材料和试剂
1.96孔圆底超低附着（ULA）板（Corning，目录号： 7007）
2.0.2 µm 无菌注射器过滤器（聚醚砜膜，VWR，目录号： 28145-501）
3.T-75 组织培养瓶，通气盖，无菌（ Celltreat ，目录号：229341）
4.0.2 µm 无菌真空过滤系统，带聚醚砜用于细胞培养基的膜（VWR，目录号：10040-436）
5.肿瘤细胞：
ES-2（ATCC，目录号： CRL-1978）
NIHOVCAR3（ATCC，目录号： HTB-161）
OVCA433 细胞（杜克大学 Susan Murphy 博士慷慨提供）
注意：实验应限制在培养的细胞少于 10 代。
6.细胞培养基：
ES-2 细胞：Mc oy's 5A + L-谷氨酰胺（Corning，目录号： 10-050-CV），补充 10% FBS
OVCAR3 细胞：RPMI 1640 + L-谷氨酰胺（Gibco，目录号： 11875119），补充有 20% FBS 和 0.01 mg/ mL牛胰岛素
补充 10% FBS的 RPMI 1640 + L-谷氨酰胺（Corning，目录号： 10-040-CV）
注意：使用以下0.2 µm真空过滤器对培养基进行无菌过滤。如果需要，可以将青霉素/链霉素添加到培养基中，具体取决于所使用的细胞系。
7.胎牛血清（FBS）（VWR，目录号： 97068-085）
8.磷酸盐缓冲盐水（PBS，无菌；Corning，目录号： 21-040-CV）
9.0.25% 胰蛋白酶-EDTA（无菌）（Gibco，目录号： 25200114 ）
10.海马XFp FluxPaks包括 Seahorse XFp细胞培养微孔板（8 孔）、 XFp传感器盒（8 孔）和 XF 校准溶液（Agilent，目录号： 103022-100）
11.Seahorse XF 基础分析培养基（DMEM、安捷伦、目录号： 103575-100； RPMI，安捷伦，目录号： 103576-100），在如下所述的测定当天补充，pH 7.4
12.XF 100 mM 丙酮酸溶液（Agilent，目录号： 103578-100）；或者，可以从其他供应商处寻求无菌 100 mM 丙酮酸溶液或在内部制造。
13.XF 200 mM 谷氨酰胺溶液（Agilent，目录号： 1035 79-100），或者无菌 200 mM 谷氨酰胺溶液可以从其他供应商处购买或内部制造。
14.无菌 DEPC 处理的 ddH 2 O（Quality Biological，目录号：351-068-131）；或者可以使用无菌高压灭菌的 ddH 2 O。
15.Pierce TM BCA 蛋白测定（Thermo Scientific，目录号：1859078）
16.氯化钠
17.Tris-HCl pH 8.0（Tris Base；Sigma，目录号：TRIS-RO）
18.NP40/IgepalCA-630（Sigma，目录号：13021）
19.脱氧胆酸钠（Sigma，目录号：D6750）
20.磷酸氢二钠（Sigma，目录号：S9763）
21.磷酸二氢钠（无水；Sigma，目录号：S3139）
22.磷酸钠缓冲液
23.十二烷基硫酸钠（SDS；Sigma，目录号：L3771）
24.乙二腈四乙酸（EDTA；Sigma，目录号：E9884 ）
25.氟化钠（ NaF ；Sigma，目录号：201154）
26.蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific，目录号：87785）
27.D-葡萄糖（Sigma，目录号： G8270）
28.2-脱氧-D-葡萄糖，2-DG（Sigma，目录号： D8375）
29.寡霉素A（Sigma，目录号： 75351）（见配方，表3）
