材料和试剂

表达卵白蛋白的单核细胞增生李斯特菌菌株 DMC 09-082 (LmOVA) 携带红霉素抗性质粒（Foulds等，2002；Ahn等，2016）。

笔记：

病原体安全警告：单核细胞增生李斯特菌是一种兼性厌氧、革兰氏阳性、杆状球杆菌，可引起轻度发热性疾病。疾病表现包括妊娠期李斯特菌病、中枢神经系统（CNS）李斯特菌病、发热性胃肠炎、腺体李斯特菌病、局部李斯特菌病、伤寒李斯特菌病和非典型李斯特菌病。L. monocytogenes 通常被归类为生物安全 2 类生物。在处理单核细胞增生李斯特菌时，应根据官方生物安全法规提前计划个人防护安全措施。请注意，不建议孕妇使用单核细胞增生李斯特菌，因为李斯特菌病会导致胎儿或新生儿的严重疾病。
所有液体都应倒入装有 10% 次氯酸钠或等效抗菌剂的瓶子中。应收集带有潜在传染性材料的一次性塑料器具并在处置前进行高压灭菌。
将细菌储存在液氮中或 -80°C。对于长期储存，将指数生长期的 500 μl 细菌与 500 μl 溶原性肉汤 (LB) 培养基中的 20% 甘油和休克冷冻。
还可以获得表达改变的 OVA 蛋白的重组单核细胞增生李斯特菌菌株，称为改变的肽配体 (APL)，例如 A2、Y3、Q4、T4 和 V4（Zehn等，2009）。

70%乙醇
次氯酸钠（默克，目录号：056142500）
H2-Kb/OVAA257 PE 四聚体（贝勒医学院，https: //www.bcm.edu/research/research-services/atc-core-labs/mhc-tetramer-production ）
抗体（表 1 ）

表 1. 用于 CD8 反应流式细胞分析的抗体

吖啶橙/碘化丙啶染色剂 (LOGOS BIOSYSTEMS INC F23001)
红霉素（Sigma-Aldrich，目录号：E5389，CAS：114-07-8）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021，CAS：50-99-7）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：P5493-1L）
Naïve CD8a + T 细胞分离试剂盒，小鼠（Miltenyi，目录号：130-104-075）
肝素，Gilvasan Pharma 5000 IE/ml (GILVASAN 5000 IE/ml)
OneComp eBeads TM Compensation Beads（Thermo Fisher Scientific，目录号：01-1111-41）
多聚甲醛 (PFA)
LB-Agar（Lennox）（Carl Roth，目录号：X965.1）
LB-Agar（Lennox），颗粒状，2.5 kg（Carl Roth，目录号：6671.3）
ROTI ® Histofix 4%，500 ml，塑料（Carl Roth，目录号：P087.4）
氯化铵（Carl Roth，目录号：K298.1）
碳酸氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：60339）
EDTA二水合物（Carl Roth ，目录号：X986.2）
溶原性肉汤（LB）培养基（见食谱）
含有红霉素的 LB 琼脂平板（见食谱）
红霉素原液（见配方）
用于培养单核细胞增生李斯特菌原种的葡萄糖添加剂（见配方）
FACS 缓冲液（见配方）
红细胞裂解缓冲液（见配方）
固定缓冲液（见配方）
缓冲液 C（见配方）

动物

成年年龄和性别匹配的 C57BL/6 小鼠

动物程序必须符合国家当局的规定。

一次性塑料材料

2 ml 微量离心管（Sarstedt，目录号：72.691）
FACS 管 12 mm × 75 mm 通用（VWR，目录号：212-0294）
29 G胰岛素注射器0.5 ml（VWR，目录号：BDAM324824）
5 ml注射器（BD Biosciences，目录号：300185）
30 G 针 0.30 × 12 mm（Braun，目录号：1942110120）
15 ml Falcon ®管（BD Biosciences，目录号：352096）
50 ml Falcon ®管（BD Biosciences，目录号：352070）
1,000 μl、200 μl 和 20 μl 移液器吸头（Sarstedt，目录号：70.762.211、70.760.211、70.1114.210）
（可选）一次性接种环
Nunc TM低温管（Thermo Fischer Scientific，目录号：36656）
分光光度计 1.6 ml 半微量比色皿（Greiner Bio-One，目录号：613101）
100 µm 和 70 µm 细胞过滤器（Corning，目录号：352360 和 352350）
预分离过滤器 30 µm（Miltenyi，目录号：130-041-407）
Falcon ® 96 孔圆底板（Corning，目录号：352077）
Luna 细胞计数载玻片（Logos biosystems，目录号：L12002）
细菌传播器，Heathrow Scientific #HD8151（可选：可以使用玻璃传播器和本生灯）
接种环（Fisher Scientific ，目录号：11576863 ）
500 ml 瓶顶真空过滤器（0.22 μ m 孔 33.2cm2 CA 膜，康宁，目录号：430513 ）
培养皿 100 × 15 mm （康宁，目录号：351029 ）

