材料和试剂
A. 脂质
1. 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱[POPC]（Avanti Polar Lipids，目录号：850457）
2. 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸[POPS]（Avanti Polar Lipids，目录号：840034）
3. 胆固醇（羊）[ chol ]（Avanti Polar Lipids，目录号：700000）
4. 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-（1'-肌醇-3'-磷酸）[PI（3）P]（Avanti Polar Lipids，目录号：850150）
5. 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素（聚乙二醇）-2000] [DSPE-PEG 2000生物素] （Avanti Polar Lipids，目录号：880129）
6. 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（ lissamine rhodamine B sulfonyl）[DPPE-Rhodamine]（Avanti Polar Lipids，目录号：810158）
注：所有脂类均溶于氯仿，终浓度为 10 mg·mL -1 ，可在 -20°C 下保存长达一个月。
B. 试剂
1. 来自蛋清的抗生物素蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A9275）
2. 牛血清白蛋白[BSA]（Sigma-Aldrich，目录号：A8806）
3. 生物素化 BSA（Thermo Fisher Scientific，目录号：29130）
4. 氯仿（Merck， Supelco ，目录号：288306）
5. 无水乙醇（Merck，目录号：1009831011）
6. 甲醇（Merck，目录号：34860）
7. Milli-Q ®水（Millipore 系统）
8. 聚乙烯醇[PVA]（大约MW 145,000 g·mol -1 ，Merck，目录号：814894）
9. 聚乙二醇异硫氰酸荧光素[PEG-FITC]（ Nanocs ，目录号：PG1-FC-40k）
10. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
11. Trizma ®盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：T6666）
12. 恶性疟原虫中纯化的重组 PfBro1 和 PfVps32 （Avalos-Padilla等人，2021b）
13. 溶组织大肠杆菌中纯化的重组 EhVps20t 和 EhVps32 （ Avalos-Padilla等人，2018 年）
14. PVA 溶液 (5% w/v)（见配方 1）
15. 脂质混合物 (1 mg·mL -1 ) 用于将重组恶性疟原虫PfBro1 和 PfVps32 注射到由 POPC:POPS:DSPE-PEG 2000生物素: DPPE-罗丹明制成的囊泡中（参见配方 2）
16. 脂质混合物 (1 mg·mL -1 ) 用于将重组溶组织大肠杆菌EhVps20t 和 EhVps32 注射到由POPC:POPS:chol:PI (3)P:DSPE-PEG 2000生物素: DPPE-罗丹明制成的囊泡中（参见配方 3 )
17. 蛋白质缓冲液 1×，pH 7.4（见配方 4）
注意：恶性疟原虫蛋白（PfBro1 和 PfVps32）和溶组织梭菌蛋白（EhVps20t 和 EhVps32）的纯化遵循常规的亲和纯化方案，使用重组蛋白中存在的 GST-tag 和 GSH-Sepharose 4B 进行捕获. GST 标签随后被去除，重组蛋白通过尺寸排阻色谱法纯化，分别在( Avalos-Padilla et al., 2021b )和( Avalos-Padilla et al., 2018 )中详述。
C. 消耗品
1. 具有细丝的薄壁硼硅酸盐毛细管（内半径：0.78 mm，外半径：1 mm），用于制造注射微量移液器（Harvard Apparatus，目录号：30-0038）
2. 盖板玻璃（Menzel Gläser ，26 mm × 56 mm，0.17 mm 厚，定制）
3. Hamilton注射器1 mL（Carl Roth，目录号：EY44.1）
4. 0.22 µm 膜过滤器（ Milex -GV，目录号：SLGVR04NL）
5. 硅胶膏（ Korasilon -Paste，Carl Roth，目录号：0857.1）
6. 2毫米厚自制特氟龙垫片（长/宽40/22毫米），见图2
7. Eppendorf ® microloader 20 µL 吸头（Eppendorf，目录号：5242956003）
8. 用于脂质储备溶液的玻璃小瓶（DKW Life Science，目录号：11768929）
9. PVA溶液的玻璃小瓶（ rollrandglaeser ；Carl Roth，目录号：X661.1）
10. 移液器吸头（容量 1,000 µL；Merck，目录号：AXYT1000B）
11. 称重盘ROTILABO ® （Carl Roth，目录号：2149.2）
12. Osmomat 3000的测量容器（ Gonotec ，目录号：30.9.0010）
设备
1. 烤箱（Thermo Fisher Scientific ，Heraeus Vacutherm ）
2. 真空泵（ Vacuubrand ，型号：MZ 2C NT+2AK ）
3. 微量移液器拉拔器（Sutter Instruments，型号：P-97）
4. 微量移液器机械手系统（Sutter Instruments，型号：MPC-385）
5. 显微注射器（Eppendorf，型号： FemtoJet 5247）
6. 共聚焦显微镜（配备油浸物镜的 Leica TCS SP5，63 ×，NA 1.4 ）
7. 真空干燥器ROTILABO ® （Carl Roth，第 1008.1 号文章）
8. Milli-Q ®系统（SG 水净化系统，Integra UV plus，18.2 MΩ·cm ）
9. 可变容量移液器（0.1 - 2 µL，0.5 - 10 µL，100 - 1,000 µL，Eppendorf ® ）
10. 磁力搅拌器（IKA Werke Staufen ，型号： Bigsquid ）
11. 磁力搅拌棒（ Fisherbrand ，目录号：11834792）
12. （ Gonotec ， Osmomat 3000 冰点渗透压计）

