材料和试剂
材料
1.移液器（STARLAB International，目录号：S7100-0510、S7100-2200 和 S7110-1000）
2.移液器吸头（Starlabs.、S Korea 和 Sorenson Bioscience, Inc.，目录号：S1120-3810、S1122-1830、2937T、17370-X）
3.1.5 mL微量离心管（SPL Life Sciences，目录号：SPL-060015）
4.1.5 mL微量离心管，灭菌（Bio-Fact，目录号：EMT-1530）
5.质粒 DNA 小量制备试剂盒（Bio-Medic，目录号：BM-K110B）
6.PCR管（Corning Incorporated，目录号：PCR-02-C）
7.PCR纯化试剂盒（Qiagen，目录号：28106）
8.Whatman 3MM 纸（GE Healthcare，目录号：3017-915）
9.柯达 CL-Xposure 胶片（Thermo Scientific，目录号：34090）
10.Micro-flex 手套（Ansell，目录号：MF-300-L）
试剂
1.RNaseZap（RNase Decontamination Solution）（Thermo Scientific，目录号：AM9780）
2.大肠杆菌提取物（S30）（ Bioneer ，目录号：K-7250）
3.用于无细胞反应的反应缓冲液（ Bioneer ，目录号：K-7250）
4.DEPC水（ Bioneer ，目录号：K-7250）
5.不含RNase的水（Thermo Scientific，目录号：7732-18-5）
6.半乳糖（Merck，目录号：G5388）
7.DNase I（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：AM2222）
8.T4 RNA连接酶（ Ambion ，目录号：AM2141）
9.RNasin 核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号：N2111）
10.PCI（苯酚：氯仿：异戊醇）（Merck，目录号：77617）
11.G-50 柱（Sephadex）（GE Healthcare，目录号：27-5330-01）
12.Omniscript 逆转录酶（Qiagen，目录号：205111）
13.HotStarTaq Plus DNA 聚合酶（Qiagen，目录号：203603）
14.dNTP 混合物（每种 10 mM）（ ThermoFisher ，目录号：R0191）
15.T4多核苷酸激酶（NEB，目录号：M0201L）
16.T4 多核苷酸激酶 10 × 缓冲器（NEB，目录号：M0201L）
17.ATP，[γ- 32 P]-6000Ci/mmol（PerkinElmer，目录号：NEG002Z250UC）
18.5 × TBE（ Bioneer ，目录号：C-9002）
19.尿素（Merck，目录号：U5128）
20.丙烯酰胺（Merck，目录号：V900845）
21.双丙烯酰胺（Merck，目录号：V900301）
22.过硫酸铵（Merck，目录号：248614）
23.TEMED（默克，目录号：T9281）
24.甲酰胺（Merck，目录号：F9037）
25.二甲苯氰（Sigma，目录号：X4126）
26.溴酚蓝（Sigma，目录号：B0126 ）
27.Sigmacote （Sigma，目录号：SL2）
28.5 ×显影剂（Vivid，目录号：0514_00004）
29.5 ×显影剂和定影剂（Vivid，目录号：0514_00003）
30.8% 测序溶液（见配方）
31.8% Urea-PAGE 凝胶（见配方）
32.2 ×停止缓冲区（见配方）
质粒和引物（表 1）
1.pGal 质粒（包含gal 操纵子，图 3A）（王 X.等人，2014 年）
2.pRho 质粒（包含T7 启动子控制下的rho基因）（Jeon等人，2021）
3.pRNaseIII（包含T7 启动子控制下的 rnc 基因）（ Jeon等人，2021）

表 1.本研究中使用的引物。
设备
1.30/37°C 固定培养箱（SNT，型号：MCL-20A）