30.FCCP（氰基氰-对-三氟甲氧基苯腙；Sigma，目录号： C2920）（见食谱，表 3）
31.抗霉素A（Sigma，目录号： A8674）（参见配方，表3）
32.鱼藤酮（Sigma，目录号： 45656）（见配方，表3）
33.RIPA 裂解缓冲液（参见配方）
设备
1.Agilent Seahorse XFp细胞外通量分析仪（Agilent，型号：S7802A）
2.加湿细胞培养箱 (37 °C , 5% CO 2 )
3.Non-CO 2加湿细胞培养箱 (37 °C )
4.与 15 mL Falcon 管兼容的组织培养台式离心机（Eppendorf，型号： Centrifuge 5702）
5.×物镜和相机的组织培养光学显微镜
6.层流生物安全柜（Thermo Scientific，型号： 1300 系列 A2）
软件
1.Seahorse Wave Deskt op 2.6软件（安捷伦， https: //www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/seahorse-wave-desktop-software-740897 )
程序
A.球体培养
1.在 T-75 细胞培养瓶中将肿瘤细胞培养至约 70% 的汇合度，并使用针对所选细胞系进行优化的正常补充生长培养基。
2.在 Seahorse 细胞外通量测定前一到三天，用 5 mL 的温 PBS 清洗细胞，并使用 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 通过在 37 °C下孵育10 分钟（对于 ES-2 和 OVCAR3 细胞和 15分钟 OVCA433 细胞。胰蛋白酶消化的时间应针对所使用的细胞系进行优化。
3.使胰蛋白酶/EDTA 失活，收集细胞并以 500 ×离心 g 5 分钟。用 5 mL 的温 PBS 去除胰蛋白酶/培养基并清洗细胞。重复离心并去除 PBS。
4.生长培养基 (5 mL)中重新悬浮细胞。在 1.5 mL 管中，以 1:1 的比例将台盼蓝添加到 0.2 mL 的重新悬浮细胞中，并使用血细胞计或自动细胞计数器通过台盼蓝排除法对活细胞进行计数。通过考虑台盼蓝稀释因子推导出最终细胞数。可以使用替代的细胞计数方法。单个 T-75 瓶卵巢癌细胞通常会产生约 0.8 × 10 6 个细胞/ mL。
5.将细胞稀释至 5 × 10 3 个细胞/mL，并在 200 μL 的生长培养基中每孔移液 1,000 个细胞，将其播种到 96 孔圆底 ULA 板中。
笔记：
a.建议使用圆底 ULA 板，因为这是生产每孔大小均匀的单个球体的最有效方法。这可确保将预定大小和数量的球体准确转移到 Seahorse 检测板（图 1）。
b.确定了卵巢癌细胞系 ES-2、OVCAR3 和 OVCA433 每孔需要 1,000 个细胞，以在 96 孔 ULA 板中形成均匀的球体。每个球体的细胞数可能需要根据使用的细胞系进行优化。应该记住，增加细胞数量可能会导致具有缺氧核心的更大球体，从而可能影响线粒体生物能量学。此外，需要考虑海马应激试验中使用的化合物的足够外显率。

图 1. ES-2 细胞球体前后细胞外通量测定运行的图像。
测定完成后，球体保持完整。比例尺 = 1mm。
6.在正常细胞培养条件下，在加湿细胞培养箱（ 37 °C ，5% CO 2 ）中将 ULA 板中的细胞孵育 24-72 小时。 ULA 条件下的时间取决于实验设计和使用的细胞系。
7.如果将球体的生物能量学与附着的细胞进行比较，请按照步骤 A1 - A4 将细胞直接播种到 Seahorse XFp孔中。每口井播种的细胞数量取决于附着细胞和球体培养细胞之间的增殖率差异，因此，相对于每个 Seahorse 井 x 细胞/球体的球体数量，应在附着条件下镀相同数量的细胞，以进行比较。
B.Seahorse 试剂的制备和检测设置