程序
完整的协议总结在图 1 所示的流程图中。

图 1. 将 ESCRT-III 蛋白注入粘附 GUV 的完整方案流程图。
A. 通过 PVA 凝胶辅助溶胀形成 GUV
1. 用水、乙醇和水连续冲洗 26 mm × 56 mm 玻璃载玻片；在 N 2气流下干燥。每个测试条件都需要一张单独的幻灯片。
2. 将 50 μL 的 5% w/v PVA 溶液（参见配方 1）放在清洁的玻璃滑梯上，并用微移液器尖端传播。
3. 将玻璃在烤箱中在 50°C 下孵育至少 30 分钟。
4. 根据要检查的蛋白质类型，制备 POPC:POPS: DSPE-PEG 2000 Biotin:DPPE-Rhodamine或POPC:POPS:chol:PI (3)P:DSPE-PEG 2000 Biotin:DPPE-Rhodamine的混合物（见配方 2 和 3) 在氯仿中，最终浓度为 1 mg·mL -1 。
5. 用氯仿彻底清洁汉密尔顿注射器，并使用注射器的针头将 10 至 15 μL 的脂质混合物涂抹在玻璃上干燥的 PVA 薄膜上（从烤箱中取出而不冷却），直到幻灯片看起来干燥。
6. 将载玻片在真空下放置 1 小时，以消除多余的氯仿。
7. 用干燥的脂质膜将聚四氟乙烯垫片（通过硅脂）粘到玻璃上（参见图 2A）。
8. 用 1，800 μL 的 1× 蛋白质缓冲液填充腔室（参见配方 4），并在 Teflon 垫片顶部放置一个玻璃盖玻片（参见图 2B），以避免不必要的蒸发。

图 2. 用于凝胶辅助溶胀的 GUV 室。
Teflon 垫片位于两个盖玻片之间（见面板 B）。底部玻璃涂有 PVA，脂质在其中沉积。白色椭圆大致表示沉积脂质混合物的区域。
9. 在室温下孵育 10 分钟，以允许肿胀和 GUV 形成。
10. 此后，在生长室底部轻轻敲击几次，将上盖玻片滑到一边，然后使用 1，000 μL 移液器尖端收集 GUV，而不接触 PVA 薄膜，以避免收集 PVA 碎片。收集的 GUV 必须放在玻璃容器中，避光以避免氧化，并在室温 (~21°C) 下储存。溶液应新鲜使用，即使在制备后第二天使用的 GUV 溶液的行为没有观察到差异。
B. 微量移液器的制造和装载
1. 取一个硼硅酸盐毛细管并小心地将 N 2流过它，以确保毛细管没有堵塞。
2. 将毛细管放在微量移液器拉拔器的支架上（图 3）。

图 3. 放置在微量移液器拉拔器中的毛细管。
3. 使用单线程序拉毛细管，以在微量移液器拉拔器中实现约 250 nm 的蜂针孔（HEAT Ramp；PULL 100、VEL 10、TIME 250、PRESSURE 500´）。
4. 过滤注射溶液（2.4 µM PfBro1，以及 4.8 µM 的 PfVps32 或 PfVps60 溶解在 0.8× 蛋白质缓冲液中，或 0.6 µM EhVps20t 和 2.4 µM EhVps32 ，以及 3 × 10 -2 mg·mL -1 PEG-FITC，以监测注射；如果其中一种蛋白质被荧光标记，则省略添加 PEG-FITC）通过 0.22 µm 过滤器。
5. microloader移液器尖端 (图 4)用 10 μL 的过滤蛋白质溶液填充微移液器。
6. 轻轻敲击填充的微量移液器，将其垂直放置 30 分钟以消除气泡。