2.Vortex Genie-2（科学工业，型号：G560E）
3.37°C 加热块（FINEPCR，型号：ALB64）
4.离心机（4°C）（Hanil Scientific Inc.，型号：SU-R17）
5.NanoDrop 1000（Thermo Fisher，型号：ND-1000）
6.热循环仪（Bio-Rad，型号：T100，目录号：1861096）
7.凝胶测序仪（ Labrepco ，型号：S2，目录号：21105036）
8.自动移液器（Thermo Scientific，USA，型号：S1 移液器填充器，目录号：9501）
9.暗盒（X 光胶片）（ Duksan (DS) Lab，型号：L-07019-001）
10.电源单元（Bio-Rad，美国，型号： PowerPac 3000，目录号：165-5057）
程序
A.无细胞提取反应（完成时间：1小时）
1.使用 10 nM 的 DNA 模板在 60 µL 反应体积中设置无细胞反应，该模板应包含启动子、随后插入的感兴趣基因的rbs和转录终止子 [pGal 质粒用于图 3A 中的反应(Wang, X. et al. , 2014) ], 25 µL 反应缓冲液 (Bioneer), 14 µL大肠杆菌提取物 (S30) ( Bioneer ), 0.5% (w/v) 半乳糖,和 DEPC 加水至最终体积。
注意：将 100 g 半乳糖溶解在 500 mL 无 RNase 的水中，制成 20% (w/v) 的半乳糖原液。在室温下充分搅拌/混合以溶解，然后过滤消毒溶液。 0.5% (w/v) 的最终半乳糖浓度用于反应。
2.在固定培养箱中 30°C 孵育 30 分钟。
注意：我们建议在固定培养箱中设置无细胞反应。
3.添加等量的 PCI（苯酚：氯仿：异戊醇）并在 12,000下离心 × g和 4°C 10 分钟，停止反应。
注意：在这个阶段，可以看到三个不同的阶段。上层水相将保留总 RNA，而淡黄色相间和下层有机相包含蛋白质。
4.小心地使用移液器取 25 μL 的上层水相，其中包含 RNA，而不会干扰间/有机相。
5.将样品加到 G-50 树脂柱的上侧并在 2,650 下离心 × g 2 分钟。纯化的 RNA 收集在微量离心管的底部。
注意：要制备 G-50 柱，涡旋树脂以重悬并在2,650下离心 ×克 1分钟。将色谱柱放入新的无菌 1.5 mL 微量离心管中。
6.量化纯化的 RNA（通常为 1.0–1.2 µg/µL）并将其储存在 -70°C（暂停步骤）。
关键步骤：使用不含 RNase 的滤芯吸头以避免 RNase 污染。
B.RNA 结扎（完成时间：3.5 小时）
1.将 1.5 mL 无菌微量离心管中的 RNA 连接反应设置为 25 μL，包括 2.5 μL 的 10 × RNA 连接酶缓冲液、1 μL 的 100 nM RNA 寡核苷酸（27 mer）（表 1）、2.5 μg RNA 、0.5 µL 40 U/µL RNasin、1.5 µL 3U DNase I 和 2 µL T4 5 U/µL RNA 连接酶。
注意：如果上一步有任何 DNA 残留，DNase I 可确保完全根除。
2.在固定培养箱中 37°C 孵育 3 小时。
3.使用 G-50 柱在2,650下离心清洁随后的连接混合物 × g 2 分钟。
注意：要制备 G-50 柱，涡旋树脂以重悬并在2,650下离心 ×克 1分钟。将色谱柱放入新的无菌 1.5 mL 微量离心管中。
C.逆转录（RT）（完成时间：2.5 小时）
1.在 1.5 mL 无菌微量离心管中设置逆转录反应至 20 μL 的体积，其中包含 2 μL 10 × RTase 缓冲液、1 μL 25 μM 3RP-R 引物（表 1）、2 μL 5 mM dNTP 混合物， 0.25 µL 40 U/µL RNasin，1 µL 4 U/µL RTase和 4 µg 连接的 RNA。
2.在固定培养箱中 37°C 孵育 2 小时。
注意：cDNA 可以在-20°C下储存，直到下一步（暂停步骤）。
D.PCR （完成时间：2 小时）
1.在 0.2 mL PCR 管中设置 PCR 反应，最终体积为 50 μL ，包含 5 μL 10 × PCR 缓冲液、1 μL 10mM dNTP 混合物、2.5 μL 10 μM 3RP-R 引物、2.5 μL 10 μM感兴趣的基因 (GOI) 引物（表 1）、0.5 µL 5 U/µL HotStarTaq 加 DNA 聚合酶、2.5 µL cDNA 和 36 µL 无 RNase 水。