设备

精密天平 (Kern KEPCB60000)
LS 柱（Miltenyi，目录号：130-042-401）
镊子和剪刀
37 °C摇瓶器（IKA KS4000i 控制或同等产品）
分光光度计（IMPLEN OD600 DiluPhotometer TM OD600-10 或同等产品）
计算器
带有紫外线灯的生物安全级别 1 和 2 柜（Thermo Scientific TM Herasafe TM KS，II 级生物安全柜）
37℃孵化器（Memmert CO 2孵化器ICO）
BD FACSCanto TM II 或同等产品（BD Biosciences BD FACSCanto TM II 流式细胞术系统）
精密秤（Kern，货号。KEPCB60000）
涡流混合器（MERCK Stuart TM Scientific SA8 涡流混合器 Z648531）
相当于 ROTINA 420/420 R 的离心机（Hettich TM Swing-out Rotor）
等同于 Eppendorf Centrifuge 5418/5418R 5418R 的离心机
LUNA TM自动细胞计数仪（Logos Biosystems L10001-LG）
1000 µl、200 µl和 20 µl 移液器（Gilson #FA10006M、# FA10005M、# FA10003M）
Miltenyi MidiMACS 起始试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-501）
真空泵（密理博 MPWP6122050）
动物限制器（MERCK，Z756903 带背侧通路的小鼠限制器）

软件

GraphPad Prism 9.01 ( https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ )
Microsoft Excel ( https://www.microsoft.com )
FlowJo 10.7.2 ( https://www.flowjo.com/solutions/flowjo )

程序

LmOVA的制备

笔记：

所有步骤都应在 II 类生物安全柜中执行。在手术前后用紫外线和 70% 乙醇对机柜的所有表面进行消毒。
穿戴个人防护设备，包括实验室外套、手套和安全眼镜。

将装有冷冻细菌的小瓶放在冰上的生物安全 2 级柜中。使用无菌的 200 μl 移液器吸头或一次性接种环，将冷冻细菌涂片涂抹在含有红霉素的 LB 平板上（请参见下面的涂抹动作方案）。更换尖端或接种环，将其拖过第一条条纹，然后将其铺在板的下一个 1/4 处。对次要连续重复此过程。对于每个新的连胜，在开始传播之前，将新的尖端或循环拖过最新的连胜以提高效率。建议将 2-3 个不同小瓶中的细菌传播到单独的 LB 平板上，以确保菌落生长。将板倒置在 37°C（图 2）。

图 2. 实验大纲。

李斯特菌的生长和稀释，程序 A1 和 A3-4。用 LmOVA 对小鼠进行过继转移和感染，程序 B、C、DF。使用 BioRender.com 创建。

24 小时后，应该可以看到单个细菌菌落（如果没有，将细菌再放置 24 小时）。用无菌的 200 μl 移液器吸头挑取一个菌落，在 37°C 的无菌锥形瓶中（培养物的体积不应超过总体积的 20%）在 100 ml LB 培养基 + 红霉素中搅拌。用铝或封口膜盖住烧瓶的盖子，并将其置于 37°C 的烧瓶摇床 (225 rpm) 中过夜（图 2）。
第二天早上，将 100 μl 过夜生长培养物转移到无菌锥形瓶中，该烧瓶中装有新鲜预热的 100 ml LB 培养基 + 红霉素，并置于 37°C 的摇瓶中（225 rpm）。使用分光光度计测定细菌生长时，至少保留 10 ml 新鲜 LB 培养基 + 红霉素用作空白。通过将 1 ml 新鲜 LB 培养基 + 红霉素移液到 1.6 ml 半微量比色皿中并将其设置为空白，然后在新的 1 ml 比色皿中移取 1 ml 细菌生长，然后每 2 小时确定校正的 OD 600测量 OD 600 。当校正的 OD 600对应于细菌呈指数增长的 OD（详情见下文）时，可以通过将细菌放在冰上来停止生长，并且可以准备细菌注射到鼠标中（图 2）。

