材料和试剂

1. 96孔板

2. 6孔板

3. 12/24孔板

4. 家用硅胶底冰塑托盘

5. 茶塑料滤网的尼龙网

6. 塑料移液管（Biologix，目录号：30-0138）

7. 赛多利斯MLINE ^®机械百得移液器2,20，200和1000 μ升

8. 六孔、二十四孔和九十六孔多培养皿（DeltaLab，目录号分别为：657160、662160 和 655180）

9. 定制过滤器

10.灌注室

11.圆底透明（玻璃或聚丙烯）圆柱形试管

12.传统的 21 号 (21 G) 注射器针头

13.BD Intramedic ^TM聚乙烯管，100 ft × 0.034" × 0.050"（Becton Dickinson，目录号：427421）

14.显微镜载玻片（Deltalab，目录号：D 100001）

15.显微镜玻璃盖玻片（Deltalab，目录号：D 102440）和 N1.5（Knittel Glass，目录号：VM52440Y1A0.1）

16.铝箔

17.吸水纸

18.胶带

19.永久性记号笔

20.细头画笔

21.指甲油

22. 来自 P06-P90 雄性和雌性小鼠的海马和皮质切片（300-400 µM 厚）[ C57BL/6 背景上的小家鼠（杰克逊实验室，RRID：IMSR_JAX：000664）] 和褐家鼠[Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) , 菌株代码 400)]

23. MilliQ-水或双蒸水 (ddH ₂O)

24. 喹啉，4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio) 丙基]-，二碘化物/157199-63-8 或 TO-PRO ^TM- 3 碘化物642/661 （Life Thermo Fisher Scientific，目录号：T3605 ）

25. Neurotrace ^TM500/525 Green Fluorescent Nissl（Life Thermo Fisher Scientific，目录号：N21480）

26. 聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4832）

27. Lycopersicon Esculentum（番茄）凝集素 DyLight 488（LEL-DyLight 488）（Life Thermo Fisher Scientific，目录号：L32470）

28. 与异硫氰酸荧光素（FITC-ISOB4）缀合的异凝集素 B4（Sigma-Aldrich，目录号：L2895）

29. 兔抗 GFAP-Cy3 ^TM（Sigma-Aldrich，目录号：C9205）

30. 2-[4-(Aminoiminomethyl) phenyl]-1H-Indole-6-carboximidamide hydrochloride (DAPI) (Sigma-Aldrich，目录号：D09542)

31. Hoechst 33342（Sigma Aldrich ，目录号：23491-45-4）

32. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：048-46-8）

33. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：56-40-6）

34. 甘油或 Fluoromont-G ^TM封固培养基（Life Thermo Fisher Scientific，目录号：00-4958-02）

35. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：7647-14-5）

36. KCl（Sigma-Aldrich，目录号：7447-40-7）

37. NaHCO ₃（Sigma-Aldrich，目录号：S5761 ）

38. NaH ₂PO ₄·H ₂O（Sigma-Aldrich，目录号：10049-21-5）

39. Na ₂HPO ₄·H ₂O （Sigma-Aldrich，目录号：S9763 ）

40. KH ₂PO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：P0662 ）

41. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5767）

42. MgSO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）

43. CaCl ₂·2H ₂O（Sigma-Aldrich，目录号：C3881）

44. 多聚甲醛粉末（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：158127 ）

45. 氢氧化钠和盐酸

46. 人工脑脊液溶液（ACSF）（见食谱）

47. 阻塞/通透溶液（见配方）

48. 抗体稀释溶液（见配方）

49. 修复溶液（见配方）

50. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）

51. PBST（见食谱）

设备

1. 气罐 5% CO ₂, 95% O ₂

2. 数字pH计（ORION，型号：410A）

3. 数字分析天平 (RadWag, AS82/220.R2)