2.将 PCR 管移至热循环仪。将块预热至 105°C。
3.使用以下参数开始热循环过程：94°C 初始变性 5 分钟，30 个循环：94°C 变性 30 秒，60°C 杂交 30 秒，72°C 延伸 60 s。将样品冷却至 4°C。
4.将 PCR 管存放在 -20°C（暂停步骤）。
关键步骤：PCR 纯化可确保去除 PCR 反应成分。
E.引物末端标记（完成时间：1.5 小时）
1.在 1.5 mL 无菌微量离心管中设置 20 µL 反应，如下所示：2 µL 10 ×激酶缓冲液、2 µL 10 µM 基因特异性延伸引物、2 µL [γ-(32) P] ATP 、1 µL 10U/µL 激酶和 13 µL 无 RNase 水。
关键步骤：使用手套和防护装备，以及有机玻璃防护罩以避免辐射。
2.在加热块中在 37°C 下孵育 30 分钟。
注意：酶可以在 65°C 下灭活 10 分钟。
3.用 30 μL 的无 RNase 水稀释反应混合物，并使用 G-50 柱在 2,650 下离心纯化标记的引物 × g 2 分钟。储存在 4°C（暂停步骤）。
F.引物延伸（PE）（完成时间：2 小时）
1.在 0.2 mL PCR 管中设置 20 µL PCR 反应，如下：2 µL 10 × PCR 缓冲液、0.3 µL 10 mM dNTP mix、0.75 µL 5' 末端标记基因特异性延伸引物、0.2 µL 5 U/µL HotStarTaq plus DNA 聚合酶、2 µL DNA 模板和 14.75 µL 无 RNase 水。
关键步骤：使用手套和防护装备，以及有机玻璃防护罩以避免辐射。
2.使用以下参数运行热循环过程：94°C 初始变性 5 分钟，25 个循环：94°C 变性 30 秒，52°C 杂交 90 秒，72°C 延伸 30 s。将样品冷却至 4°C。
注意：将块预热至 105°C。
3.将 PCR 管存放在 -20°C（暂停步骤）。

图 2. 组装电泳仪的组件示意图。
图示的 3' RACE 测定对大肠杆菌MG1655 野生型 (WT) 细胞中产生的gal转录物的输出显示galETKM mRNA（以前称为 mM1）的 3' 末端在 4,313（数字代表核苷酸的位置来自gal转录起始位点）； GATC：DNA 测序阶梯。
G.凝胶电泳和分析（完成时间：16 小时）
1.根据制造商的描述 (Labrepco) (图 2) (视频 1) 在凝胶铸造室中组装垫片 (0.4 毫米)、内外玻璃板 (宽×高: 31 × 38.5 厘米)。
关键步骤：用疏水性 Sigmacote 溶液涂抹内玻璃板，以便在电泳后从外玻璃板上去除凝胶。

视频 1. 凝胶铸造过程。
2.从 8% 测序溶液中制备 50 mL 的聚丙烯酰胺溶液（参见材料和试剂）。
3.在聚丙烯酰胺溶液中加入 300 μL 的过硫酸铵（10%）和 30 μL 的 TEMED。搅拌均匀。
4.使用自动移液器，轻轻移取玻璃板之间的溶液，不要引入任何气泡。
5.插入凝胶梳（4 × 0.4 毫米，14 厘米）后允许 1 小时，以便发生凝胶聚合。
6.从凝胶浇注室中取出聚合凝胶并将其转移到凝胶测序电泳仪 (Labrepco) (图 2)。
7.× TBE 缓冲液填充底部和上部缓冲液室（浸没至少 2–3 厘米）。
8.从凝胶上取下梳子并使用移液器冲洗孔。
关键步骤：当尿素渗入孔中时，每 2 分钟彻底移液一次。
9.中加入 15 µL 的 2 ×终止缓冲液（参见材料和试剂）并在 95°C 下变性 5 分钟。
10.将样品放在冰上 2 分钟冷却。
11.小心加载 2.5 μL 的样品，避免任何气泡。
关键步骤：始终将样品放在冰上。
12.关闭设备的盖子，将电源线连接到高压电源，并在 60 W 下运行凝胶 2–3 小时。
13.取下夹子，从凝胶电泳装置中取出玻璃板。玻璃板完全冷却后小心拆卸。
注意：检查并等待玻璃板冷却。
14.将一张 Whatman 纸 (3 mm) 剪成与凝胶相同的大小，将 Whatman 纸贴在外玻璃板上后小心地取出凝胶。
15.用保鲜膜盖住凝胶并用透明胶带密封。
关键步骤：经常使用盖革计数器检查辐射水平，重点是防护屏的正面和您的手套，以防受到污染。