笔记：

在OD 600在一整天应以试点实验确定以确定OD 600 ，其中细菌在最佳的指数生长期。这可能因分光光度计、LB 培养基、温度等而异。指数细菌生长在校正 OD 600 0.5-1.0 处，细菌通常在 5 小时后达到校正 OD 600 = 0.5（Jones 和 D'Orazio，2013 年；Ahn等，2016）。
细菌生长和空白必须使用同一批LB培养基+红霉素。
从 37°C 摇床中取出装有细菌的烧瓶时，如果未达到最佳校正 OD 600 ，请迅速工作并立即将细菌放回原处。

一旦达到最佳细菌密度，可以使用以下公式计算细菌浓度： [c] = 校正 OD 600 × 11 × 10 8 /ml。

使用 2 ml Eppendorf 管在无菌 PBS 中进行系列稀释，例如，如果初始细菌浓度为 6.6 × 10 8 /ml，则通过将 757.6 μl（对应于 5 × 10 8 个细菌）的细菌溶液添加到 242.4 μl 来制备系列稀释液的 PBS，然后使用 100 μl 到 900 μl PBS 中进行四次连续稀释，以获得 5 × 10 4细菌/ml的最终浓度（图 3）。

注意：初始体积取决于细菌浓度，每次都需要重新计算。确保通过上下移液正确混合，并准备多余的材料作为备用材料。对于小鼠尾静脉注射，将细菌稀释至 5 × 10 4细菌/ml，以便每只小鼠注射 10 4 CFU，总体积为 200 μl（以下程序 C）。

图 3. 细菌系列稀释。

显示了细菌连续稀释的一个具体例子。使用 BioRender.com 创建。

感染小鼠后（参见程序 C），使用剩余细菌的最终稀释液来控制注射材料中的细菌浓度。在 PBS 中以 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 的比例连续稀释细菌，并通过铺展到 LB + 红霉素板上，在技术重复中将每个稀释度的 100 μl 平板。在 37°C 下倒置生长 24 小时（图 2）。
24 小时后，计算菌落数。菌落形成单位 (CFU) 的数量应对应于原始混合物中的5 × 10 4细菌/ml（图 2）；详情见表 2。

笔记：

由于不准确，不应使用具有 >300 个菌落或 <30 个菌落的平板来计算细胞数。
在电镀前彻底混合细菌的连续稀释液。

可通过将 500 μl 处于指数生长期的细菌与溶原性肉汤 (LB) 中的 500 μl 20% 甘油混合来制备用于长期储存的甘油原液，这些甘油来自低温小瓶中的过夜培养物，并储存在 -80°C 或液体中氮。

