材料和试剂

1.60 mm 组织培养皿（ Genesse Scientific，目录号：26-260）

2.35-mm玻璃底培养皿（ MatTek ，目录号：P35G-1.5-14-C）

3.磷酸盐缓冲盐水（PBS；Corning，目录号：21-040-CV）

4.TrypLE TM表达酶（ Gibco，目录号：12604021 ）

5.Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM；Corning，目录号：15-013-CV）

6.FluoroBrite TM DMEM（ Gibco，目录号：A1896701）

7.Opti-MEM TM减少血清培养基（ Gibco，目录号：11058021）

8.青霉素-链霉素100 ×溶液（10,000 U/mL； HyClone ，目录号：SV30010）

9.L-谷氨酰胺200 mM溶液（ HyClone ，目录号：SH30034.01）

10.胎牛血清（FBS；Sigma-Aldrich，目录号：F0926）

11.Lipofectamine TM 3000转染试剂（ ThermoFisher ，目录号：L3000015）

12.二甲基亚砜（DMSO，Fisher Scientific，目录号：BP231-100）

13.盐酸强力霉素（Dox）（Fisher Scientific，目录号：BP2653-1）

14.U-2 OS 细胞在 Dox 诱导型启动子 (dos Santos Passos ) 的控制下稳定表达 Reader1.0-EGFP 等。 , 2021)

15.质粒 mCherry-BP1-2 pLPC -Puro ( Addgene , 质粒编号: 12259)

16.生长培养基（见配方）

17.活细胞培养基（见配方）

设备

1.CO 2培养箱（ Thermo Fisher Scientific，型号： Heracell VIOS 160i ）

2.珠浴 37°C 培养箱（Lab Armor，型号：74300-706）

3.涡流混合器（ Fisher Scientific，型号：Genie 2，目录号：12-812 ）

4.共聚焦激光扫描显微镜（Carl-Zeiss，型号：LSM 880）使用 Zen Black 2.3 软件（v.14.0.9.201）操作并配备 Plan-Apochromat 63 × /1.40 油浸物镜

5.活细胞成像阶段培养箱（PECON，PM 2000 RBT）

软件

1.Zen Black 2.3 软件（v.14.0.9.201； Carl-Zeiss ）

2.Zen Blue 2.3 软件（v.2.3.69.1000； Carl-Zeiss ）

程序

A.细胞制备

Passos ) 的控制下稳定表达 H2AK13/15Ub 传感器 Reader1.0-EGFP 等。 , 2021)。可从通讯作者 (TY; tingting.yao@colostate.edu) 处获得编码 Reader1.0-EGFP 的稳定细胞系和质粒，用于在哺乳动物细胞中瞬时或稳定表达，并将存放在 Addgene.org。

1.35 mm 玻璃底皿的程序：

a.第 1 天 - 用于转染的种子细胞：

i.播种 3 × 10 5 个细胞，以在第二天获得大约 70% 的融合。

ii.2培养箱中在 37°C 下孵育 16-24 小时。

b.第 2 天 - 用 mCherry-BP1-2 pLPC -Puro (mCherry-53BP1-FFR) 转染细胞：

i.制备 DNA-Lipofectamine 3000 复合物如下：在 125 μL 的 Opti-MEM I 中稀释 0.5 μg 质粒 DNA，然后加入 1 μL 的 P3000 试剂 B 并充分混合（管 A）。在单独的试管中，在 125 μL 的 Opti-MEM I 中加入 1 μL 的 Lipofectamine 3000 试剂 A，并充分混合（B 管）。将 A 管中稀释的 DNA 添加到 B 管中稀释的 Lipofectamine 3000 试剂中，轻轻混匀，室温孵育 15 分钟。

ii.以逐滴方式将 DNA-Lipofectamine 3000 复合物添加到细胞中。

iii.2培养箱中孵育 16–20 小时。

c.第 3 天 – 用 0.1 µg/mL Dox 诱导 Reader1.0-EGFP 表达：

i.吸出介质并用 2 mL 的 PBS 冲洗。

ii.添加 2 mL 的活细胞培养基，辅以 0.1 μg/mL Dox。

iii.2培养箱中在 37°C 下孵育 4 小时。

iv.执行激光微辐照和实时招聘。

B.激光微辐照和实时招募

注 1：实验需要配备用于荧光激发的 405、488 和 561 激光线的共聚焦激光扫描显微镜和用于保持 37°C 和加湿 5% CO 2气氛的载物台培养箱。此处描述的实验是使用 Zeiss LSM 880 倒置显微镜进行的。