16.将 saran 包装密封的凝胶转移到装有 Whatman 纸的凝胶盒中，用 X 射线胶片覆盖凝胶，并在 -80°C 下暴露 12-16 小时。
注意：在 -80°C 时，可以调整胶片曝光时间。
17.胶片从显影和定影中干燥后扫描。 ImageJ 软件可用于计算相对条带强度。
数据分析
A.CFS-3'RACE-PE 检测中使用的 DNA 和 RNA 分析
我们提出了一种有效的策略，以更好地理解 mRNA 生成机制和研究耦合和非耦合转录状态下的转录终止程序，同时将实验时间限制在最短。琼脂糖凝胶电泳用于确认无细胞反应中使用的 DNA 模板（图 3A）。无细胞反应后提取的 RNA 的 23s 和 16s rRNA 条带在变性凝胶上可见（图 3B）。反应后合成的蛋白质量足以用常规考马斯蓝染色检测。
B.CFS-3'RACE-PE反应数据分析
仅在 pGal DNA 模板存在下进行无细胞反应后，3' RACE 在 4,313 处不产生 3' 末端（Wang, X.等人，2019）（图 3C，泳道 2）。然而，添加具有不同反应时间的半乳糖（0.5%）在 4,313 处产生 3' 末端（图 3C，泳道 3-7），表明这些条带是由gal操纵子转录产生的，如体内所示（图 3C，车道 1)。
C.CFS-3'RACE-PE 的验证
我们还研究了 Spot 42 在galT-galK连接处结合在galET mRNA 种类形成中的作用，以验证无细胞系统（Jeon等人，2021）。 galET mRNA的 3' 末端分别位于galT终止密码子下游的2,125 – 2,129 ( galET -short ) 和 2,164 – 2,167 ( galET -long )（图3 D ，泳道 1）（Wang, X. et等人，2015）。 Spot 42 的两个区域与 mRNA 的相应互补区域的碱基配对产生了两个不同的 3' 末端。 Spot 42 的结合导致galT转录的 Rho 依赖性终止 (RDT) ，从而产生galET mRNA（以前称为 mT1）（Wang, X. et al. , 2015）。
使用无细胞测定系统，我们研究了 Spot 42 和 RNaseIII 在 RDT 中的作用。在 pGal DNA 模板和 0.5% 半乳糖存在的情况下，3' RACE 测定产生弱 3' 末端（图 3D，泳道 2）。在质粒 pRho 存在下，其中rho由 T7 启动子控制，2,184 处的条带增加了五倍。这些发现表明 2,184 波段是由于 RDT（图 3D，泳道 3）。在含有pGal DNA 模板和 0.5% 半乳糖的无细胞反应中，我们添加了 150 nM 的 Spot 42 RNA。在 2,184 处具有 3' 末端的 RNA 呈指数增长。在 2,125–2,129 处的一簇 3' 末端也随着 Spot 42 RNA 的增加而增加（图 3D，泳道 4）。这些发现表明， RDT 终止产物在 2,184 的 3' 末端被加工成galET -short的 3' 末端，这意味着 Spot 42 可以利用大肠杆菌提取物中的内源 Rho 蛋白调节 RDT。

图 3。无细胞反应概述，然后是 3' RACE 测定的数据输出。
(A) 用作本研究模板的 pGal 质粒图。 P1启动子的转录起始位点被标记为galP1 。半乳糖操纵子结构基因；显示了galE 、 galT 、 galK和galM ，后跟gal末尾的两个转录终止。不依赖 Rho 的终止信号（终止子发夹）呈现为发夹结构，依赖 Rho 的终止信号（富含 C 的区域）被描绘为双箭头。 (B) pGal 质粒 (12,525 bp) 和从 1.2% 琼脂糖凝胶上的无细胞反应中提取的 RNA 样品的琼脂糖凝胶电泳，显示 23S rRNA、16S rRNA 和其他低分子量 RNA。 (C) 对大肠杆菌MG1655 野生型 (WT) 细胞和pGal 和 0.5% 半乳糖存在下的无细胞反应中产生的gal转录物的 3' RACE 测定。体外显示galETKM mRNA（以前称为 mM1）的 3' 末端在 4,313；泳道 1：无 DNA（阴性对照）；泳道 2：单独的 DNA 模板pGal ；泳道 3-6：具有不同反应时间的pGal和 0.5% 半乳糖； 30 分钟、1 小时、2 小时和 3 小时。 (D)使用无细胞系统进行 RNase III 介导的转录本切割。