注意：以下内容应在 Seahorse 细胞外通量检测前一天准备好。
1.μL 的无菌 ddH 2 O 和在实用板井周围的外护城河中添加 400 μL ，对XFp传感器盒进行水合。将传感器盒放入 37 °C加湿的非 CO 2培养箱中过夜。（有关准备墨盒的更多信息，请参阅： https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/how-to-run-an-assay#chapter2_3 ， https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Hydrating_an_XFp_Sensor_Cartridge.pdf ）。
2.打开安捷伦 Seahorse XFp分析仪，确保检测当天机器温度为 37 °C 。
3.打开 wave 桌面软件并导航到模板选项卡。
4.选择XFp单元 Mito 压力测试模板。在“分析导航”中的“组定义”选项卡下，分配实验组，然后在下一个选项卡中与您的组一起设计您的板图。最后，在“协议”选项卡下，使用以下参数设置球体线粒体压力测试测定：
a.3 次重复：混合 3 分钟，测量 3 分钟。
b.在端口 A 中注入寡霉素 A。
c.3 次重复：混合 3 分钟，测量 3 分钟。
d.在端口 B 中注入 FCCP。
e.3 次重复：混合 3 分钟，测量 3 分钟。
f.注射鱼藤酮/抗霉素 A。
g.3 次重复：混合 3 分钟，测量 3 分钟。
5.选择XFp细胞糖酵解压力测试模板。在分析导航中定义您的实验组并设计您的板图。使用以下运行时间设置球体糖酵解压力测试测定的协议：
a.3 次重复：混合 3 分钟，测量 3 分钟。
b.在端口 A 中注入葡萄糖。
c.3 次重复：混合 3 分钟，测量 3 分钟。
d.在 B 口注入寡霉素。
e.3 次重复：混合 3 分钟，测量 3 分钟。
f.在端口 C 中注入 2-脱氧-D-葡萄糖。
g.3 次重复：混合 3 分钟，测量 3 分钟。
注意：上述分析运行协议可能需要针对个别实验设置进行调整。如果在添加药物后指定读数次数后未达到响应平台，则应增加读数次数和测量时间，以确保记录化合物的最大效果。对于致密和较大的球体，建议在添加药物后重复五次混合和测量。
6.将模板保存为新协议并通过网络或 USB 驱动器传输到 Agilent Seahorse XFp分析仪。
注意：有关 Wave 中的实验设计和测定设置的更多信息，请参阅： https: //www.agilent.com/en/product/cell-analysis/how-to-run-an-assay - chapter3_4 ， https:// /www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/S7894-10000_Rev_C_Wave_2_6_User_Guide.pdf ）。
C.将球体转移到海马细胞培养板中
1.在检测当天，准备 Seahorse XF 检测培养基：
a.对于线粒体压力测试，用 1 mM 丙酮酸钠、2 mM 谷氨酰胺和 10 mM 葡萄糖补充 10 mL 的 Seahorse XF 基础培养基（DMEM 或 RPMI，取决于细胞系）。 10 mL 的检测介质足以运行一个XFp微型板并进行化合物稀释。如果检测多个板，或在 XF96 平台上进行检测，则应相应地增加制备的检测培养基的量。
b.对于糖酵解压力测试，用 2 mM 谷氨酰胺补充10 mL 的 Seahorse XF 基础培养基。
注意： Seahorse XF 检测培养基不含碳酸氢钠以保持低缓冲能力。出于同样的原因，建议避免在检测介质中使用血清。如果细胞在测定运行期间对缺乏 FBS 敏感，则可以测试添加 1% 的 FBS。