4. Thermolyne 16700 型混合器 Maxi-Mix1 涡流混合器

5. TS-2000A VDRL摇床

6. 通风柜 1300 系列 A2 II 类，A2 型生物安全柜

7. T hermo Scientific ^TMCimarec ^TM基本搅拌加热板 SP13132033 (ThermoFisher Scientific)

8. 共聚焦激光扫描显微镜（Leica TCS SP5 TANDEM SCANNER）配备：

a. 带紫外线校正的 40 倍油浸物镜 Leica NA 1,3。

b. 405 nm 二极管激光器、488 nm 氩气激光器发射和 543 nm 和 633 nm 发射的 HeNe 激光器。

9. 盖玻片夹室（ALA Scientific Instruments Inc.）

10. HCT-10 温度控制器（ALA Scientific Instruments Inc.）

11. 蠕动泵（Scientific Industries Inc.，型号 203）

12. 冰箱和冰柜

13. 恒温水浴

软件

1. 图像采集和存储系统（LAS AF Lite 软件）

2. 图像分析软件（斐济，ImageJ 1.53c 版）

3. 照片编辑软件（Adobe Photoshop CS6 13.0 × 64 和 Adobe Illustrator CS6 16.0.0）

程序

在开始之前，从小鼠身上获取急性皮层和海马切片（300 µm 厚），并让它们在储存室中稳定 45 分钟，该储存室放置在浸没在 ACSF 中的尼龙网上，与 95% O ₂和 5% CO ₂平衡，在室温（室温：22°C-25°C）。从啮齿动物制备急性大脑和海马切片的详细协议可以在其他地方找到（Lein等人，2011；Pannasch等人，2012；Mishra等人，2014；Papouin 和Haydon，2018）。

注意：要获得高质量的切片，请注意以下建议：（1）在确认动物死亡后迅速取出大脑，（2）使用冷冻材料（室、盘、仪器）并将组织浸入冰冷的 ACSF carbogenated在整个解剖和切片过程中使用 95% O ₂和 5% CO ₂，并且 (3) 每个大脑使用一个新鲜的剃须刀片以防止组织变形。

A. 用脑切片中的凝集素标记血管和周细胞

要同时识别凝集素标记的血管和 TO-PRO-3 标记的周细胞，请按照程序 A 和 B。如果对可视化血管不感兴趣，请继续执行程序 B。

1. 在我们的实验中，我们成功地使用这两种探针中的任何一种来可视化血管壁和周细胞轮廓，(a) 与 DyLight 488 ( LEL-DyLight 488)偶联的番茄凝集素 (Tomato) 凝集素或 (b)与 FITC ( FITC )偶联的IsolectinB ₄-ISOB ₄)。通过在碳化 ACSF 中溶解 (a) LEL-DyLight 488以产生 10 μg/ml 最终浓度或 (b) FITC-ISOB ₄在碳化ACSF 中以产生 5-10 μg/ml 最终浓度来制备染料溶液。在避光的恒温水浴中预热 (35°C-37°C) 染料溶液。

笔记：

a. 凝集素与内皮和周细胞基底膜中的糖缀合物残基结合（Peters 和 Goldstein，1979；Laitinen，1987；Mishra 等，2014）。

b. 使用前涡旋原液。

c. 使用新鲜制备的染料溶液。

2. 用塑料移液器 (图 1A) 将急性切片从储存室转移到一个空的圆柱形透明管，该管配有细尖管用于气体输送 (95% O ₂和 5% CO ₂) (图 1B)。使用1,000 µl 移液器，将 ACSF 从管中拉出。将切片放在底部，并立即将最少 1 毫升的预热染料溶液加入管中（视频 1）。

笔记：

a. 使用细尖塑料移液器运输海马切片和用于皮质切片的改良转移移液器（无尖端）（见图 1A）。

b. 在一根管子中容纳至少 6-10 个海马切片或 3-4 个皮质切片。

c. 所描述的程序减少了稀释少量染料溶液的机会。

图 1.转移移液器和染料加载管。

A. 用于转移海马 (a) 或皮质 (b 和 c) 急性切片的塑料移液管 (3 ml)。(a) 中移液管的长度为 16 厘米。在 (b) 和 (c) 中，塑料移液管的细尖已被切割并移除，以防止在皮质切片通过期间损坏皮质切片。B. 圆底染料加载管，带有用于气体输送的细管。