注 2：执行此协议需要以前的共聚焦激光扫描显微镜经验。

注 3：LSM 880 显微镜是激光危险等级 3B 仪器。用户必须注意不要让自己暴露在辐射下，尤其是不要直视激光束。只有接受过激光安全培训的人员才能操作该系统。

1.打开显微镜，将载物台培养箱的温度设置为 37°C，将 CO 2浓度设置为 5%。

2.等待温度和 CO 2浓度稳定（约 15 分钟），然后将 35 mm 玻璃底培养皿转移到显微镜的舞台培养箱中。

3.获取共表达 mCherry-53BP1-FFR 和 Reader1.0-EGFP 的细胞的预微辐照图像，并将图像保存为 . czi文件：

a.mCherry-53BP1-FFR 在 561 nm 处被激发，并使用 488/543/633 主二向色分束器 (MBS) 和砷化镓 ( GaAsP ) 光电倍增管 (PMT) 检测器收集荧光发射（图 1）。

b.Reader1.0-EGFP 在 488 nm 处被激发，并使用 488/543/633 MBS 和GaAsP PMT 检测器收集荧光发射（图 2）。

注意：考虑到 405 nm 二极管激光器将用于微辐照细胞以产生局部 DNA 损伤，应选择用于不可见光的 405 MBS 。

图1.用于 mCherry-53BP1-FFR 成像的Z en Black 软件设置。

Zen Black 时，“成像设置”、“采集模式”和“通道”选项卡将自动打开。

图 2. Zen Black 软件设置 Reader1.0-EGFP 成像。

4.辐照实验配置显微镜：

a.在“采集”选项卡中，选中“时间序列”、“漂白”和“区域”复选框（图 3A）。

b.根据图 3B设置激光微辐照的条件。

注意：可能需要在“漂白剂激发”中测试不同的激光强度，以有效地诱导 DNA 损伤。

c.展开“时间序列”工具选项卡并定义数量“周期”（要获取的帧数）和周期之间的时间“间隔”（图 3C）。

d.展开“区域”工具选项卡以定义将用 405 nm 激光进行微辐照的细胞核中的感兴趣区域 (ROI) （图 3D）。

注意：在本例中，激光微辐照的 ROI是一个 300 × 5 像素 (L × W) 的矩形。考虑到扫描仪被配置为沿 y 轴移动，以产生均匀的损坏量，只有宽度 (W = 5 像素) 照射的 ROI 需要保持不变。矩形的长度 (L) 可以在核区域的范围内进行调整。

e.验证设置后，转到“采集”选项卡并点击“开始实验”按钮（图 3A）。

注意：确保选择 488 nm 和 561 nm 轨道进行图像采集。

f.mCherry-53BP1-FFR 和 Reader1.0-EGFP 对辐照轨道的实时招募可以在 Zen Black 的“平均 ROI”视图选项卡中进行监控（图 4）。

Zen Black 软件设置，用于激光微辐照和实时招募。

( A)“采集”选项卡。 (B) “漂白”工具选项卡。 (C) “时间序列”工具选项卡。 (D) '区域' 工具选项卡和描述将被微辐照的感兴趣区域 (ROI) 的示例。

图 4. 激光微辐照和实时招募 mCherry-53BP1-FFR 和 Reader1.0-EGFP到DSB 。

（A）使用 405 nm 激光对共表达 mCherry-53BP1-FFR 和 Reader1.0-EGFP 的 U-2 OS 细胞进行微辐照，并从背景校正的单个帧（ROI 1： DSB 轨道；ROI 2：背景）。 (B) 在指定时间点辐照细胞的代表性图像。 (C) Reader1.0 - e GFP 和 mCherry-53BP1-FFR 显示出相似的 DNA 损伤募集率 (n = 12)。

数据分析

招聘分析

注意：图 4A 显示了为一个单元格获取的原始数据示例，并在 Zen Black 的“平均 ROI”视图选项卡中打开。图 4B 显示了在选定时间显示在 4A 中的细胞的代表性图像：预辐照，T = 0 分钟（辐照后时间为零）和 T = 15 分钟（辐照后 15 分钟）。这些图像是使用 Zen Blue 软件提取和处理的。图 4C 显示了使用 Excel 绘制的已处理数据。

