定。

HEK293T/ 17-hACE2+ TMPRSS2+

HEK293T/17

向量 (µ l )

VSV-G

CoV-2 S ΔERR

CoV-2 S (D614G)ΔERR

VSV-G

CoV-2 S ΔERR

CoV-2 S (D614G)ΔERR

n=1

n=2

n=1

n=2

n=1

n=2

n=1

n=2

n=1

n=2

n=1

n=2

100

98.7

98.5

50.3

53.2

68.3

66.1

95.7

95.3

0.08

0.031

0.16

0.19

25

93.8

94.9

22

27.1

44.7

40.4

86.8

86.8

0.035

0.025

0.051

0.06

6.25

0

66.2

8.34

11

22.8

18.4

60.5

61.5

0.0088

0.00862

0.00861

0.00871

1.5625

28.2

27.5

2.44

3.36

8.71

6.24

29.4

28.3

0

0

0

0.035

0.390625

8.38

8.47

0.96

0.9

2.58

2.23

11

9.26

0

0

0

0

0.09765625

1.69

2.36

0.29

0.27

0.86

0.74

2.9

2.79

0.00845

0

0

0

单位/毫升

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6.67

E+05

8.80

E+05

1.82

——

1.47

E+06

——

——

——

——

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——

——

——

7.81

E+05

1.08

E+06

2.79

E+06

2.00

E+06

——

——

——

——

——

——

1.07

E+07

1.08

E+07

1.23

E+06

1.15

E+06

3.30

E+06

2.85

E+06

1.41

E+07

1.19

E+07

——

——

——

——

8.65

E+06

1.21

E+07

——

——

——

——

1.48

E+07

1.43

E+07

——

——

——

——

平均滴度 (IU/ml) n=2

9.69

E+06

1.15

E+07

8.92

E+05

1.04

E+06

3 . 05

E+06

2.11

E+06

1.45

E+07

1.31

E+07

——

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——

——

致谢

作者承认奈杰尔博士Temperton （药学梅德韦学院，肯特大学）为的pCDNA-SARS-COV-2-穗质粒表达的全长密码子优化的刺突蛋白。EM乙是由联盟流行病防备创新（CEPI）的资助。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

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