图 4. 将 ESCRT 蛋白加载到注射微量移液器中。
装载器尖端的细丝尽可能深地插入注射微量移液器中。将加载溶液移入微量移液器中，并在加载 10 μL 后缓慢拉出微加载器。
C. 用抗生物素蛋白涂层盖玻片和固定 GUV
1. 通过用水、乙醇和水连续冲洗来清洁 26 mm × 56 mm 盖玻片；在 N 2气流下干燥。
2. 使用 100 μL 的 1:1 (v/v) BSA (1 mg·mL -1 ) 和生物素-BSA (1 mg·mL -1 ) 混合物对盖玻片进行功能化，溶解在1 ×蛋白质缓冲液中，按照前面的步骤报告协议（ Maan 等。 , 2018) 。
3. 在室温下孵育 20 分钟。
4. 用水冲洗玻璃并涂抹 100 µL 的 5 × 10 -3 mg·mL -1抗生物素蛋白溶液（1× 蛋白缓冲液）。
5. 在室温下孵育 5 分钟。
6. 用水冲洗玻璃以去除未结合的抗生物素蛋白。
7. 将 Teflon 垫片（带有硅胶膏）粘在玻璃上，形成观察室。
8. 用移液器将收集的 GUV 转移到观察室，让它们沉淀至少 10 分钟。 DSPE-PEG 2000 生物素（在囊泡膜中）与盖玻片上的抗生物素蛋白结合，导致囊泡固定化。
注意：抗生物素蛋白浓度的增加会导致 GUV 与玻璃表面的结合程度更高，这随后会阻碍出芽，因为囊泡的多余区域被用于粘附（参见图 5）。
图 5. 固定囊泡的侧视图（此处为POPC:POPS:chol:PI (3)P:DSPE-PEG 2000生物素:DPPE-罗丹明，摩尔比为 60.9:10:25:3:1:0.1）。
用生物素-BSA (1 mg·mL -1 )和BSA (1 mg·mL -1 )的1:1混合物包被盖玻片，然后沉积亲和素。囊泡通过垂直共焦横截面可视化。颜色是反转的。比例尺对应于 10 µm。
D. GUV的注射和观察
1. 将带有固定 GUV 的观察室放在显微镜台上。
2. 将填充的微量移液器连接到微量注射器的支架上（图 6）。

图 6. 微量注射器微量移液器支架与显微操作器的连接。
3. 用移液器将支架连接到显微机械臂的机械臂上。
4. 将注射角度设置为显微镜设置允许的最大角度（参见图 7）。
注意：理想的注射角度为 90°，以避免在穿刺尝试期间囊泡横向位移。然而，这是无法实现的，因为显微镜的聚光镜占据了样品上方的空间。

图 7. 注射过程的微量移液器设置。
A：设置的俯视图；为清楚起见，移除了观察室。 B：喷射角度的特写侧视图。请注意，微量移液器支架尽可能靠近显微镜的聚光镜，以确保高注射角度。
5. 使用显微操作器，将微移液器引入观察室的溶液中，并专注于移液器的尖端。
6. 将显微镜设置为所需的观察设置。对于此处介绍的测量，它们如下：
• DPPE-罗丹明染料（集成在 GUV 的膜中）用 561 nm 二极管泵浦固态激光器激发，并在 570 – 650 nm 范围内收集信号。
• PEG-FITC 染料用 488 nm 氩激光激发，并在 495 – 530 nm 范围内收集信号。
• 为了避免不同荧光信号之间的串扰，进行了顺序扫描。
7. 将微量移液器放在没有观察到 GUV 的位置并清除它（通过按下微量注射器的“清洁”底部）以确认微量移液器没有堵塞；应检测离开移液器吸头的荧光染料发出的信号。
8. 降低微量移液器接近但仍高于 GUV 的焦平面。
9. 用微量移液器的尖端从上方接近选定的 GUV；所选囊泡应清洁且无缺陷（为确保这一点，请使用 XYZ 扫描检查所选 GUV）。
10. 将微量移液器提升到囊泡上方几微米（微量移液器尖端失焦）。
11. 通过在 Z 和 X 方向上将微移液器移向囊泡，刺穿老大。
12. 执行 XYZ 扫描以确保微量移液器渗透到老大。
13. 开始记录时间序列。
14. 使用显微注射器的以下参数注射囊泡（参见图 8 和图 9）：注射压力：150 hPa ；注射时间：5秒；补偿压力：1 hPa 。这些参数确保注射量在亚皮升范围内（几百飞升）。
15. 将微移液器从老大内部拉出（在 Z 方向提起微移液器）。
16. 执行 XYZ 扫描以检测向外芽形成的焦平面（图 8、图 9）。
注意：紧张的囊泡比波动的囊泡更容易穿刺。

