材料和试剂

1. 细菌接种环（Copan，目录号：8177CS20H）

2. 细菌培养管，螺旋盖，12 mL（Sarstedt，目录号：60.9922.937）

3. 透明平底96孔微孔板（Greiner Bio-One，目录号：655101）

4. Mepilex ^®Transfer（Mölnlycke Heath Care，目录号：294800）

5. 活检穿孔器，6 mm（Kai，目录号：BP-60F）

6. 培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5981）

7. 酒精湿巾（Cutisoft 湿巾，BSN Medical，目录号：204364 ）

8. 纱布拭子（SELEFA，ONRMED，Finlan，目录号：222002）

9. BALB/c 小鼠，8-12 周龄，雄性或雌性（JANVIER LABS，法国，BALB/cJRj）

10. 铜绿假单胞菌Xen41（PerkinElmer，目录号：119229）

11. BD Bacto Todd Hewitt Broth（ Fisher Scientific，目录号：249210）

12. TCP-25 (GKYGFYTHVFRLKKWIQKVIDQFGE)

作为一种抗菌药物，我们使用了凝血酶衍生肽 TCP-25（由美国加利福尼亚州圣地亚哥的 Biopeptide 合成）。

13. 维可利缝合线（Johnson & Johnson，比利时，目录号：V452H ）

14. 无内毒素水（Sigma，目录号：TMS-011-A）

15. 异氟醚气体（Forane，Baxter，目录号：CA2L9100 ）

16. Tris 缓冲液（ 10 mM，pH 7.4）

17. 氯胺酮（氯胺酮，Intervet，目录号： 511519）

18. 甲苯噻嗪（Rompun vet，BAYER，目录号： 023572）

19. 脱毛膏（Veet 脱毛膏，Reckitt Benckiser，目录号： 5701092103888）

20. TCP-25 解决方案（见配方）

21. TH肉汤（见食谱）

设备

1. 手术剪（Aesculap，目录号：BC162R）

2. 镊子（Aesculap，目录号：BD217R）

3. 摇动培养箱（Innova 42，Fisher Scientific，目录号：11330025）

4. 体内成像系统（IVIS 光谱，PerkinElmer，目录号：124262 ）

5. 无绳理发器（Aesculap，目录号：GT416 ）

6. 分光光度计（Genesys 20，Thermo Scientific）

7. 离心机（Sigma 1-6 紧凑型离心机，Sigma）

软件

1. Living Image 4.5.5 软件（珀金埃尔默）

2. 棱镜，8.3.0 版（GraphPad Software, LLC.）

程序

A. 体外和体内实验的细菌制备

1. 使用细菌接种循环，从库存培养板中挑选一个铜绿假单胞菌Xen41 菌落，并将其接种在细菌培养管中的 5 mL TH 肉汤中。保持管盖松动，在 37°C 的摇动培养箱中孵育过夜。

2. 第二天早上，要刷新培养物，从过夜培养物中取出 100 μL，并添加到新的细菌培养管中，其中含有 5 mL TH 肉汤。保持管盖松动并在 37°C 的摇动培养箱中孵育。

3. 孵育 1 小时后，取管并在分光光度计中测量 620 nm 的 OD。目标是实现 0.4 的 OD，因此，如果它更小，请将管放回培养箱中，并在每 15 分钟后测量 OD，直到达到 0.4。然后，拿起管子，准备清洗。

注意：使用接受 10-15 mL培养管的分光光度计会有所帮助，因为无需单独取样即可测量 OD。

4. 离心 10 分钟（3,000 × g ，室温）并去除上清液。将 500 μL 的 Tris 缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4）添加到颗粒中，并用移液器混合溶解。再次离心10 分钟（3,000 × g ，室温）。去除上清液，向颗粒中加入 300 μL Tris 缓冲液，并用移液器混合以获得 ~10 ⁹CFU/mL 细菌悬浮液。

注意：对于每种细菌菌株，OD 与. CFU 关系可能不同。因此，应为每个细菌菌株准备生长曲线。

B. 体外测定

图 1 说明了体外测定的实验设置和工作流程。

注意：我们使用 IVIS 成像系统对 96 孔板格式的生物发光细菌进行体外测定的数据采集。任何其他光度计都可用于板式测定。 IVIS 成像的另一个优点是它还可以生成每个孔的热图图像，代表细菌排放的总通量。