1.打开。 Zen Black 中的czi文件，然后转到“平均 ROI”视图选项卡。

2.转到第 25 帧并定义一个感兴趣区域（ROI 1），其中包含 mCherry-53BP1-FFR（561 nm 轨道）和 Reader1.0-EGFP（488 nm 轨道）的积累可见的微辐照轨道（图 4A)。

3.在核外 (ROI 2) 绘制一个矩形以进行背景减法 (图 4A)。

笔记：

a.Zen Black 软件中的“平均 ROI”视图选项卡允许操作员定义不同形状的 ROI。在图 4A 所示的示例中，使用“闭合折线”选项绘制 ROI 1，使用“矩形”选项绘制 ROI 2。

b.考虑到细胞可以在图像采集期间移动，可能需要重新定义用于分析的感兴趣区域 (ROI 1)。在这里，ROI 1 被定义为一条封闭的折线，其中包含在第 25 帧中在激光轨道上积累的荧光蛋白；选择第 25 帧是因为它对应于 Reader1.0 和 53BP1-FFR 明显积累的时间点（照射后 7.3 分钟）。

4.以 .xlsx 格式保存数据表。

561 和 488 nm 激发轨道的 ROI 1 和 ROI 2 内的时间间隔和平均荧光强度列。

5.背景减法 (ROI 1 – ROI 2) 后, 计算激光诱导的 DNA 损伤处 mCherry-53BP1-FFR 和 Reader1.0-EGFP 荧光的局部增加如下:

a.增加倍数 = I t / I pre ，其中 I t表示在时间 t 受损区域的荧光强度， I pre表示微辐照前的荧光强度（dos Santos Passos 等。 , 2021)。

b.归一化强度 = (I t – I pre ) /( I last – I pre ), 其中 I t表示损伤区域在时间 t 的荧光强度, I pre表示微辐照前的荧光强度, I last 表示最后一个时间点病变处的荧光强度 (图 4C)。

注 1：通常，每个测试条件应分析N ≥ 6 个电池。如果实验的目标是比较不同的实验组（例如，用 siRNA 转染以耗尽 DNA 修复效应子），则分析的细胞数量应足以检测存在显着差异的细胞。在这种情况下，应考虑测量的标准偏差和差异的幅度（即控制条件和测试条件之间的差异）来确定样本量。

注 2：当我们分析稳定表达 Reader1.0 并用siCtrl或 siRNF168 转染的 U-2 OS 细胞时，我们确定 N = 6 个细胞足以检测 RNF168 耗尽的细胞中 Reader1.0 募集到 DSB 的差异（多斯桑托斯帕索斯等人，2021）。

注 3：Reader1.0 与内源性 DNA 修复机制（53BP1 或 BARD1）竞争结合 RNF168 介导的泛素化核小体。 Reader1.0 的高表达抑制了 53BP1-FFR 向激光诱导的 DSB 的募集（dos Santos Passos等人，2021）。这一观察强调了以低但可检测的水平表达传感器的重要性。在该协议中，Reader1.0 在 Dox 诱导启动子的控制下的稳定表达允许传感器水平在测试条件下有效报告 H2AK13/15Ub，而不会对 DNA 修复造成干扰。

通过在 Reader1.0 和 53BP1-FFR 之间进行竞争实验，我们确定可以通过用 0.1 µg/mL Dox 处理 U-2 OS/Reader1.0-EGFP 细胞 4-12 小时来实现 Reader1.0 的最佳表达水平在活细胞成像之前，或者在成像之前使用 0.01 µg/mL Dox 24 – 48 小时。另一种方法是瞬时转染以表达 Reader1.0；在这里，可以在显微镜下识别低水平表达 Reader1.0 的细胞子集并用于实验。

传感器与 DNA 损伤位点结合的动力学可以通过光漂白后的荧光恢复 (FRAP) 测量来确定。滴定 Reader1.0 表达水平可用于将 FRAP 半衰期 (FRAP t 1/2 ) 解卷积为动力学参数 ( k on和k off )。对于 FRAP 实验的定量分析，我们建议读者参考 McNally (2008) 的评论。

食谱

1.生长培养基

（DMEM 补充有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺）

440 毫升DMEM

50 毫升胎牛血清

5 mL 100 ×青霉素-链霉素溶液

5 mL L-谷氨酰胺 200 mM 溶液

2.活细胞培养基

( FluorBrite TM DMEM 补充有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺)