在 DNA 模板、pGal 和 0.5% 半乳糖存在下（泳道 2），体外MG1655（泳道 1）和无细胞系统的galET mRNA 3' 末端的 3' RACE 测定； pGal、0.5% 半乳糖和 pRho 质粒（泳道 3），其中 Rho ( rho ) 基因受 T7 启动子控制； pGal、0.5% 半乳糖和 Spot42 RNA (150nM)（泳道 4）和 pGal、0.5% 半乳糖、Spot42 RNA (150nM) 和 pRNaseIII 质粒（泳道 5），其中 RNase III ( rnc ) 的基因受T7 启动子。 2,125–2,129： galET -short mRNA的 3' 端； 2,161–2,163：3' 端 galET-长mRNA。数字代表来自gal转录起始位点的核苷酸的位置。 TC：DNA 测序阶梯。
怀疑核糖核酸内切酶参与 2,184 至 2,125–2,129 处 3' 末端的 RNA 加工，我们将pRNaseIII质粒（由 T7 启动子控制的 rnc 基因）添加到含有pGal DNA 模板、0.5% 半乳糖的无细胞反应中和 Spot 42 RNA。 RNaseIII 是一种已知可切割 dsRNA 的核糖核酸内切酶（Robertson等人，1968；Nashimoto 和 Uchida，1985）。在RNaseIII 存在的情况下，在 2184 处具有 3' 末端的 RNA 减少到 50%（图 3D，泳道 5）。然而，与图 3D 泳道 4 中的相比， 2,121–2,129处的galET短带增加了三倍。
这些发现表明，RDT 受 Spot 42 控制，转录本 3' 末端 2,184 的 RDT 被加工成 2,121–2,129，被 RNaseIII 切割。 2,184 处的 3' 末端是完全依赖于 Spot 42 和 Rho 的终止产物。通常，这种不可见的“pre-mRNA”物种不会在体外记录，但可以在我们优化的无细胞系统中看到。我们的研究结果表明，RNase III 可以在 2,184 处切割转录本，从而产生galET-Short 。无法检测到 2,184 的 3' 末端，因为 RNase III 加工似乎在细胞中迅速发生。
笔记
辐射安全和指南：
1.需要进行辐射意识和安全辐射源处理培训。
2.在实验室中留出空间用于研究 ATP，[γ- 32 P]。
3.始终限制您暴露于辐射的时间。
4.为避免暴露，放射性样品应存放在衬铅容器中，实验废物应放置在适当的容器中。
5.使用放射性材料时，请始终使用手套和防护装备以及有机玻璃防护罩以防止辐射。
6.经常使用盖革计数器检查辐射水平，将其放在防护屏和手套前面，以防污染。
食谱
1.8% 测序溶液
2.8% 尿素-PAGE 凝胶
3.2 ×停止缓冲器
致谢
这项工作得到了韩国国家研究基金会基础科学研究计划的赠款 (2020R1A2C200633611 to HML) 的支持。该方案用于“大肠杆菌中gal mRNA的 sRNA 介导调节：RNase E 转录物切割的参与以及 Rho 依赖性转录终止” （Jeon等人，2021 年）。
利益争夺
作者声明没有竞争利益。
参考
1.Adhya, S. 和 Miller, W. (1979)。调节大肠杆菌半乳糖操纵子的两个启动子。自然279（5713）：492-494。
2.Altman, S. 和 Robertson, HD (1973)。大肠杆菌中的 RNA 前体分子和核糖核酸酶。摩尔细胞生物化学1(1)：83-93。
3.Burmann, BM, Schweimer, K., Luo, X., Wahl, MC, Stitt, BL, Gottesman, ME 和 Rosch, P. (2010)。 NusE:NusG 复合体将转录和翻译联系起来。科学328（5977）：501-504。
4.Chakrabarti, SL 和 Gorini, L. (1975)。链霉素和利福平突变之间的联系。 Proc Natl Acad Sci USA 72(6): 2084-2087。
5.Chen, M. 和 Fredrick, K. (2018)。单轮翻译与多轮翻译的衡量标准反对确保转录和翻译耦合的机制。 Proc Natl Acad Sci USA 115(42): 10774-10779。