（可选）OT-I CD8 T 细胞的过继转移

笔记：

如果希望研究抗原特异性 CD8 T 细胞反应的动态，则此步骤是可选的。过继细胞转移应在感染前一天或感染当天进行。
除非另有说明，否则将细胞和试剂置于冰上。

根据与实验小鼠一起工作的适用规则，使用 CO 2 、异氟醚或氯胺酮-赛拉嗪牺牲一只 OT-I 转基因 (CD45.2)小鼠。
将小鼠的淋巴器官，如脾脏和淋巴结，收集到含有 2% FCS（FACS 缓冲液，参见食谱）的冷 PBS 中，置于冰上的 15 ml 管中。此供体小鼠应与同类 (CD45.1) 接受者的性别和年龄相匹配。
将器官带到 I 级生物安全柜中。将 100 µm 细胞过滤器插入 50 ml 管中并置于冰上。将淋巴器官放在细胞过滤器上，并用 5 毫升注射器的钝端小心地以圆周运动捣碎。使用 1 ml 移液器将过滤器轻轻冲洗到带有 FACS 缓冲液的 50 ml 管中。重复该过程，直到过滤器中没有组织团块。
取下细胞过滤器并将盖子拧到 50 毫升管上。在 4°C 下以 1,200 rpm（相当于 293 rcf）离心 7 分钟。打开生物安全柜中的管子，倒出上清液。
加入 3 ml 1× 红细胞裂解缓冲液（参见配方）并上下移液混合。在 RT 中孵育 3 分钟。加满 6 ml FACS 缓冲液，并在 4°C 下以 1,200 rpm 离心 7 分钟。
倒出上清液并将沉淀重悬在 1 ml 缓冲液 C 中（参见食谱）。颗粒现在应该是白色的。
用 200 µl 移液器上下吹打，彻底混合细胞悬液。添加 4-9 ml Buffer C。计数细胞，例如，使用 Luna 细胞计数器：在 96 孔板的 U 形底孔中混合 1.5 µl 吖啶橙/碘化丙啶染色剂 + 13.5 µl 细胞悬液。在载玻片上加载 10 µl 以评估活细胞的分数。或者，可以使用任何细胞计数器或血细胞计数器和台盼蓝。
取出 1 × 10 6 个细胞并保存在 4°C 的 FACS 缓冲液中，以便在以后的时间点进行流式细胞术分析（参见下面的程序 E）。
根据制造商的说明，使用 Naïve CD8a + T Cell Isolation Kit分离幼稚 CD8 T 细胞。
- 对于每 1 × 10 7 个细胞，将沉淀重悬在 40 µl 缓冲液 C + 10 µl 生物素-抗体混合物中的 15 ml 试管中。充分混合并在 4°C 下孵育 10 分钟。
- 对于 1 × 10 7细胞，添加 20 µl Buffer C + 20 µl 抗生物素微珠 + 10 µl 抗 CD44 微珠。充分混合并在 4°C 下再孵育 15 分钟。
- 加入 10 ml Buffer C 并在 4°C 下以 287 × g离心7 分钟。
- 倒出上清液并将沉淀重悬在 3 ml 缓冲液 C 中。
- 将预冷 (4°C) LS 色谱柱置于 Miltenyi MidiMACS分离器的磁场中。
- 用 3 ml 冰冷的缓冲液 C 冲洗柱子。丢弃流出液。
- 将一个 15 毫升的管子放在冰上，并将其放置在柱子出口下方。将 3 ml 细胞悬液加载到柱子上，并在 15 ml 管中收集流出液。用 3 ml 缓冲液 C 冲洗每根柱子一次。收集的流出液的总体积为 6 ml。
计数细胞（见步骤 B7）。
取出 1 × 10 6 个细胞并保存在 4°C 的 FACS 缓冲液中，以便在以后的时间点进行流式细胞术分析（参见下面的程序 E）。
在 4 °C 下以 287 × g离心7 分钟。在无菌 PBS 中稀释细胞以达到每只小鼠需要转移的细胞数量。

对于 Lm 感染前 24 小时植入和感染后第 1 天读出的实验，每只小鼠注射 3 × 10 6细胞在 100 μl PBS（室温，RT）中；对于 d3 感染后读数，每只小鼠在 100 μl PBS (RT) 中注射 1 × 10 6 个细胞；对于 d7 或更晚的感染后读数，每只小鼠注射 2 × 10 4 个细胞在 100 μl PBS (RT) 中。在注入尾静脉之前重悬细胞。

注意：在过继细胞转移（当注射 LmOVA 时）后 24 小时，可以通过根据相关动物实验伦理许可的指导方针收集 50 μl 外周血并进行流式细胞术分析来评估移植物，如下所述（参见下面的程序E)。

注射 LmOVA 和监测动物

在生物安全级别 2 (BSL-2) 动物设施中进行小鼠感染。动物需要饲养在单独通风的笼子 (IVC) 中。

注意：感染后，所有使用过的笼子，包括垃圾，都需要高压灭菌。

使用可上锁的盒子和可消毒的精密秤测量单个小鼠的基线体重。

注意：理想情况下，小鼠应在实验前 3-5 天习惯每日称重过程，以避免因压力反应而导致体重减轻。还建议每天在同一时间给小鼠称重，以避免因食物摄入而产生波动。

将单个鼠标放入限位器中。

注意：为了更好地观察静脉并促进注射，可以将动物放在红外线灯下 5-10 分钟，注意不要使动物过热。

可以在以下链接中找到演示此过程的视频：鼠标中的静脉注射：https : //researchanimaltraining.com/articles/intravenous-injection-in-the-mouse/。