2.在使用 HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.4 之前，将测定介质加热至 37°C。使用 0.2 µm 注射器过滤器过滤消毒。
3.– 2 小时将球体从圆底 ULA 孔板移入XFp细胞培养板，使用以下步骤 (C4 – C10)：
4.用 Seahorse 检测培养基替换每个 ULA 板孔中的生长培养基。使用 P200 移液器小心地取出 180 μL 的生长培养基（从 96 孔 ULA 板中），方法是倾斜板并将移液器尖端朝向孔的上背部倾斜，避免吸入球体，球体将出现在中心圆底ULA井。每个 ULA 板孔应包含一个球体。在显微镜下检查水井是否因抽吸过程而丢失球体。
5.通过将介质缓慢移到井侧，小心地将 200 μL 的 Seahorse 检测介质添加到每个 ULA 井中。
6.使用 P200 移液器取出 180 μL 的 Seahorse 检测介质，如步骤 C4 中所示。多道移液器也可用于执行洗涤步骤 (C3 – C5)。
7.重复步骤 C3 - C5 以确保生长培养基中残留的碳酸氢钠最少。
如果认为有必要，可以添加额外的洗涤步骤 (C4 – C5)。
8.使用 P1000 移液器小心地将每个球体从 ULA 孔中吸取到剩余液体 (~40 µL) 中，然后将其转移到 Seahorse XFp细胞培养微孔板的孔中（孔 B – G）。在显微镜下观察 ULA 孔和XFp微型板孔，以确保成功转移。
9.XFp细胞培养板孔中转移所需数量的球体。每个XFp井的最佳球体数量应根据经验确定（图 2）。让球体沉降到底部，并将井中的介质体积调整到总共 180 μL。
10.XFp细胞培养微孔板的 A 和 H 孔中。不要将球体添加到这些孔中，因为它们在测定中用作空白参考。
11.在测定运行之前使用显微镜检查孔并使用低放大倍率物镜拍摄图像（图 1）。这是为了确保成功转移每个井中的球体，并在转移失败的情况下根据需要调整球体的数量。
12.将含有球体的XFp细胞培养微孔板放入 Seahorse 测定介质中，在测定前 60 分钟放入加湿的 37 °C非 CO 2培养箱中，以对板进行脱气。这确保了在测定中测量 O 2和 H +之前，CO 2从细胞和培养基中扩散。

图 2 。球体数量和 ULA 培养时间的优化。
A. OVCAR3 球体转移到XFp微细胞培养板孔后的图像。比例尺=1 毫米。 B. 使用 Seahorse XFp细胞外通量分析仪从每个孔中指定数量的球体获得基础 OCR 测量值。在测定之前，将球体在 ULA 板中培养 24 或 72 小时（n = 2，显示平均 OCR）。
D.Seahorse XFp线粒体压力测试
1.在化验当天，从水合XFp传感器盒中取出 H 2 O，并更换为200 µL预热的 XF 校准品。留在 37 °C加湿的非 CO 2培养箱中，直到检测运行。
2.在无菌条件下准备线粒体压力测试试剂（详细信息请参阅食谱部分）。通过使用预热的 XF 检测介质将库存溶液稀释至所需浓度，制备 300 μL的 10 ×试剂（参见表 1）。寡霉素和 FCCP 的最佳浓度可以根据每个细胞系的经验确定进行调整。建议通过测试 FCCP 0.125–2 µM 和寡霉素 A 0.5–2 µM 之间的最终孔浓度范围来确定产生最大响应的最佳浓度。
请参考以下方法进行寡霉素 A 和 FCCP 滴定测定： https ://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/New_Cell_Line_Characterization.pdf 。
表1 。线粒体应激试验复合溶液的制备。
3.将 10 ×浓缩试剂装入水合传感器盒的药物注射口，体积如表 1 所示。移液时应小心，以确保均匀加载并避免产生气泡，这会干扰注射化合物（图 3A）。

图 3。用测试化合物加载墨盒端口。
A. 线粒体压力测试。 B. 糖酵解压力测试。