视频 1. 切片传输过程

3. 转移切片后，将装有切片的染料加载管放入恒温水浴（35℃-37°C）。保持切片在染色溶液中孵育 95% O ₂和 5% CO ₂30 分钟在黑暗中。

注意：保持气体管的细尖尽可能远离加载管的底部，以防止气泡干扰切片（见视频 1）。

4. 30 分钟后，用 1,000 μl 移液器从管中取出染料溶液，同时将切片保留在底部。迅速，将至少 1 ml 的正常 ACSF 添加到管中以冲洗切片 15 分钟。

笔记：

a. 冲洗切片将停止标记并减少背景。

b. 在冲洗期间和之后，保护切片免受光照。

B. 用 TO-PRO-3 在脑切片中鉴定周细胞

1. 准备染料加载和冲洗室。为此，用 10 毫升的 ACSF 填充两个腔室，并在浸没切片之前用 95% O ₂和 5% CO ₂泡溶液至少 20 分钟。加10μl 将 TO-PRO-3 原液加入染料加载室，最终浓度为 1 μM。用铝箔保护溶液免受光照。将一个小过滤器放入一个连续的房间 (图 2a-2b)。

笔记：

a. 6 孔板的孔可用作足够的染料加载和冲洗室，如图 2 所示。

b. 一个大小合适的自制小过滤器可以放入井中，允许在整个过程中同时运输所有切片，并用碳化 ACSF 交换两个切片表面（图2 ）。要构建过滤器，请按照图 3 中描述的程序进行操作。

c. 将录音室和冲洗室并排放置，以促进室间切片的快速转移（图 2）。

d. 操作 TO-PRO-3 时，请戴上乳胶或丁腈手套以保护自己。

e. 使用前涡旋 TO-PRO-3 的储备瓶。

f. 使用每天新鲜配制的染料溶液。

g. 搅拌染料加载室，将染料溶解到 ACSF 中，直到稀释变得均匀。

h. 如果要装载大量动物的切片，准备一个额外的装载室会很方便。在我们手中，可以使用相同的染料溶液两次（每次最多 20 个海马切片）。

图 2. 在急性海马切片中用 TO-PRO-3 加载周细胞的分步程序。

(a, a´)在六孔板 (12 × 8 cms) 的两口井中加入 10 ml ACSF，并通过细管将溶液中的 95% O ₂和 5% CO ₂鼓泡。将一个小过滤器放入空井中。(b, b´) 将一定体积 (10 μl) 的 TO-PRO-3 原液加入染料装载室并搅拌以促进染料溶解。(c, c´) 用移液管拿起脑切片并将它们倒在过滤器的顶部（移液管中包含的 ACSF 将落入空室，而网状物将保留切片）。快速孵化将切片带入染料加载室的过滤器。(d, d´) 在 20 分钟的染料加载期后，将装有 TO-PRO-3 切片的过滤器转移到冲洗室中 15 分钟。在整个过程中，用铝箔保持切片和溶液避光。图片 (ad) 中白色矩形内的字段已放大 (2.4 倍)，如下所示（a´、b´、c´ 和d´）。此后，带有 TO-PRO-3 加载周细胞的急性切片可以固定或用于活体实验（例如，电生理记录或钙动力学分析）。

图 3. 构建一个定制的过滤器来保存和转移急性脑切片。

(a) 将一口井与塑料冰盘隔离，并保留井周围的边缘。(b) 移除底部孔。请注意，过滤器的最终高度超过 1.3 厘米（如 f 所示）。(c) 切一块圆形尼龙网，确保网孔直径适合井径。用硅胶密封剂将网格的边界粘在井孔的外边界上。(d)在使用前让过滤器干燥 24 小时并用 ddH ₂O冲洗。(e 和 f)。将过滤器引入 6 孔板，并检查网格是否允许 ACSF 轻松通过。

2. 从管中或用塑料吸管（图 1）从储存室中取出急性切片，并将它们放在小过滤器的尼龙网上，让 ACSF 落入空井中。在黑暗中的 RT 中快速将携带切片的过滤器引入加载室 20 分钟（图 2c）。