使用 29G 胰岛素注射器通过尾静脉将混合好的 LmOVA（如程序 A 中制备的）注射到小鼠体内。每只小鼠注射 200 μl 5 × 10 4细菌/ml 稀释液，总共 10 4细菌（图 2）。将针头和注射器丢弃在生物危害锐器容器中，以便以后高压灭菌。

注意：感染可以在健康的野生型小鼠中进行，也可以在前一天通过过继细胞转移接受 OT-I 细胞的小鼠中进行。

要确定注入的实际 CFU，请按照程序 A5（见上文）进行操作。
在细菌感染后的前 7 天，每天监测动物的体重和总体健康状况。预计第 1-3 天体重会下降；稍后，可以观察到体重的恢复。监测粪便的稠度，与正常情况相比，粪便的颜色应该更柔软、颜色更浅。

注意：仔细检查小鼠的总体外观，与您的实验动物许可证相对应。必须防止严重的疼痛、痛苦和困扰。

准备脾匀浆电镀

笔记：

在 C57BL/6 野生型小鼠感染后长达 7 天，可以在脾脏中检测到 Lm。在接受 OT-I 细胞的动物中，细菌清除得更快，并且在第 7 天很少被检测到（未发表的观察）。可以在急性期（感染后 24 小时和 3 天）和/或免疫反应高峰期（感染后 7 天）评估细菌负荷。
一部分脾脏可用于通过流式细胞术评估免疫细胞。在这种情况下，在记录脾脏重量后，应按照步骤 B 中的步骤 1-8 制备单细胞悬浮液，随后，只有 50% 的细胞悬浮液会在 0.14% 的 Tergitol/PBS 中裂解用于电镀LB 琼脂平板上。其他 50% 可用于流程 E 中所述的流式细胞术分析。
所有工作都应在 II 级生物安全柜中进行，并配备足够的防护装备。

如程序 B1 中所述牺牲动物，并在含有 5 ml 冷 FACS 缓冲液的 15 ml 锥形管中收集脾脏；将试管存放在冰上。
将脾脏带到 II 类生物安全柜。记录脾脏的重量。如果要通过流式细胞术并行分析 CD8 T 细胞反应，请继续称重 50% 的脾脏。
在 5 ml 0.14% Tergitol/PBS 的无菌 100 mm × 15 mm 培养皿中捣碎脾脏（或 50% 的器官）。Tergitol 立即引起细胞裂解并释放细胞内细菌。
在 PBS 中制备细胞裂解物的连续 10 倍稀释，范围从 1:10 到 1:1,000,000，并通过铺展到 LB + 红霉素 LB 琼脂平板上，在技术重复中将每种稀释的 100 μl 平板。在 37°C 下倒置生长 24 小时（图 2）。
24-48 小时后，计算菌落数。应使用 CFU 在 30-300 之间的平板来确定细菌负荷（图 2）。表 2 中提供了一个示例计算：

表 2. CFU 计算示例

CFU = 菌落形成单位，Ga CFU = Grand CFU，V = 体积，mg = 毫克，hom。= 匀浆。平均 CFU 乘以 10 得到每毫升浓度（100 μl × 10 = 1 ml）。

制备用于流式细胞术分析的外周血单核细胞 (PBMC)

笔记：

同一动物可以在 LmOVA 感染后的不同时间点进行分析，例如早期 (d3)、峰值 (d7)、记忆 (d70) 或再次感染后。
也可以在 ACT 后一天收集 PBMC，以评估 OT-I 细胞的植入。