有关将化合物装入试剂盒的更多详细信息，请参见： https : //www.agilent.com/en/product/cell-analysis/how-to-run-an-assay#chapter3_4，https://www.agilent .com/cs/library/usermanuals/public/Loading%20Cartridge%20XFp.pdf 。
4.XFp Analyzer 主页视图上的开始按钮以查看可用的分析模板列表。通过选择在步骤 B4 中创建的协议来运行Agilent Seahorse XFp细胞线粒体压力测试。分配实验组后，单击协议页面和“开始检测”。
5.将实用板与水合传感器盒和装有线粒体压力测试试剂的加载端口放在仪器托盘上。确保已卸下墨盒盖并将板放置在正确的方向。单击继续启动机器校准（约 20 分钟）。
6.校准后，取下实用板并更换为包含球体的 Seahorse XFp细胞培养微型板。确保已取下细胞培养板盖并将培养板放置在正确的方向。按“继续”开始检测。
E.Seahorse XFp糖酵解压力测试
1.在检测当天，取出 diH 2 O 从水合的XFp传感器盒中取出，并用200 µL XF 校准液替换。留在 37 °C加湿的非 CO 2培养箱中，直到检测运行。
2.下制备糖酵解压力测试试剂（详见配方部分）。通过使用预热的 XF 检测介质将库存溶液稀释至所需浓度，制备 300 μL的 10 ×试剂（参见表 2）。寡霉素的最佳浓度可以根据每个细胞系的经验确定来调整。

表 2 。糖酵解应激试验复合溶液的制备。
3.将 10 ×浓缩试剂装入水合传感器墨盒的药物注射端口，按表 2 中所示的体积。移液时应小心，以确保负载相等并避免产生气泡（图 3B）。
4.XFp Analyzer 主页视图上的开始按钮以查看可用的分析模板列表。通过选择在步骤 B5 中创建的方案，运行 Agilent Seahorse XFp细胞糖酵解压力测试。分配实验组后，单击 Protocol 页面和“Start Assay”。
5.按照步骤 D5-6 继续。
F.正常化
1.测定完成后，如步骤 C11 所示，取出细胞培养小板并对球体进行成像，以确保球体的完整性和球体在测定后运行后的均匀分布（图 1）。
2.在数据分析之前，选择一种方法来标准化结果。数据规范化的示例包括：
a.每口井的球体数量。在测定之前，将相等数量的球体镀入测定板孔中。这可以通过使用 96 孔 ULA 板来培养球体来实现，因为这些往往会在每口井中生成一个球体。因此，所需球体/测定孔的确切数量可以准确地转移到测定孔板中。测定后，对孔进行成像以再次计数球体的数量，以确保在测定过程中不会发生球体的损失或破裂。然后将 OCR 和 ECAR 值除以每个测定孔的球体数量并表示每个球体（例如，OCR： pmol /min/球体）。当实验参数的操作预计不会改变球体的形态或大小时，这种方法是合适的，并且当井的球体数量变化时可能很有用。
b.每孔的总细胞数。这种标准化考虑了每个球体的细胞总数和每口井的球体总数。在比较作为球体培养的细胞与在附着条件下培养的细胞之间的 OCR 和 ECAR 值时，每个细胞的这种标准化是一种合适的方法。通过将单个球体的初始播种密度乘以每个XFp井的球体最终数量来计算细胞总数。为了与附加条件进行比较，将相同的细胞总数/孔直接接种到 Seahorse 测定板中。 OCR 和 ECAR 测量值随后以每个细胞表示（例如，OCR： pmol /min/cell）。应该进行这种标准化以确定每个球体的细胞密度是否会影响生物能量学。如果需要，可以在测定后再次确定细胞计数。从测定孔中收集球状体，转移到 1.5 mL Eppendorf 管中，离心（500 × g 5 分钟），并重新悬浮在 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 中。在 37°C 下孵育 5 分钟，并在加入 1:1 台盼蓝溶液后轻轻重悬，然后使用血细胞计数器或其他首选的细胞计数方法对细胞进行计数。
