材料

1. 1.5 mL微量离心管（Starlab，目录号：E1415-1510）

2. 移液器吸头（10 μL、200 μL 和 1,000 μL）（Sarstedt，目录号：70.3010、70.760.3010、70.3050.200）

3. 细胞培养培养皿（Starlab，目录号：CC7682-3394）

4. 携带 N 末端 3× FLAG 标记的蛋白质的哺乳动物表达载体，例如 p3× FLAG-CMV ^TM-8（Merck，目录号：E9908）

5. pSVBpUC.Bst-Yam 抑制 tRNA 质粒，叶世新博士的慷慨礼物（读作 tRNASup）。 Ye等人描述了基因克隆。 (2008)

6. pCDNA3.1(+).aminoacyl-tRNA synthetase 特异于 Bpa，这是 Shixin Ye-Lehman 博士的慷慨礼物（读作 aaRS）。 Ye等人描述了基因克隆。 (2008)

7. HEK293 电池（ATCC ^®，目录号：CRL-1573 ^TM）

8. Anti-Flag M2磁珠（Sigma-Aldrich，目录号：M8823；-20°C）

9. 产品HL-Bpa-OH（对苯甲酰基-L-苯丙氨酸）（IRIS Biotech，目录号：HAA6010）（读作 Bpa）

10. QuikChange 多位点定向诱变试剂盒（Agilent Technologies，目录号：200514）

11. DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D6429；4°C）

12. jetPRIME ^®转染试剂（PolyPlus，目录号：114-15；4°C）

13. cOmplete ^TM不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：5056489001，4°C）。将溶解的储备溶液储存在 -20°C

14. Benzonase（Merck Chemicals，目录号：70664-3；-20°C）

15. 抗flag M2抗体（S igma Aldrich，目录号：F1804；-20°C）

16. PBS（Lonza，目录号：BE17-516F）

17. NaOH（VWR Chemicals，目录号：28244.262）

18. HCl（Fisher Chemical ^TM，目录号：H/1150/PB17）

19. 胎牛血清（Gibco，目录号：10500064；-20°C）

20. 青霉素-链霉素（Gibco，目录号：15140-122；4°C）

21. L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：25030024，4°C）

22. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号： H0887 ）

23. KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）

24. NaCl（VWR Chemicals，目录号：27810.364）

25. EDTA（VWR Chemicals，目录号：20302.260）

26. EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）

27. NP-40（IGEPAL ^®CA-630）（Sigma-Aldrich，目录号：I3021）

28. 尿素（V WR Chemicals，目录号：28877.292）

29. 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）

30. SDS（Sigma-Aldrich，目录号：05030）

31. Precision Plus 蛋白质双色标准品（Bio-Rad，目录号：1610374）

32. 温和的 RIPA 缓冲液（见配方）

33. 严格的 RIPA 缓冲液（见配方）

设备

1. 台式冷冻离心机（Thermo Scientific，型号：Heraeus ^TMFresco 17 或 MicroCL 21R）

2. 紫外灯（UVP，型号：95-0007-06）

3. DNA 剪切超声仪（Diagenode，型号：Bioruptor ^®Pico 或 QSonica，型号：Q800R1）

4. 移液器控制器（Starlab，型号：Starpet Pro E4866-0021）

5. 管旋转器（Stuart，型号：SB3）

6. 标准轨道摇床（Stuart，型号：SSL3）

程序

A. 野生型和 TAG 突变病毒蛋白质粒载体的设计和构建

1. 将编码病毒蛋白的基因克隆到编码 N 端 3 × FLAG 标签的载体中。

2. 根据各个实验室的标准化协议，通过 DNA 测序进行细胞转化、质粒纯化和确认。

3. 设计引物以用琥珀密码子 TAG 替换野生型病毒基因的选定密码子，理想情况下位于正向和反向引物的中心。

注意：首先选择芳香族氨基酸，如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸（Bpa类似于色氨酸）。也可以替换其他残基，例如脂肪族氨基酸（异亮氨酸或亮氨酸）。优先考虑进化保守区域内的那些。