从下颌静脉或尾静脉收集 50 μl 外周血（约 2-3 滴）到含有 10 μl 肝素的 Eppendorf 管中。
将管子转移到 II 类生物安全柜中。
将 50 μl 血液/肝素混合物转移到 50 ml 管中的 10 ml 自制红细胞裂解缓冲液（参见配方）中，并在室温下孵育 5 分钟。然后加入 20 ml 的 FACS 缓冲液。
在 4°C 下以 287 × g离心7 分钟，倒出上清液。将沉淀重悬在 1 ml FACS 缓冲液中，并如上所述对细胞进行计数（程序 B7）。
每个 FACS 管转移 0.5 × 10 6 -1 × 10 6 个细胞，并在 4°C 下以 1,200 rpm（相当于 293 rcf）离心 7 分钟，然后倒出上清液。
加入 10 μl Fc-Block（1:25 在 FACS 缓冲液中），重悬，并在室温或 4°C 下孵育 5 分钟。
加入 50 μl 抗体混合物（如下所述稀释）并在 4°C 下染色 30 分钟，避光。

注意：SIINFEKL-四聚体染色应在 RT 进行。

加入 1 ml FACS 缓冲液，在 4°C 下以 1,200 rpm（相当于 293 rcf）离心 7 分钟，倒出上清液。
在 RT 中用 1% PFA/PBS 固定细胞 20 分钟。
用 1 ml FACS 缓冲液清洗细胞，并在 4°C 下以 1,200 rpm（相当于 293 rcf）离心 7 分钟，倒出上清液。
将沉淀重悬在 200 μl FACS 缓冲液中，并在流式细胞仪上采集。要设置补偿，可以使用单元格或 OneComp eBeads TM 。

从脾脏制备单细胞悬液用于流式细胞术分析

按照程序 B 的步骤 1-8 中的说明制备单细胞悬浮液。
将细胞在4°C 下以 287 × g离心7 分钟，然后倒出上清液。
每管加入 10 μl Fc-Block（在 FACS 缓冲液中为 1:25），重悬并孵育 5 分钟。
每管加入 50 μl 抗体混合物（如下所述稀释），并在 4°C 下染色 30 分钟，避光。

注意：SIINFEKL-四聚体染色应在 RT 进行。

加入 1 ml FACS 缓冲液，4°C 下以 287 × g离心7 分钟，倒出上清液。
在 RT 中用 1% PFA/PBS 固定细胞 20 分钟。
用 1 ml FACS 缓冲液洗涤，4°C 下以 287 × g离心7 分钟，倒出上清液。
在 200 μl FACS 缓冲液中重悬沉淀并在流式细胞仪上采集（图 2 和 4）。

表 3.用于流式细胞术分析的抗体混合物面板。

ACT 植入面板用于程序 B12（可选）中描述的血液样本。另外两个面板用于检测脾脏和血液中的抗原特异性 CD8 T 细胞，具有以下门控模式：CD45 + CD8 +预门控短寿命效应细胞（SLEC：CD127 - KLRG1 + ）和记忆前体显示了细胞（MPEC：CD127 + KLRG1 - ）。

图 4. 抗原特异性 CD8 T 细胞的流式细胞术数据分析示例。

(A) C57BL/6 小鼠感染了 1 × 10 4 CFU LmOVA。抗原特异性 (CD44 + OVA tet+ ) CD8 T 细胞在血液中的频率在感染后长达 70 天进行监测 (dpi)。CD8 + T 细胞内CD44 + OVA tet +细胞的代表性点图和量化显示为感染后指定的时间点。(B) 70 dpi脾脏中 SLEC (CD127 − KLRG1 + )和 MPEC (CD127 + KLRG1 − )内CD44 + OVA tet+ CD8 + T 细胞的代表性点图(C)脾 SLEC (CD127 ) 的代表性点图和量化− KLRG1 + ) 和 MPEC (CD127 + KLRG1 − ) OT-I CD8 T 细胞在过继转移 OT-I T 细胞并在 1 天后感染后第 7 天，在 CD45.2 + CD45.1上预选通- CD8 + CD44 + 。显示的数据代表至少两个独立的实验，n = 3-7。条形图中的每个点代表来自一只单独鼠标的数据。结果显示为平均值 ± SD，经 Nature Publishing Group 许可转载（Jakic等人，2021 年）。