图 1.体外测定的实验设置和工作流程图示。

1. 从步骤 A4 中获得的细菌悬浮液中，制备2 × 10 ⁸cfu/mL 的 Tris 缓冲液悬浮液。

2. 在透明 96 孔板的每个孔中加入 50 μL（即10 ^{7 CFU/mL）的悬浮液。}

注意：根据实验计划对每个条件使用一式两份或一式三份。

3. 添加在 Tris 缓冲液中制备的 250 μL 的 TCP-25 溶液。在这里，为了研究剂量反应，我们使用 5 µM、10 µM、20 µM、50 µM 和 100 µM 的 TCP-25 最终浓度。对于控件，添加 250 μL 的 Tris 缓冲液。用吸管轻轻混合以避免气泡形成。

可以添加100 至 250 µL的任何其他测试配方来代替 TCP-25 溶液。如果药物溶解在与 Tris 不同的缓冲液中，则在实验计划中包括相关的缓冲液对照组。使用多通道移液器添加配方，因为这将允许快速获取数据以研究药物的快速抗菌活性。

4. 将板转移到 IVIS 成像系统。保持板与舞台上的水平“视野”线对齐。

注意：使用 IVIS 前请阅读 IVIS 光谱用户手册。在成像前至少 15-20 分钟启动 Living Image 软件并对其进行初始化。初始化过程将相机温度降至 -90°C。阶段加热应设置为 37°C。

5. 在 IVIS 采集控制面板中设置参数。选择发光（成像模式）、自动（曝光）和 C（视野）。单击“获取”开始成像。成像后立即将盘子放在培养箱中（37 °C）。对于动力学分析，板也可以留在舞台上。

注意：我们进行 2、5、15、30、60 和 120 分钟的成像。由于大多数缓冲液不支持细菌生长，因此应测试额外的补充剂或生长培养基并将其用于需要更长孵育时间的实验。

6. 转到数据分析。

C. 用于皮下植入的 PU 盘的制备

图 2 说明了体内测定的实验设置和工作流程。

注意：在II 类生物安全柜中执行此步骤或使用无菌条件。圆盘也可以涂有其他肽或药物。优化和测试每种化合物的涂层方法。

数字 2. 体内测定的实验设置和工作流程的说明。

1. 从聚氨酯 (PU) 敷料 (Mepilex Transfer) 上取下保护性塑料覆盖物。用活检打孔器切割直径为 6 mm 的 PU 圆盘。

2. 将 TCP-25 溶解在无菌水中以制备库存溶液（5.0 和 0.5 毫克/毫升）。使用 20 μL 的每种库存溶液分别制备 100 μg 和 10 μg TCP-25 的圆盘。

3. 将 PU 盘放在培养皿中，并在每个 PU 盘中加入 20 μL 的库存溶液。在控制盘中仅添加 20 μL 的无菌水。将培养皿放在生物安全柜中，在室温 (20°C ± 1°C) 下风干 12 小时。

4. 涂层后，立即将光盘存放在- 80°C 的无湿盒中。

D. 小鼠PU椎间盘皮下植入

注意：椎间盘植入可以在全身麻醉下通过肠胃外（例如氯胺酮和甲苯噻嗪鸡尾酒）或吸入途径（例如异氟醚气体）进行。由于此过程需要很短的时间（3-5 分钟），因此使用异氟醚麻醉更为可取且更安全 为动物。异氟醚麻醉需要能够通过小鼠鼻锥向小鼠输送异氟醚的麻醉系统。

1. 在感应室中，用 4% 异氟醚和氧气的混合物（流速：1.5 L/min）麻醉 BALB/c 小鼠（8-10 周大）。麻醉后，将小鼠从感应室中取出并放在桌子上。立即将鼻锥调整到鼠标并用 2% 异氟醚和氧气混合物保持麻醉。