笔记：

a. 用过滤器而不是塑料吸管转移切片将防止稀释加载室中的染料溶液。

b. 在染料加载和加载后期间，用铝箔保护切片和溶液免受光照。

3. 在 TO-PRO-3 的潜伏期之后，将携带切片的过滤器从装载室转移到冲洗室 15 分钟（图 2d）。

笔记：

a. 冲洗切片将阻止染料掺入细胞，减少背景标记并防止非特异性摄取。

b. 由于TO-PRO-3 探针显示出对 DNA 的高亲和力（Suzuki 等，1997），一旦与核酸结合，染料预计不会渗漏通过膜并留在细胞内。

4. 在冲洗期之后，如果 TO-PRO-3 加载的切片用于活体实验（例如，电生理记录或钙动力学分析），则在 RT中用Hoechst 33342（学联中的 0.5 µM）复染10 分钟。

5. 要使用固定切片，请将 TO-PRO-3 加载的切片浸入固定溶液中 40 分钟，在室温下轻微晃动。在 PBS 中冲洗固定切片两次，每次冲洗 5-10 分钟。

注意：不要使用与固定组织接触的材料（腔室、管、移液管、管道和仪器）来操作活组织。

6. 用 DAPI（在 PBST 中为 1-5 µM）或Hoechst 33342（在 PBST 中为 0.5 µM）复染 10 分钟，在室温下轻轻摇动。在 PBS 中冲洗固定切片，1-2 次，每次 5-10 分钟。

笔记：

a. 使用 DAPI 或 Hoechst 33342 标记固定切片中的 DNA，使用 Hoechst 33342 对急性切片中的细胞核进行复染；Hoechst 33342 对活细胞相对无毒且不会致突变（Durand 和 Olive，1982）。

b. 用DAPI 或Hoechst 33342 复染有利于参考海马中的切片结构。

c. 对于步骤 B5 和 B6，使用 12/24 孔板很方便。

d. 固定切片可以在 4°C 下储存在 PBS 中，在安装前避光 24-48 小时。

7. 要安装固定切片，请用细尖画笔从井中拾取切片，然后将它们放在显微镜载玻片上。用吸水纸除去多余的 PBS 或在 37°C 下孵育载玻片 5 分钟使其干燥。添加一滴安装溶液（甘油或 Fluoromont-G ^TM安装介质）以覆盖切片。轻轻地在安装介质上盖上盖玻片，避免产生气泡，并通过在盖玻片的边缘涂上指甲油来密封盖玻片。在使用共聚焦激光扫描显微镜进行分析之前，将载玻片在 4°C 下在黑暗中存放至少 24 小时。

笔记：

a. 在拍照前等待一夜可以减少光漂白。

b. 在我们手中，在 4°C 下避光保存的已镶嵌切片可将周细胞中明亮的 TO-PRO-3 染色保留至少 1-1.5 个月（Mai-Morente 等人，2021 年）。

图 4 和图 5 说明了固定海马切片中来自啮齿动物的 TO-PRO-3 标记周细胞的代表性示例。图 5 显示了与凝集素染色的血管相邻的 TO-PRO-3 染色的周细胞。

图 4. 小鼠海马体固定切片中 TO-PRO-3 标记的周细胞。

A. 小鼠海马体的共聚焦图像说明了具有 TO-PRO-3 染色周细胞的辐射层的荧光场 (a) 和同一场 (a´) 的倒置荧光版本。(a) 中白色矩形内的区域已放大，如下所示。注意明亮的纺锤形 TOPRO-3 胞体是纵向过程的起源。(a´) 中的倒置图像证明了用荧光团标记的周细胞延长。每个图像代表 40 只小鼠的海马体。B. 荧光图像说明了在大鼠海马中用 TO-PRO-3 标记的周细胞。白色矩形内的周细胞已被放大，以促进 TO-PRO-3 染色的延长线的可视化。每个图像代表 10 只大鼠的海马体。在所有图像中，TO-PRO-3 荧光呈绿色伪色。