4. 根据制造商的说明，使用 QuikChange 多位点定向诱变试剂盒（Agilent Technologies）执行基于寡核苷酸的定点诱变。

B. Bpa 溶液的制备

1. 通过首先将 Bpa（分子量：269.29 g/mol）溶解在称重船中的 1 M NaOH 中，新鲜制备 Bpa 溶液。示例：在 220 µL NaOH 溶液中加入 54 mg Bpa（分子量：269.29 g/mol），用于 100 mL 培养基。这个母亲的解决方案应该是清晰的。

注意：每次实验前准备足量的 Bpa 溶液。可在室温下制备，无需避光。 NaOH溶液或NaOH溶液中的Bpa不需要灭菌。将覆盖有保鲜膜的称重船放在轨道摇床上。 Bpa 需要几分钟才能完全溶解，形成黄绿色溶液。

2. 然后，将 Bpa 溶液添加到 100 mL 的培养基中，以获得 2 mM 的最终浓度。

3. 轻轻混合培养基。

4. 添加 220 μL 的 1 M HCl 以中和培养基（pH 6.8-7.2）。再次轻轻混合培养基。

C. 共表达

注意：对于每个新的突变衍生物，建议首先在 6 孔板中进行共表达，并通过蛋白质印迹验证 Bpa 的掺入。

1. 以 70-80% 的汇合度将含 Bpa 的培养基添加到 HEK293 细胞中。

注意：在不存在或存在 Bpa 的情况下，准备具有野生型或突变衍生物的培养皿组。

2. 转染前量化所有质粒载体。使用标准转染试剂，例如 jetPRIME ^®转染试剂 (PolyPlus)，以 1:2:1 的比例共转染编码病毒基因 tRNASup 和 aaRS 的三种质粒载体。

注意：最佳比例可能会根据转染效率和蛋白质的表达情况而变化。然而，这些比率在 ICP22 的 HEK293 细胞中起作用。

3. 将转染溶液添加到板的一侧，轻轻摇晃培养皿，然后将细胞放回培养箱中。

4. 24 小时后，用新鲜的含 Bpa 培养基更换培养基。一夜之间长大。

5. 裂解细胞和亲和纯化病毒蛋白以进行蛋白质印迹以筛选突变衍生物以进行表达（图 1）。

注意：按照 E 部分进行亲和纯化。

图 1 。亲和纯化的 HSV-1 ICP22 病毒蛋白来自在有和没有 Bpa 的情况下培养的 HEK293 细胞。野生型 (WT) 在基因中没有琥珀密码子。

(a) 在未转染 ( Untr .) 细胞中，在约 55 kDa 处看到的条带是 IgG 重链。从免疫沉淀样品中获得特定的蛋白质印迹信号。 (b) 在存在或不存在 Bpa 的情况下，来自表达全长野生型病毒蛋白而没有任何琥珀密码子的细胞的蛋白质提取物在约 70 kDa 处迁移。野生型病毒蛋白用作选择良好突变衍生物的参考点。 (c) 来自用突变病毒蛋白 L205TAG(*) 共转染的细胞的蛋白质提取物。 Blot 看起来像 (a)，表示表达失败。从下游实验中排除这些突变体。 (d) 来自用突变病毒蛋白 L243TAG(*) 共转染的细胞的蛋白质提取物。表达的截短病毒蛋白在大约 40 kDa 处迁移。然而，突变体未能合并 Bpa。从下游实验中排除。 (e) 用突变病毒蛋白 Y193TAG(*) 共转染的细胞的蛋白质提取物。表达的截短蛋白质在大约 30 kDa 处迁移。截短的病毒蛋白的一部分包含 Bpa，并且检测到以约 70 kDa 迁移的全长病毒蛋白 [对应于 (b)]。选择为活细胞 UV 交联显示此模式的衍生物。