图 8. 水平 (XY) 共焦横截面覆盖有相差图像，显示注入 GUV 与 PEG-FITC 溶液（顶行）或纯化的恶性疟原虫ESCRT-III 蛋白（底行）。
膜呈红色，PEG-FITC 呈绿色。在每个序列的前两帧中，可以在膜上注意到注射吸管的尖端。上排代表对照实验（注入不含ESCRT的缓冲液，因此未观察到向外的芽）。相反，当注射ESCRT-III重组蛋白时，会形成向外的芽；另见视频 1。最后一帧上的箭头指向向外的芽。改编自Avalos-Padilla等人。（ 2021b ）。

恶性疟原虫ESCRT-III 蛋白注射 GUV 。
实时录音。描述系统的具体信息在图 8 的标题中指示。

图 9. 用 PEG-FITC 溶液（上排）或纯化的溶组织大肠杆菌ESCRT-III 蛋白（下排）注射 GUV 的水平 (XY) 共焦横截面。
膜以洋红色显示，而 PEG-FITC 以青色显示。可以在每个序列的前两帧上看到注射吸管的尖端。最后一帧上的箭头指向向外的芽；另见视频 2。最后一张快照中的插图显示了来自同一囊泡但在另一个 XY 平面的向外芽的放大视图。

视频2.用纯化的E. histolytica ESCRT-III 蛋白注射 GUV。
实时录音。描述系统的具体信息在图 9 的标题中指示。

食谱
1. PVA 溶液 (5% w/v)
a. 称量 0.5 g PVA 并将其放入玻璃小瓶中。
b. 添加 10 mL 的 1 × 蛋白质缓冲液（以保持渗透压）并在小瓶中放置一个干净的磁力搅拌器。
c. 将溶液保持在 90 °C水浴中，持续搅拌（300-400 rpm），直到 PVA 完全溶解。溶液变得清澈。
2. 脂质混合物 (1 mg·mL -1 ) 用于将重组恶性疟原虫PfBro1 和 PfVps32注射到由POPC:POPS: DSPE-PEG 2000 Biotin:DPPE-Rhodamine制成的囊泡中（最终体积：200 µL）：
脂质（储备溶液）和试剂浓度（mg·mL -1 ）体积 (µL) 最终摩尔分数 %
持久性有机污染物 10 15.78 78.9
持久性有机污染物 10 4.00 20.0
DSPE-PEG 2000 生物素 1 2.00 1.0
DPPE-罗丹明 0.25 1.00 0.1
氯仿 177.22
3. 脂质混合物 (1 mg·mL -1 ) 用于在由POPC:POPS:chol:PI (3)P:DSPE-PEG 2000 Biotin:DPPE-Rhodamine制成的囊泡中注射重组溶组织大肠杆菌EhVps20t 和 EhVps32 （最终体积：200 µL）：
脂质（储备溶液）和试剂浓度（mg·mL -1 ）体积 (µL) 最终摩尔分数 %
持久性有机污染物 10 12.18 60.9
持久性有机污染物 10 2.00 10.0
胆 10 5.00 25.0
PI(3)P（溶于氯仿/甲醇 60:40） 0.25 24.00 3.0
DSPE-PEG 2000 生物素 1 2.00 1.0
DPPE-罗丹明 0.25 1.00 0.1
氯仿 153.82
4. 蛋白质缓冲液 1×，pH 7.4：
化合物浓度（毫米）渗透压 ( mOsm )
Trizma ®盐酸盐 25 325
氯化钠 150
用 5 M HCl 调节 pH

致谢
这项工作是MaxSynBio联盟的一部分，该联盟由德国联邦教育和研究部和马克斯普朗克学会共同资助。这项工作由西班牙Innovación y Universidades的科学部长（包括 FEDER 基金）资助，资助号为 RTI2018-094579-B- I00 。 ISGlobal和 IBEC 是 CERCA计划、 Generalitat de Catalunya 的成员。 YAP 感谢欧盟委员会根据 Horizon 2020 的 Marie Skłodowska -Curie Actions COFUND 计划 (712754) 和西班牙科学与竞争力部的Severo Ochoa计划[SEV-2014-0425 (2015-2019) 提供的财政支持。这项研究是ISGlobal疟疾分子机制计划的一部分，该计划得到了拉蒙·阿雷塞斯基金会的部分支持。使用 BioRender.com 创建的插图。该协议最初在 Avalos-Padilla等人中使用和发布。（2021a）。
利益争夺
作者声明没有竞争利益。
参考
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