图 5. TO-PRO-3-周细胞体细胞勾勒出脑微血管系统。

A. 荧光显微照片说明了与番茄凝集素标记的血管系统相关的小鼠大脑皮层中 TO-PRO-3 标记的周细胞。该图像代表五只小鼠。B.不同的荧光视图的小鼠海马（A; B，B'; c）示出TO-PRO-3标记的周细胞和同工凝集素乙₄（FITC-ISOB ₄）-marked周细胞和血管。(b´) 中的图片代表与 (b) 相同的字段，其中 TO-PRO-3 视图已合并。FITC-ISOB ₄探针染色内皮和周细胞的基底膜。请注意 ISOB ₄标记塑造 (b) 中 TO-PRO-3 标记的胞体轮廓和描绘 (b´) 中血管壁的 TO-PRO-3 延长线。每个图像代表 10 只小鼠。在所有图像中，TO-PRO-3 荧光呈绿色伪色，番茄凝集素和 ISOB ₄的荧光呈红色伪色。

C. 脑切片中星形胶质细胞和周细胞的鉴定

要同时识别周细胞和星形胶质细胞，请遵循程序 B 和 C。要包括血管识别，请遵循程序 A、B 和 C。

1. 将预先装有 TO-PRO-3 的固定切片浸入封闭/透化溶液中，在黑暗中在 RT 中搅拌 2 小时。

笔记：

a. 要执行此步骤，可以使用 12/24 孔板。

b. 封闭/透化溶液和抗体和固定溶液是新鲜制备的。根据我们的经验，这些溶液可以在 4°C 下储存一周。

c. 在抗体应用之前，封闭/透化溶液会封闭非特异性位点并透化细胞膜。

2. 在 PBST 中洗涤切片 3 次，每次 5-10 分钟，轻轻摇晃。用铝箔保护切片免受光照。

3. 在稀释溶液中孵育切片，用于抗体与 Cy3（1:400）结合的初级抗体抗 GFAP，在 RT 温和搅拌下孵育 2 小时，并避光。

笔记：

a. 使用 96 孔板在抗体溶液中孵育海马切片以保存抗体。抗体溶液的体积应足以覆盖切片（最少 200 µl）。

b. 使用细尖画笔将切片转移到孔中或从中取出。

4. 在 PBST 中冲洗切片 3 次，每次搅拌 10 分钟并避光。

5. 用 DAPI（在 PBST 中为 1-5 µM）或Hoechst 33342 （在 PBST 中为 0.5 µM）在温和搅拌下处理切片 10 分钟，然后用 PBST 再次冲洗。

注意：在步骤 C4 和 C5 中，可以使用 12/24 孔板。

6. 要安装切片，请遵循步骤 B7 中详述的准则。在使用共聚焦激光扫描显微镜进行分析之前，将载玻片在 4°C 下在黑暗中存放至少 24 小时。

图 6 说明了具有 TO-PRO-3 染色的周细胞和 GFAP 标记的星形胶质细胞的小鼠海马体的不同区域。周细胞胞体和星形胶质细胞端足之间的密切关系得到了证明。还显示了 TO-PRO-3 染色的周细胞、GFAP 阳性星形胶质细胞和 IsoB4 标记血管的三重标记（图 6D）。

图 6. TO-PRO-3 染色的周细胞是胶质血管单元的组成部分。

(A) (a, a´)小鼠海马场（辐射层）的荧光视图说明了 TO-PRO-3 标记的周细胞和 GFAP 标记的星形胶质细胞 (a)。该场的倒置荧光版本显示在 (a´) 中。用 DAPI 染色的细胞核已叠加。(B)和(C) (a, a´)小鼠海马体的照片说明了 GFAP 染色的星形胶质细胞足突和 TO-PRO-3 标记的周细胞体之间的密切关系。(a) 中显示的场的倒置荧光版本显示在 (a´) 中。(B) 中白框内的区域已被放大以证明周细胞和星形胶质细胞足突之间的关系。图像代表六只小鼠的海马体。(D) （相同区域 a, a´）荧光图像显示了 TO-PRO-3 标记的周细胞体细胞排列在海马体的血管内，GFAP 染色的星形胶质细胞延长线到达脉管系统和周细胞体。血管内皮的基底层已被 ISOB ₄染色。图像代表 10 只小鼠的海马体。在所有图像中，TO-PRO-3 荧光呈绿色伪色，ISOB ₄荧光呈红色伪色。