D. 活细胞紫外交联

注意：准备一组培养皿，包括非紫外线照射与紫外线照射的病毒基因的野生型或突变衍生物。实验在 10 厘米培养皿中进行，以获得足够的交联产物用于免疫沉淀和质谱分析。

1. 轻轻取出培养基。

2. mL的室温 PBS简单地洗掉任何残留物。

3. 轻轻地将 5 m L的 PBS 添加到板的侧面。

4. 对于 UV 交联，理想的实验是在冷室中进行，因为从这一步开始不需要无菌，尽管条件是干净的。

5. 将细胞水平稳定地放置在冷冻金属板的顶部。

注意：或者，将细胞放在冰上，但由于长时间的紫外线照射会导致冰融化，因此需要经常更换冰。

6. 将一个干净的手持式紫外线辐照器放在无盖培养皿的顶部。将辐照器设置为 365 nm 紫外线，并用铝箔完全覆盖辐照器和培养皿。照射细胞 45 分钟。

注意：便携式手持紫外线照射器很方便。但是，它一次只能容纳有限数量的 10 厘米餐具。可以使用台式紫外线照射器，但它可能具有不同的紫外线强度。在这种情况下，每 20 分钟检查一次曝光时间，以查看细胞是否保持活力。

E. 裂解和分馏

注意：使用两种裂解缓冲液：用于总细胞裂解或核裂解的严格 RIPA 缓冲液和用于细胞质分离的温和 RIPA 缓冲液。通过用各自的缓冲液洗涤 2-3 次，以 5 分钟的间隔预平衡抗标志 M2 珠子。

1. 在冰上工作。

2. 通过轻轻刮擦分离受紫外线照射的细胞并控制非紫外线照射的细胞。

注意：如果细胞分离，轻轻吹打收集。

3. 在 4 °C 下以 200 × g旋转悬浮液3 分钟。

4. 完全去除 PBS。

5. 将细胞颗粒重新悬浮在 900 μL的温和裂解缓冲液中，以获得细胞质部分。或者，将细胞沉淀重悬于 900 μL的严格裂解缓冲液中，以获得总细胞裂解物并继续执行步骤 10 。

6. 添加 1 ×蛋白酶抑制剂并通过移液进行均质化。

注意：避免起泡。

7. 在 4 °C下以 12,000 × g的速度向下旋转10-15 分钟。

8. 将未沉淀的溶液（细胞质部分）转移到新鲜微量离心管中的15 μL预平衡珠子中进行免疫沉淀。或者，将回收的细胞质部分冷冻在-20 °C ，直到以后。

9. μL的严格裂解缓冲液中重新悬浮核颗粒。

10. 在冷冻水浴中进行 10 次 10 秒开/关的声波处理。

注意：避免起泡。

11. 加入 8 μ L 的benzonase，在冷室中旋转 30 min 1 h 或直至细胞裂解液粘度降低。

12. 在 4 °C下以 12,000 × g的速度向下旋转10-15 分钟。

13. 在新鲜的微量离心管中将核部分或总裂解物添加到预平衡的珠子中进行免疫沉淀。或者，将回收的上清液冷冻在-20 °C ，直到进一步使用。

14. 在管旋转器上在 4 °C 下孵育珠子过夜。

F. 交联分析

1. 用相应的缓冲液清洗珠子。

2. 根据各个实验室的标准化协议执行 SDS-PAGE 和蛋白质印迹。带反标记 M2 的探头。

注意：对于可能迁移与重链和轻链相同的蛋白质，请在蛋白质印迹之前进行标记洗脱。较小的蛋白质可以通过 SDS-PAGE 和 Tris Tricine-SDS 运行缓冲液进行分离。