c.每孔的蛋白质浓度。测定后从测定孔中收集球状体，转移到 1.5 mL Eppendorf 管中，离心（500 × g 5 分钟），吸出培养基，将细胞重悬于 50 μL裂解缓冲液中，然后使用首选方法（例如二辛可宁酸 (BCA) 蛋白质测定法）进行蛋白质定量。每孔的总蛋白质用于标准化各孔的 OCR 和 ECAR 测量值（例如，OCR： pmol /min/mg 蛋白质）。对于不同球体大小的样本，应该使用这作为归一化的方法。
注意：建议在测定后保存细胞，以允许蛋白质含量正常化，以及球体和细胞数量。
3.从 Agilent Seahorse XFp分析仪导出分析结果。添加归一化值并使用 Agilent Seahorse Wave 软件分析数据。
数据分析
1.使用标准化结果通过 Wave 软件生成线粒体压力测试报告或糖酵解压力测试报告，或将结果导出软件并继续使用读取测量值来提取以下数据：
2.线粒体压力测试：
a.确定化合物添加后的哪些重复测量代表线粒体压力测试中对每种化合物的最大响应。
b.基础线粒体 OCR：从注射前的基础 OCR 读数中减去非线粒体 OCR（添加抗霉素 A/鱼藤酮后的剩余 OCR）。
c.ATP-linked OCR：从基础 OCR 测量（注射前的基线测量）中减去 ATP 合酶抑制后获得的 OCR（寡霉素注射后的最低 OCR 读数）。
d.最大呼吸：从注射线粒体解偶联剂 FCCP 后的最高 OCR 测量值中减去非线粒体 OCR（添加抗霉素 A/鱼藤酮后剩余的 OCR）。
e.呼吸储备：从添加 FCCP 后给出最大 OCR 的测量值中减去基础（第一次注射前的基线测量值）OCR 测量值。
注意：对 FCCP 的响应时间在球体中是可变的，并且取决于细胞系。应使用最大 OCR 读数来推导呼吸储备计算。对于每个细胞系，最大响应时间应根据实验复制中对 FCCP 响应的一致性来确定。
f.H +质子泄漏：从 ATP 合酶抑制后的 OCR 中减去最后一次 OCR 测量值（鱼藤酮/抗霉素 A 注射后）（寡霉素注射后的最低 OCR）。
g.OCR/ECAR 比率表明线粒体呼吸对糖酵解的相对贡献。这可以表示为基础 OCR 测量值/基础 ECAR 测量值的比率，或如图 4 所示绘制。
3.糖酵解压力测试：
a.确定化合物添加后的哪些重复测量代表对每种化合物的最大响应，并将其用于以下计算。
b.基础糖酵解：从添加葡萄糖后的最高 ECAR 中减去用 2-脱氧-D-葡萄糖抑制糖酵解后的 ECAR 测量值。
c.最大 ECAR：寡霉素 A 注射后的最高 ECAR 测量值。
d.糖酵解能力：从添加寡霉素 A 后的最大 ECAR 中减去用 2-脱氧-D-葡萄糖抑制糖酵解后的 ECAR 测量值。
e.糖酵解储备：从添加寡霉素 A 后的最大 ECAR 中减去添加葡萄糖后的最大 ECAR。
4.使用首选的分析和绘图软件来分析统计数据并生成数据图表。
5.其他资源提供了有关上述计算的信息（Hill等人，2012；Dier等人，2014；Divakaruni等人，2014；Plitzko 和 Loesgen，2018）。
代表性结果
图2 说明了优化每孔球体数量和 ULA 培养时间的需要。为了获得单个均匀的球体，将 1,000 个 OVCAR3 细胞每孔接种在 96 个圆底 ULA 板中，并在不依赖锚定的情况下培养 24 或 72 小时，然后转移到 Seahorse 细胞培养测定板。球体在运行前进行了成像，以确认完整球体的成功转移和均匀分布（图 2A）。基础氧气消耗率显示为每口井的球体数量增加（5、10 和 15，图2B）。 OCR 水平的增加反映了每口 Seahorse 井中球体数量的增加。虽然这表明对球体计数的标准化可以允许比较具有随机数量的初始球体播种的组，但建议在实验组之间比较相同数量的球体。对于使用的每种细胞系，研究人员应优化锚定独立性所花费的时间（测定前在 ULA 中培养）、初始细胞播种密度（每个球体的细胞）和细胞外通量测定中的球体/孔数。