笔记：

a. 如果需要，可以在 TO-PRO-3 切片中进行额外的免疫染色（例如，小胶质细胞或神经元标记）（Mai-Morente 等，2021）。

b. 在拍照前等待一夜可以减少光漂白。

c. 或者，来自转基因 hGFAP-eGFP 小鼠（Nolte 等，2001）的切片可以轻松识别星形胶质细胞，可以按照 B 项中描述的程序对急性或固定切片中的星形胶质细胞和周细胞进行同时染色。

D. 使用 TO-PRO-3 和 NeuroTrace 500/525 在急性切片中识别周细胞

1. 重复步骤 B1 到 B3 中描述的程序，但除了 TO-PRO-3 外，将 NeuroTrace 500/525 (NeuroTr)（原液的 1:50 至 1:500 稀释）应用到装载室中，以对周细胞进行双重标记（ NeuroTr/TO-PRO-3)。对于使用 NeuroTr 进行独家染色，只需将此探针稀释到加载室中即可。

笔记：

a. 根据您的制备调整 NeuroTr 的最佳稀释度。

b. 至于 TO-PRO-3，在使用前涡旋 NeuroTr 的原液，制备新鲜的染料溶液，并在加载和加载后期间保护溶液和切片免受光照。

c. 为了同时识别带有 NeuroTr 的周细胞体和带有凝集素的血管，使用与 FITC、Alexa 488 或 DyLight 488 以外的荧光团缀合的市售凝集素，以防止这些荧光团和 NeuroTr 之间的光谱重叠。

d. NeuroTrace 500/525 最近被确定为体内（Damisah 等人，2017 年）和离体（Mai-Morente 等人，2021 年）的周细胞标记物。

2. 如果需要，通过在含有Hoechst 33342（0.5 µM 最终浓度）的carbogenated （95% O ₂和 5% CO ₂）ASCF 中在 RT 中孵育急性切片来复染细胞核15 分钟。在 RT 中在碳化 ASCF 中洗涤一次 10 分钟。漂洗期后，加载染料的活切片即可用于活体实验。

图 7 显示了用 NeuroTr 和 TO-PRO-3 共染色的活周细胞，这些细胞与小鼠海马急性切片中的血管相邻。

图 7. TO-PRO-3 标记小鼠海马急性切片中的活周细胞。

(aa´´´)小鼠海马体的同一区域显示了用 TO-PRO-3 (a) 和 NeuroTrace 500/525 (a´) 鉴定的活周细胞；两种染料和 Hoechst 33342 的共定位显示在（a´´´）中，其中明场视图已合并到荧光图像。白框内的周细胞已被放大。在 (a´´´) 中，周细胞位于微血管附近；放大框内的星号表示血液蓄积。注意血管壁周围的 TO-PRO-3 染色延长线。图像代表 15 只小鼠的海马体。TO-PRO-3 荧光呈绿色伪色，而 NeuroTr 的荧光呈红色伪色。

笔记：

a. 使用Hoechst 33342 复染可以参考海马体中的切片结构。

b. 除了 NeuroTr 标记的周细胞外，还可以使用荧光染料 sulforhodamine 101 (SR101；Exc. 586/Em. 605) 对活的星形胶质细胞进行成像，这可以在体内和体外对神经胶质细胞进行染色（Nimmerjahn 等人，2004 年； Nimmerjahn 和 Helmchen，2012 年；Kafitz 等人，2008 年）。或者，为了同时标记活体切片中的周细胞和星形胶质细胞，可以将来自转基因 hGFAP-eGFP 小鼠的切片（允许星形胶质细胞形态的详细可视化（Nolte 等，2001）加载到 TO-PRO-3）。请注意，相同的激光可以显示加载 NeuroTr 500/525 的周细胞和 hGFAP-eGFP 星形胶质细胞；因此，NeuroTr 不适合识别源自转基因 eGFP 小鼠的急性切片中的周细胞。