44 mL FluorBrite TM DMEM

5 毫升胎牛血清

0.5 mL 100 ×青霉素-链霉素溶液

0.5 mL L-谷氨酰胺 200 mM 溶液

注意：生长培养基和活细胞培养基应在 4 °C下储存，并在使用前升温至 37 °C 。有关存储时间，请参阅制造商的说明。

3.1 mg/mL Dox 溶液

1毫克盐酸强力霉素

1毫升二甲基亚砜

注意：1 mg/mL Dox 溶液应分成 1 mL 等分试样，并在 -20 °C 下储存长达 12 个月。

致谢

这项研究得到了美国国立卫生研究院对 RE Cohen 和 T. Yao 的 R21ES029150、RE Cohen 的 R01GM115997 和 T. Yao 的 R01GM098401 的支持。该协议描述了 dos Santos Passos的研究论文 (DOI: 10.1083/jcb.201911130) 中使用的方法等。（2021 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

参考

1.Becker, JR, Clifford, G., Bonnet, C., Groth , A., Wilson, MD, Chapman, JR (2021)。 BARD1 读取 H2A 赖氨酸 15 泛素化以指导同源重组。自然596：433-437。

2.Bekker -Jensen, S., Lukas, C., Kitagawa, R., Melander, F., Kastan , MB, Bartek, J., Lukas, J. (2006)。哺乳动物基因组监测机制响应 DNA 链断裂的空间组织。细胞生物学杂志1 73：195-206。

3.dos Santos Passos, C., Choi, Y.-S., Snow, CD, Yao, T., Cohen, RE (2021)。设计用于检测活细胞中核小体泛素化的基因编码传感器。 J 细胞生物学220：e201911130。

4.Ciccia , A. 和Elledge , SJ (2010)。 DNA 损伤反应：让玩刀变得安全。摩尔细胞40：179-204。

5.Fradet -Turcotte, A., Canny, MD, Escribano -Diaz, C., Orthwein , A., Leung, CC, Huang, H., Landry, MC, Kitevski -LeBlanc, J., Noordermeer , SM, Sicheri , F ., Durocher, D. (2013)。 53BP1 是 DNA 损伤诱导的 H2A Lys 15 泛素标记的读取器。自然499：50-54。

6.Hu, Q., Botuyan, MV, Cui, G., Zhao, D., Mer, G. (2017)。 RNF168/169 和 RAD18 泛素-核小体识别和调节 53BP1 染色质募集的机制。摩尔细胞66：473-487。

7.Hu, Q., Botuyan, MV, Zhao, D., Cui, G., Mer, E., Mer, G. (2021)。 BRCA1-BARD1 核小体识别和泛素化的机制。自然596:438-443。

8.杰克逊，SP 和 Bartek J. (2009)。人类生物学和疾病中的 DNA 损伤反应。自然461：1071-1078。

9.Lukas, C.、Falck, J.、 Bartkova , J.、Bartek, J. 和 Lukas, J. (2003)。 DNA损伤诱导的哺乳动物检查点调节剂的不同时空动态。自然细胞生物学5：255-260。

10.Mattiroli , F. 和Penengo , L. (2021)。组蛋白泛素化：基因组稳定性的综合信号平台。趋势基因37：566-581。

11.Mattiroli , F., Vissers , JH, van Dijk, WJ, Ikpa , P., Citterio , E., Vermeulen, W., Marteijn , JA 和Sixma , TK (2012)。 RNF168 泛素化 H2A/H2AX 上的 K13-15 以驱动 DNA 损伤信号传导。 150 号牢房：1182-1195。

12.麦克纳利，JG（2008 年）。定量 FRAP 分析体内分子结合动力学。方法细胞生物学85：329-51。

13.Michelena, J.、Pellegrino, S.、Spegg, V.、Altmeyer, M. (2021)。复制的染色质减少了 BRCA1 熟练和 BRCA1 缺陷细胞中 53BP1 的募集。生命科学联盟4：e202101023。

14.马球，SE 和杰克逊，SP（2011 年）。 DNA 断裂处 DNA 损伤反应蛋白的动力学：关注蛋白质修饰。基因开发25：409-433。

15.Wilson, MD, Benlekbir , S., Fradet -Turcotte, A., Sherker , A., Julien, JP, McEwan, A., Noordermeer , SM, Sicheri , F., Rubinstein, JL, Durocher, D. (2016) . 53BP1修饰核小体识别的结构基础。自然536：100-103。