注意：麻醉诱导可以在 IVIS 的诱导室或任何其他异氟醚-氧气输送系统中实现。 BALB/c 小鼠是生物发光成像的首选，因为深色颜料会干扰发射的信号。如果不可避免，C57BL/6 或毛色较深的小鼠可以与优化的协议一起使用。异氟醚有毒，其使用需要遵循您设施的标准安全协议。

2. 使用理发剪，在肩胛间区域略下方的区域从鼠标背部剃毛。用酒精擦拭皮肤并用无菌纱布擦干。

注意：毛发去除是必要的，因为小鼠毛发会在成像过程中干扰发光信号。脱毛也可以用脱毛膏来实现。脱毛膏应在椎间盘植入前至少 2-3 天使用。如果使用毛色较深的小鼠，使用脱毛膏脱毛效果更好。

3. 使用剪刀，在无菌条件下，在鼠标背部皮肤上进行 5-10 毫米长的切口。使用剪刀的尖端在皮肤下创建一个小皮下袋。在镊子的帮助下，将 PU 圆盘插入皮下口袋。

4. 用镊子抓住伤口边缘，在移液器的帮助下，将 50 μL 的铜绿假单胞菌Xen41 细菌悬浮液（1 × 10 ⁷CFU）添加到 PU 盘中。使用 Vicryl 用两条简单的间断缝合线闭合皮肤伤口。

注意：根据我们的经验，铜绿假单胞菌 Xen41的 1 × 10 ⁶到 1 × 10 ^{7 CFU 的接种物在成像过程中会产生良好的可检测信号。}发光细菌菌株、小鼠菌株和小鼠皮毛颜色等因素可能会影响信号强度，因此在试点实验中应优化接种量。皮肤伤口也可以用小鼠皮肤订书钉或组织胶缝合。使用新鲜的细菌悬浮液。制备菌悬液后，将其置于冰上最多 1-2 小时。

5. 把老鼠放回笼子里。

注意：如果使用全身麻醉或手术时间较长，则应使用小鼠下方的加热垫来保持体温。

E. 体内成像

注意：使用 IVIS 前请阅读 IVIS 光谱用户手册。在成像前至少 15-20 分钟启动 Living Image 软件并对其进行初始化。初始化过程将相机温度降至 -90 °C。阶段加热应设置为 37°C。

1. 在感应室中，使用 4% 的异氟醚混合氧麻醉小鼠。

注意：使用 IVIS 前请阅读 IVIS 光谱用户手册。

2. 将小鼠转移到 IVIS 成像室。将它们置于俯卧位，并确保它们的鼻子位于鼻锥内。立即开始向腔室供应 2% 的异氟醚以维持麻醉。

注意：一次最多可以对五只小鼠进行成像。除非一次成像一只小鼠，否则在单个成像快照中包括来自不同实验组的小鼠是合适的。

3. 选择适当的参数进行成像。在 IVIS 采集控制面板上，设置发光（成像模式）、自动（曝光）和 D（5 只小鼠的视野）或 C（3 只小鼠的视野）。

注意：“成像向导”选项可用于更改成像模式或其他参数。

4. 在 IVIS 采集控制面板中单击“获取”以开始成像。

注意：增加曝光时间以获取微弱的生物发光信号。活体成像时间点应根据项目需要确定。在这个模型中，我们通常在椎间盘植入后 15 分钟、3、6、24 和 48 小时进行成像。成像频率应保持在最低限度，因为麻醉对小鼠的健康有不利影响。

数据分析

注意：对于体外和体内实验，IVIS 采集的数据使用 Living Image 软件进行分析和量化。从 IVIS 获取的数据应保存以供后续分析。根据 Living Image 软件的可用性，稍后可以在另一台计算机上分析数据。

1. 启动 Living Image 程序并打开保存的文件。每个图像及其元数据都保存在一个单独的文件夹中。打开原始（.txt 文件）以查看从摄影图像和生物发光图像生成的叠加图像。从工具面板中，选择板的每个孔上的感兴趣区域 (ROI)，用于体外实验，并在每只鼠标上，用于体内实验。 ROI 位于观察或预期发光信号的区域。为 96 孔板的每个孔选择一个圆形 ROI。对于小鼠，我们选择了一个圆形 ROI，覆盖了植入的椎间盘区域，但大于植入的椎间盘直径。可以在一张图像中选择多个 ROI。一个区域的 ROI 的形状和大小可以复制并应用于其他区域或图像。