E. 图像采集

1. 对于固定制剂，将装有 TO-PRO-3 的海马切片的显微镜载玻片安装到共聚焦显微镜（Leica SP5 TANDEM SCANNER）的载物台上。用 40 倍油浸物镜观察标记的细胞。使用连接到成像 LAS AF Lite 软件的数码相机在数据采集模式“xyz”下捕获图像和 z 堆栈，采集速度为 400 Hz（即400 线/秒），图像分辨率为 1,024 × 1,024 像素和值“线平均”等于 2 以减少噪音。在 UV 下，选择感兴趣的领域并聚焦正在研究的区域。然后，切换到 He-Ne 633 nm 滤光片并调整检测系统中的“增益和偏移”参数以优化 TO-PRO-3 的信号强度/噪声比，避免过饱和，以便可以轻松区分明亮的荧光周细胞背景和其他单元格。切换到 488 nm 和 543 nm 通道，分别可视化凝集素染色的血管和 GFAP 标记的星形胶质细胞，并设置显微镜参数值。确定 z 堆栈大小并设置 z 堆栈步骤的“开始”和“结束”值。在离切片表面 > 15-20 µm 的距离处拍摄图像，因为在切片过程中，由于膜损伤，表面区域存在受损细胞和反应性星形胶质细胞（Takano等，2014）。这些如图 8 所示。

图 8. 距切片表面不同距离处星形胶质细胞的反应性梯度。

显示了从切片表面在 12 µm (a, a´)、10 µm (b, b´) 和 8 µm (c, c´) 处获得的小鼠海马的荧光照片；请注意切片最外层区域的 GFAP上调，表明反应性星形胶质细胞增生。字段（a、b 和 c）与已合并 DAPI 荧光的字段（分别为 a´、b´ 和 c´）相同。图像代表七只小鼠的海马体。在所有图像中，TO-PRO-3 荧光呈绿色伪色。

2. 对于急性切片，在设置灌注系统后，将一两个切片转移到记录室的底部。将灌注室安装到共聚焦显微镜的舞台上，并用 95% O ₂和 5% CO ₂以 1 ml/min平衡的 ACSF 灌注。保持流速稳定，并使用加热系统将 ACSF 的温度设置在 34-37°C。图 9 显示了用于从用 TO-PRO-3 和 NeuroTr 染色的急性切片对大脑周细胞进行成像的设置。在UV下，选择工作区域；此后切换到 488 nm 和 633 nm 激光以使用 NeuroTr 和 TO-PRO-3 对染色的周细胞进行成像。为了减少褪色，在延时实验中，以 512 x 512 像素分辨率和 800 Hz 获取图像。变焦时，应优化激光增益和曝光时间以减少褪色。

笔记：

a. 在海马中，DAPI/Hoechst 33342 染色细胞核的解剖分离有助于识别不同区域（CA1、CA2 和 CA3 层、东方层、放射层和齿状回）。

b. 尽量减少活切片暴露在紫外线下以排除光毒性（Suseela 等人，2018 年）。

c. 正如我们小组报道的那样，在健康切片中，周细胞的 TO-PRO-3 标记表现出出色的信噪比；活周细胞对 TO-PRO-3 的结合是由一种主动操作的转运机制介导的，该机制将染料浓缩到周细胞中，导致胞体和延长的明亮标记（Mai-Morente 等，2021）。因此，用 TO-PRO-3 染色有助于在荧光成像过程中识别周细胞形态和位置。根据我们的经验，来自不健康切片的周细胞无法浓缩染料。

d. 灌注室的底部由聚 L-赖氨酸涂层盖玻片 (Nr 1.5) 制成，有助于固定切片。

e. 在我们手中，周细胞中 TO-PRO-3 染色剂的明亮荧光在 PFA 固定切片中非常稳定，对于安装在载玻片上并在 4 °C下暗处储存的切片，可持续长达 1.5 个月。在活切片的延时采集下，TO-PRO-3 荧光比固定切片更不稳定（Mai-Morente 等，2021）。事实上，在急性脑切片的图像采集过程中，NeuroTr 荧光比 TO-PRO-3 荧光更能抵抗光漂白。

f. 在相同距离距离（例如，距切片表面 20 到 50 μm）的条件下工作，因为响应可能取决于通过切片深度的空间梯度传播（Tian 等人，2010 年；Hall 等人） .，2014 年；Mishra 等人，2014 年）。