锚定独立时间会影响球体的线粒体呼吸功能，并且取决于细胞系。例如，随着时间的推移，OVCAR3 细胞在不依赖锚定的情况下变得不那么有活力（24 小时对 72 小时），从而降低 ECAR 和 OCR。相反，随着时间的推移，ES-2 细胞在锚定独立性方面变得更有活力（图 4A 和 4B）。这可能是细胞在不依赖锚定的条件下继续增殖的结果，正如之前在 ES-2 细胞中观察到的那样（图 1 和 2A； Dier 等人，2014）。相反，OVCAR3 细胞在 ULA 板中随着时间的推移保持相似的球体大小，表明处于静止状态。在比较不同时间点的 ECAR/OCR 比率时，ES-2 细胞在 ULA 板中随着时间的推移相对于 OCR 减少 ECAR，这表明可能从依赖糖酵解转向氧化磷酸化（图 4C）。相比之下，OVCAR3 细胞的 ECAR/OCR 比率在 24 小时和 72 小时都保持不变。这个例子说明了细胞在锚定独立性方面的行为不同，并且标准化需要根据实验设计进行调整。在这种情况下，建议将测定后的细胞数或蛋白质含量标准化作为解释增殖变化的附加步骤。

图 4。 ULA 培养条件下不同细胞系的生物能量学特征和时间依赖性。
A. OCR 测量显示在线粒体压力测试测定 (n=6) 的过程中。在线粒体压力测试中，使用了 1.0 µM寡霉素和 1.0 µM FCCP 。 B. 基础 OCR 和 ECAR 值表明细胞系之间的生物能量变化不同，因为细胞在不依赖贴壁的培养条件下维持不同的时间。 C. ECAR/OCR 比率提供了关于锚定独立中氧化磷酸化相对变化的信息。
为了将肿瘤球体的生物能量分布与在附着条件下培养的相同细胞进行比较，在进行线粒体压力测试测定之前，将细胞系在 96 孔 ULA 板（每孔 1,000 个细胞）中培养 24 小时（图 5）。为进行分析，使用 10 个球体/孔，并将这些细胞与附着条件下的细胞进行比较，这些细胞以 10,000 个细胞/孔的密度（与 10 个球体/孔相比，每个孔由 1,000 个细胞制成的细胞数相同）接种到在测定前 24 小时使用海马细胞培养微孔板。在测定当天，将球体转移到同一微型细胞培养板中剩余的空孔中。线粒体压力测试分析表明，培养为球体的细胞与其附着的对应物相比可以具有不同的生物能量分布（图 5A - 4B），并且它们对 ULA 培养的代谢反应在 ES-2 和 OVCAR3 细胞之间再次不同。

图 5.附着和不依赖锚定条件之间的生物能量学变化。
A. OCR 和 ECAR 在线粒体压力测试测定期间测量（1.0 µM 寡霉素和 1.0 µM FCCP；n=9 OVCAR3；n=6 ES-2）。 B. 基础 OCR 和 ECAR 测量图显示了在附着和 ULA 条件下培养的 OVCAR3 和 ES-2 细胞的生物能表型。 C. 如上文“数据分析”中所述的线粒体压力测试分析示例（多个未配对 t 检验）。
值得注意的是，与附着细胞相比，OVCAR3 球体中 ECAR 的减少，以及 ES-2 细胞球体中呼吸储备的增加，这表明不同的机制有助于从糖酵解转变为依赖两个细胞系之间球体中的线粒体呼吸（图 5C）。此外，我们利用细胞外通量测定通过对高级浆液细胞系 OVCA433 进行糖酵解压力测试来比较附着和不依赖锚定的球体的糖酵解活性。对于使用糖酵解应激生成的数据示例，我们请读者参考我们之前的出版物（Kim等人，2020）。简而言之，糖酵解压力测试同样证明，球体中的细胞主要利用葡萄糖进行呼吸，而在附着条件下培养的相同细胞主要利用葡萄糖进行糖酵解（Kim等人，2020）。
笔记