3. 分析结果如下（图 2）：

图 2. 来自 HEK293 细胞的亲和纯化的 HSV-1 ICP22 病毒蛋白，无论是否经过紫外线照射。

(a) 在未转染 (Untr.) HEK293 细胞中，在约 50 kDa 处看到的条带是 IgG 重链。来自免疫沉淀样品的蛋白质印迹信号是特异性的。 (b)来自表达全长野生型 (WT) 病毒蛋白的细胞的蛋白质提取物，其在有或没有紫外线照射的情况下以约 70 kDa 的速度迁移。野生型病毒蛋白可作为鉴定交联蛋白复合物的参考点。 (c)来自用突变病毒蛋白Y 193Bpa共转染的细胞的蛋白质提取物。印迹与 (b) 相当，表明没有可见的交联蛋白复合物。从下游分析中排除这些突变体。 (d)来自用突变病毒蛋白 L191Bpa 共转染的细胞的蛋白质提取物。在约 250 kDa 处可见交联产物。选择为质谱显示此模式的衍生物。 (e)来自用突变病毒蛋白 W240Bpa 共转染的细胞的蛋白质提取物。在约 150-250 kDa 处可见几种交联产物。显示这种模式的衍生物很有前景，可以考虑用于质谱分析。

食谱

1. 温和的 RIPA 缓冲液

10 毫米 HEPES

10 毫米氯化钾

200 毫米氯化钠

0.1 毫米乙二胺四乙酸

0.1 毫米 EGTA

0.5% NP-40

蛋白酶抑制剂混合物

2. 严格的 RIPA 缓冲液

50 毫米 HEPES

1 M 氯化钠

1 毫米 EGTA

1 M 尿素

1% 脱氧胆酸钠

1% NP-40

0.1% SDS

致谢

我们感谢斯蒂芬妮巴克的技术援助。我们感谢以下财务支持：惠康信托调查员奖 WT210641/Z/18/Z 授予 SM； OB 感谢法国国家科学研究中心、高等师范学院和法国国立卫生研究院的支持； NFI 感谢马来西亚高等教育部和马来西亚 IIUM 的支持。该协议源自 Isa等人。（2021 年）。

利益争夺

没有竞争利益。

参考

1. 下巴，JW（2017）。扩展和重新编程遗传密码。自然550（7674）：53-60。

2. Hino, N.、Okazaki, Y.、Kobayashi, T.、Hayashi, A.、Sakamoto, K. 和 Yokoyama, S. (2005)。通过光反应性氨基酸的位点特异性掺入哺乳动物细胞中的蛋白质光交联。 自然方法2（3）：201-206。

3. Isa, NF, Bensaude, O., Aziz, NC 和 Murphy, S. (2021)。 HSV-1 ICP22 是细胞 RNA 聚合酶 II 介导的转录延伸的选择性病毒抑制因子。疫苗9(10)：1054。

4. Kobbi, L.、Demey-Thomas, E.、Braye, F.、Proux, F.、Kolesnikova, O.、Vinh, J.、Poterszman, A. 和 Bensaude, O. (2016)。进化保守的 Hexim1 肽与 Cdk9 催化位点结合以抑制 P-TEFb。 Proc Natl Acad Sci USA 113（45）：12721-12726。

5. Neumann-Staubitz, P. 和 Neumann, H. (2016)。使用非天然氨基酸来研究和设计蛋白质功能。 Curr Opin 结构生物学38：119-128。

6. Wu, X., Spence, JS, Das, T., Yuan, X., Chen, C., Zhang, Y., Li, Y., Sun, Y., Chandran, K., Hang, HC and Peng, T. (2020)。位点特异性照片交联蛋白质组学揭示了 VCP/p97 ATPase 对 IFITM3 贩运和营业额的调节。 细胞化学生物学27（5）：571-585.e576。

7. Xiao, H. 和 Schultz, PG (2016)。在化学和生物合成的界面：扩展的遗传密码。 Cold Spring Harb Perspect Biol 8(9)：a023945。

8. Ye, S., Köhrer, C., Huber, T., Kazmi, M., Sachdev, P., Yan, ECY, Bhagat, A., RajBhandary, UL 和 Sakmar, TP (2008)。使用非天然氨基酸诱变将酮氨基酸位点特异性掺入功能性 G 蛋白偶联受体中。生物化学杂志 283（3）：1525-1533 。