2. 要获取生物发光数据，请在主图像视图和 ROI 测量窗口中选择辐射（光子）作为单位。单击测量 ROI，测量数据将出现在新窗口中。

3. 将原始数据复制到 GraphPad Prism 或 Excel 进行统计分析。图 3 显示了微孔板的生物发光成像结果。图 4 显示了体内生物发光成像的结果。

4. 数据表示为平均值± SEM 或 SD。使用 Mann-Whitney 检验比较两组之间的平均值。使用 Kruskal-Wallis 检验比较两个以上组之间的平均值。根据实验计划，也可以使用其他适当的统计方法。

注意：有关 ROI、数据测量和数据显示的详细信息，请阅读 Living Image 软件用户手册。

图 3. TCP-25 抗菌功效的体外评估。

在微孔板中，将生物发光铜绿假单胞菌Xen41与不断增加的 TCP-25 浓度一起孵育不同的时间点，并使用 IVIS 对生物发光发射进行成像。具有代表性的发光强度热图显示了每个孔中细菌发出的总通量。条形图显示了细菌发出的生物发光强度的量化。

图 4.皮下植入物感染小鼠模型中 TCP-25 涂层 PU 椎间盘的体内评估。

TCP-25 涂层将PU 椎间盘皮下植入并用生物发光的铜绿假单胞菌Xen41 感染。使用 IVIS 可视化发射的生物发光的强度。在 15 分钟和 6 小时的时间点显示了代表性的光发射强度和热图叠加。蓝色虚线表示量化的感兴趣区域。条形图显示了细菌发出的生物发光强度的量化。数据表示为平均值± SEM ( n = 4) 。使用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 后检验确定P值。 * P ≤ 0.05； ns，不显着。

笔记

这里描述的使用生物发光细菌的实验是可重复的。有时，细菌的低发光发射可能会出现问题。实验者应检查细菌培养物是否保持在选择性培养基中。此外，结果可能会因不同品系的小鼠而异，因此应在新小鼠品系的试点实验中优化体内测定。

食谱

1. TH肉汤

a. 将 30 克 BD Bacto Todd Hewitt Broth 粉末溶解在 1 L 纯净水中。

b. 在 121°C 高压灭菌 15 分钟。

c. 使用前冷却至室温。

2. TCP-25 解决方案

a. 在 Eppendorf 管中加入所需量的 TCP-25。

注意：我们通常制作 1 mg/mL 或 5 mg/mL 的新鲜储备溶液。

b. 添加 Tris 缓冲液（ 10 mM，pH 7.4）。

c. 短暂涡旋溶液。

d. 离心 1分钟（2,575 × g ，室温）以去除气泡。

致谢

我们感谢 Drs。 Mölnlycke Health Care AB（瑞典哥德堡）的 Kristina Hamberg 和 Sofia Almqvist 提供 Mepilex PU 材料。作者感谢 Ann-Charlotte Strömdahl 提供的出色技术援助我们感谢 BioRender 在创作卡通片方面的帮助。我们获得了瑞典研究委员会（项目 2017-02341、2020-02016）、 Edvard Welanders Stiftelse 和 Finsenstiftelsen（Hudfonden）、Torsten Söderberg、Crafoord 和 Österlund 基金会、Stiftelsen Lars Hiertas Minne、隆德皇家生理学会的资助和瑞典政府临床研究基金 (ALF)。该协议源自原始研究论文（ Strömdahl等人，2021）。

该协议改编自我们之前的工作（Puthia等人，2020；doi：10.1126/scitranslmed.aax6601）。

利益争夺

Schmidtchen 博士是 in2cure AB 的创始人，该公司开发用于治疗应用的抗炎肽。

伦理

动物实验是根据瑞典动物福利法 SFS 1988:534 进行的，并得到瑞典马尔默/隆德动物伦理委员会的批准。

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