1.根据细胞系和球体大小，每口井只需 5 个球体即可检测到耗氧量。然而，由于板上球体的分布不同，低球体数量会在 OCR 读数中产生更大的可变性，这可能是由于球体的分布距离检测探头太远。为了避免 OCR 读数的变化，建议将球体电镀到三个井柱之间的每个井的中心。
2.XFp平台具有与每板少量检测孔相关的限制。如果要比较控制组和实验组，我们建议每个板运行三个技术复制。如果要比较两个实验组和一个对照，可以运行两个技术复制，或者每个实验组与单独板中的对照进行比较。对于较大的实验组，建议将检测放大到 XF96 格式。
3.为了使这种方法适应 XF24 平台井的较大表面积，我们建议优化球体数量并根据制造商的协议缩放测试化合物的体积。 Seahorse 捕获屏幕（Agilent，目录号：101122-100）可用于 XF24 平台培养板，该平台可以替代松散聚集的细胞并在测定期间保持球体的完整性。
4.Seahorse XF 细胞有丝分裂压力测试试剂盒（Agilent，目录号：103010-100）和 seahorse XF 细胞糖酵解压力测试试剂盒（Agilent，目录号：103017-100）是线粒体和糖酵解压力测定中使用的化合物的替代来源.
食谱
1.准备化合物的库存浓度
a.使用 DMSO 溶解化合物。
表 3 。线粒体压力测试复合储备溶液。
*寡霉素 A、FCCP 和 AA 可溶于 DMSO。等分并储存在-20°C。
**鱼藤酮以 50 mg/mL 的浓度溶于氯仿，或以 0.5 mg/ mL 的浓度溶于 DMSO。由于氯仿的挥发性，我们选择在 DMSO 中稀释以进行长期储存。然而，如果需要，可以在氯仿中制备鱼藤酮。分装并储存在 -80°C。
b.使用适当的检测介质将 DMSO原液稀释至 Seahorse XFp检测方案中使用的 10 – 50 μ M 10 ×工作储备溶液。注意：将抗霉素 A 和鱼藤酮以 1: 1的比例混合，以获得 25 μM 的终浓度。
c.糖酵解压力测试的其他复合制剂：
D-葡萄糖：在无菌 diH 2 O中制备 1 M 和 100 mM 储备溶液。
2-脱氧-D-葡萄糖：在无菌 diH 2 O中制备 500 mM 储备溶液。
2.RIPA 裂解缓冲液
浓度下将以下组分添加到 500 mL 的最终体积来制备 RIPA 缓冲液：
•50 mM Tris-HCl pH 8.0（为了制备 1 M Tris-HCL pH 8.0 储备溶液，将 121.1 g Tris 碱溶解在 800 mL H 2 O 中，并通过添加浓 HCl 将 pH 调节至 8.0，然后再调整体积至 1 升）
•150 毫米氯化钠
•1% NP40/伊格帕尔
•1% 脱氧胆酸钠
•2 O的最终体积中制备 0.5 M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠原液，将每种原液稀释至 0.1 M，并调整 0.1 M 磷酸氢二钠溶液至 pH 7.2，通过添加 0.1 M 磷酸二氢钠溶液）
•0.1% SDS
•2 毫米乙二胺四乙酸
•50 毫米氟化钠
储存在 4 °C 。使用前，将 10 mL 等分到 Falcon 管中，加入 1 片蛋白酶抑制剂鸡尾酒片，然后溶解。
致谢
这项工作得到了 NIH 赠款 R01CA242021 (NH) 和 R01CA230628 (NH & MK) 的支持。该协议源自我们之前的出版物： Kim YS等人，SIRT3 的上下文依赖性激活对于卵巢癌细胞的锚定非依赖性存活和转移是必要的。癌基因。 2020 年 2 月；39(8):1619-1633 （ Kim等人，2020 年）。
利益争夺
Agilent Seahorse XFp细胞外通量分析仪 (S7802A)通过安捷伦的设备赠款授予 Nadine Hempel。
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