数据分析

在程序 A5 和 D4 中确定细菌负荷：

来自脾脏的集落形成单位 (CFU)，参见 Jakic等人的补充图 1B 。(2021)。

确定小鼠体重减轻：

重量是相对于第 0 天（感染前）计算的，参见 Jakic等人的补充图 1B 。(2021)。

确定抗原特异性免疫反应：
1. 使用例如FlowJo 软件分析流式细胞术数据。计算 CD45.2 OT-I 细胞（ACT 实验）或抗原特异性（OVA tet+ ）CD8 T 细胞的相对频率。双重排除后淋巴细胞的门控（FSC-A 与 FSC-H），对于 MPEC（KLRG1 - CD127 + ）和/或 SLEC（KLRG1 + CD127 - ）评估参见图 1E、2B、4C、6A、6D 和补充图 5B、5E、7A（Jakic等，2021）。可以将数值数据导出到 Excel，以计算脾脏和特定体积血液中的绝对细胞数。
2. 执行统计分析并生成图表，例如，在 GraphPad Prism 中。应通过例如夏皮罗-威尔克检验评估数据的正态性。当正态分布时，可以对具有相等方差的样本（F检验）、双向方差分析或混合效应模型分析 (REML)使用非配对学生t检验进行统计分析。如果不是正态分布，则可以执行 Mann-Whitney U 检验。数据理想地表示为平均值±SD。

注意：对于过继转移实验，仅使用显示成功植入的小鼠进行，即植入后 24 小时在外周血中检测到 OT-I 细胞。

食谱

LB培养基

根据Lennox (Carl Roth #X965.1)每升蒸馏水溶解 20 克 LB琼脂粉。
高压灭菌。
使用前，加入终浓度为 500 mg/ml 的葡萄糖和终浓度为 5 µg/ml 的红霉素。
在 4°C 下储存最多 1 个月。

LB琼脂平板

根据 Lennox (Carl Roth #6671.3) 的规定，将 17.5 克 LB 琼脂粉溶解在 500 毫升蒸馏水中（pH 值调至 7）。
高压灭菌。
在加入终浓度为 5 µg/ml 的红霉素之前，将液体琼脂冷却至 <50°C。
将琼脂倒入安全柜中的 10 厘米培养皿中。
允许完全聚合，保持无菌，并在 4°C 下储存。

红霉素（原液：5 毫克/毫升；终浓度：5 微克/毫升）

将 50 毫克红霉素溶解在乙醇中，并使其总体积为 10 毫升。
在 4°C 下储存 1 毫升的等分试样（在 1.5 毫升反应管中）。
将 1 ml 红霉素原液加入 1 L LB 培养基/琼脂中。

用于培养单核细胞增生李斯特菌的葡萄糖添加剂（库存：500 毫克/毫升；最终浓度：5 毫克/毫升）

将 25 g 葡萄糖溶解在水中，并使其最终体积为 50 ml。
使用 0.22 μm 过滤器过滤灭菌并储存在 4°C。
将 10 ml 葡萄糖原液加入 1 L LB 培养基/琼脂中。

流式细胞仪缓冲液

将 20 ml 胎牛血清 (FCS) 与 1 L 无菌 PBS 混合。
在 4°C 下储存最多 1 个月。

红细胞裂解缓冲液（10×）（冷泉港协议，2006）

如需在 4°C 下储存长达 1 个月，请使用蒸馏 H 2 O 进行准备：

使用真空泵通过 0.22 µm 过滤器过滤。在 4°C 下储存，并在使用前直接在蒸馏水中稀释以制备新鲜的 1 倍稀释液。

固定缓冲液

用 PBS 稀释 4% 甲醛库存溶液 (Carl Roth #P087.4) 以生成 1% 溶液。
立即使用溶液固定细胞（如上述程序 E 中所述）。
将原液储存在通风的化学柜中，避光。

缓冲液 C

PBS pH 7.2

BSA，0.5% (w/v)

2 mM EDTA

通过搅拌混合所有组分。使用真空泵带有 0.22 µm 过滤器的无菌过滤器。在 4°C 下储存最多 1 个月。

致谢

这项工作得到了 FWF 奥地利科学基金的支持，并获得了以下赠款 (N-HK.: P28694-B30)。该协议描述了 Jakic等人发表的实验。(2021)。

利益争夺

作者声明不存在财务或非财务利益冲突。

伦理

动物程序经奥地利联邦教育、科学和研究部批准 (BMWFW-66.011/0064-WF/V/3b/2016; BMWFW-66.011/0112-WF/V/3b/2017) 。

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