6.Cole, SD, Miklos, AE, Chiao, AC, Sun, ZZ 和 Lux, MW (2020)。用于无细胞表达系统的原核提取物的制备方法。 Synth Syst Biotechnol 5（4）：252-267。
7.Demo, G.、Rasouly, A.、Vasilyev, N.、Svetlov, V.、Loveland, AB、Diaz-Avalos, R.、Grigorieff, N.、Nudler, E. 和 Korostelev, AA (2017)。与核糖体 30S 亚基结合的 RNA 聚合酶的结构。埃莱夫6：e28560。
8.Fan, H., Conn, AB, Williams, PB, Diggs, S., Hahm, J., Gamper, HB, Jr., Hou, YM, O'Leary, SE, Wang, Y. 和 Blaha, GM (2017 ）。转录-翻译耦合：RNA聚合酶与核糖体和核糖体亚基的直接相互作用。核酸研究45(19)：11043-11055。
9.Holden, HM, Rayment, I. 和 Thoden, JB (2003)。用于半乳糖代谢的 Leloir 途径酶的结构和功能。 J Biol Chem 278（45）：43885-43888。
10.Jeon, HJ, Kang, C., N, MPA, Lee, Y., Wang, X., Chattoraj, DK 和 Lim, HM (2020)。 RNase E介导的多顺反子gal mRNA衰变的翻译起始控制。前分子生物科学 7：586413。
11.Jeon, HJ, Lee, Y., N, MPA, Wang, X., Chattoraj, DK 和 Lim, HM (2021)。 sRNA 介导的大肠杆菌中 gal mRNA 的调节：涉及 RNase E 的转录物切割以及 Rho 依赖性转录终止。 PLoS Genet 17（10）：e1009878。
12.Kim, TW, Oh, IS, Keum, JW, Kwon, YC, Byun, JY, Lee, KH, Choi, CY 和 Kim, DM (2007)。使用双能源延长无细胞蛋白质合成：联合使用磷酸肌酸和葡萄糖以有效供应 ATP 并延缓磷酸盐的积累。生物技术生物工程97（6）：1510-1515。
13.Kohler, R.、Mooney, RA、Mills, DJ、Landick, R. 和 Cramer, P. (2017)。转录-翻译表达组的架构。科学356（6334）：194-197。
14.Lee, HJ, Jeon, HJ, Ji, SC, Yun, SH 和 Lim, HM (2008)。 mRNA梯度的建立取决于启动子：基因表达极性的研究。分子生物学杂志378（2）：318-327。
15.Muratore, G.、Goracci, L.、Mercorelli, B.、Foeglein, A.、Digard, P.、Cruciani, G.、Palu, G. 和 Loregian, A. (2012)。通过破坏病毒聚合酶的亚基相互作用起作用的甲型和乙型流感病毒的小分子抑制剂。 Proc Natl Acad Sci USA 109（16）：6247-6252。
16.Nashimoto, H. 和 Uchida, H. (1985)。大肠杆菌核糖核酸酶III基因及其突变的DNA测序。摩尔基因基因201（1）：25-29。
17.Nudler, E. 和 Gottesman, ME (2002)。大肠杆菌中的转录终止和反终止。基因细胞7（8）：755-768。
18.Proshkin, S.、Rahmouni, AR、Mironov, A. 和 Nudler, E. (2010)。翻译核糖体和 RNA 聚合酶在转录延伸中的合作。科学328（5977）：504-508。
19.Ray-Soni, A.、Bellecourt, MJ 和 Landick, R. (2016)。细菌转录终止的机制：所有美好的事物都必须结束。 Annu Rev Biochem 85：319-347。
20.罗伯逊，高清，韦伯斯特，RE 和津德尔，ND（1968 年）。大肠杆菌核糖核酸酶III的纯化及其性质。生物化学杂志 243（1）：82-91 。