图 9. 急性脑切片中 TO-PRO-3 标记和 NeuroTrace 标记周细胞的高分辨率成像设置。

(a)用于记录活海马切片中 TO-PRO-3 标记的周细胞的设置的一般概述。(a´) 中的插图说明了用于调节记录室温度的系统加热器。(b) (*) 包含 ACSF 的收件人的详细信息。该溶液由 95% O ₂和 5% CO ₂的混合物平衡，该混合物由 (b´) 中所示的管道输送（管道应引入 ACSF）。(c 和 c´) 没有 (c) 和 (c´) 海马切片的录音室的放大视图。40x 油目标和腔室底部之间的油滴是可见的。腔室底部由聚-L-赖氨酸涂层盖玻片制成，以固定切片。用于 ACSF 流灌注的管道（流入/流出）已被表示。

食谱

注意：使用新鲜制备的溶液。

1. 人工脑脊液 (ACSF)

在 1 L MilliQ-水或 ddH ₂O 中溶解：

7.824 克氯化钠

0.21 克氯化钾

2.476 克碳酸氢钠₃

0.155 克 NaH ₂PO ₄

2.23 克葡萄糖

0.36 克硫酸镁₄

用 95% O ₂和 5% CO ₂泡20 分钟。

添加 0.368 g CaCl ₂并将 pH 值调整为 7.4。

测试渗透压 (300-310 mOsm)。

储存在 4°C。

2. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)

在 1 L MilliQ-水或ddH ₂O 中，稀释：

8 克氯化钠

0.2 克氯化钾

1.44 克Na ₂HPO ₄

0.24 克KH ₂PO ₄

将 pH 值调整为 7.4。

储存在 4°C。

3. 含0.5% Triton X-100 (PBST) 的磷酸盐缓冲盐水

要获得 100 ml PBST，请将 500 μl Triton X-100 添加到 99.5 ml PBS。

储存在 4°C。

4. 封闭/通透溶液

在 PBST 中稀释 2% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.2 M 甘氨酸。

储存在 4°C。

5. 抗体稀释液

在 PBST 中稀释 2% 牛血清白蛋白 (BSA)。

储存在 4°C。

6. 在 PBS 中固定溶液 4% PFA

注意：毒性/安全性。PFA 是一种有毒、腐蚀性、刺激性和致癌性的化合物。为避免皮肤接触和吸入，在操作 PFA 时，请穿戴防护服（例如，手套、面罩和长袍）并在抽气柜下工作。

在 100 ml PBS 中稀释 4 g PFA，在 80°C 下搅拌溶液，使用 NaOH 将 pH 值调至 7.4，然后过滤溶液。

储存在 4°C。

致谢

这项工作由 Proyecto de Investigación y Desarrollo CSIC I+D 2014, ID 48（Comisión Sectorial de Investigación Científica – Universidad de la República Oriental del Uruguay (CSIC-UDELAR) 和 Proyecto de Investigación de Investigación de Investigación de Investigación de Investigación Científica (CSIC-UDELAR) 和 Proyecto de Investigación de Investigación de Investigación de Investigación de Investigación Científica_Fundamental Investigación e Innovación del Ministerio de Educación y Cultura del Cultura del Uruguay (ANII-MEC) to VA. VM 硕士奖学金由 ANII-MEC 资助；SMM 博士奖学金和 JI 和 VC 硕士奖学金由 UDELAR 支持。

描述大脑周细胞、星形胶质细胞和血管标记的协议改编自 Mai-Morente等人。(2021)。作者感谢 Luis Vitureira (Departamento de Fisiología)、Unidad de Reactivos para Biomodelos de Experimentación (URBE)、FUNDACIBA 和来自 Facultad de Medicina - Universidad de la República Oriental del Uruguay 的 Unidad de Microscopía Confocal 提供技术援助。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

实验程序按照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南（NIH Publications No. 8023，1978 年修订）和当地法规（CDC Exp. 4332/99，Diario Oficial No. 25467，2 月 21 日）进行处理/00, Universidad de la República, 乌拉圭)。

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