21.Sambrook, J. 和 Russell, DW (2006)。 3' cDNA 末端的快速扩增 (3'-RACE)。 CSH 协议2006(1)。
22.Silverman, AD, Karim, AS 和 Jewett, MC (2020)。无细胞基因表达：应用的扩展库。 Nat Rev Genet 21（3）：151-170。
23.Silverman, AD, Kelley-Loughnane, N., Lucks, JB 和 Jewett, MC (2019)。解构用于转录遗传电路的体外激活的无细胞提取物制剂。 ACS 合成生物学8(2): 403-414。
24.Takahashi, MK, Hayes, CA, Chappell, J., Sun, ZZ, Murray, RM, Noireaux, V. 和 Lucks, JB (2015)。使用无细胞转录-翻译反应对遗传网络进行表征和原型设计。方法86：60-72。
25.Tando，T.，Ishizaka，A.，Watanabe，H.，Ito，T.，Iida，S.，Haraguchi，T.，Mizutani，T.，Izumi，T.，Isobe，T.，Akiyama，T.，井上，J.，等人。（2010）。安魂曲蛋白将 RelB/p52 和 Brm 型 SWI/SNF 复合物连接在非经典 NF-kappaB 通路中。生物化学杂志 285（29）：21951-21960 。
26.Tinafar, A.、Jaenes, K. 和 Pardee, K. (2019)。合成生物学无细胞。 BMC 生物学17（1）：64。
27.Wang, C.、Molodtsov, V.、Firlar, E.、Kaelber, JT、Blaha, G.、Su, M. 和 Ebright, RH (2020)。转录-翻译耦合的结构基础。科学369（6509）：1359-1365。
28.Wang, X., Jeon, HJ, N, MPA, He, J. 和 Lim, HM (2018)。使用 3' RACE 结合 Primer Extension 对大肠杆菌中的 RNA 3' 末端进行可视化。生物协议8(5)：e2752。
29.Wang, X., Ji, SC, Jeon, HJ, Lee, Y. 和 Lim, HM (2015)。 Spot 42 对 galK 表达的两级抑制：mRNA mK2 的降解和 galK 基因之前的转录终止增强。 Proc Natl Acad Sci USA 112（24）：7581-7586。
30.Wang, X., Ji, SC, Yun, SH, Jeon, HJ, Kim, SW 和 Lim, HM (2014)。 gal 操纵子中每个顺反子的表达可以通过转录终止和 galk 特异性 mRNA mK2 的产生来调节。细菌杂志196（14）：2598-2606。
31.Wang, X., N, MPA, Jeon, HJ, Lee, Y., He, J., Adhya, S. 和 Lim, HM (2019)。处理产生 3' 末端的 RNA 掩蔽原核生物中的转录终止事件。 Proc Natl Acad Sci USA 116（10）：4440-4445。
32.Webster, MW, Takacs, M., Zhu, C., Vidmar, V., Eduljee, A., Abdelkareem, M. 和 Weixlbaumer, A. (2020)。细菌转录-翻译耦合和碰撞的结构基础。科学369（6509）：1355-1359。
33.Wong, RW 和 Blobel, G. (2008)。 Cohesin 亚基 SMC1 与纺锤体极的有丝分裂微管结合。 Proc Natl Acad Sci USA 105(40): 15441-15445。
34.Zhao, J.、Hyman, L. 和 Moore, C. (1999)。真核生物中 mRNA 3' 末端的形成：机制、调控以及与 mRNA 合成中其他步骤的相互关系。 Microbiol Mol Biol Rev 63(2): 405-445。
35.Zhu, M.、Mori, M.、Hwa, T. 和 Dai, X. (2019)。大肠杆菌中转录-翻译协调的破坏导致转录过早终止。天然微生物4(12)：2347-2356。