材料和试剂

生物材料
1. Triton X-100提取的内质网（ER）膜蛋白（TE）根据Chalat et al.（2012）和Verchère et al.（2021）制备，在10 mM HEPES/NaOH、pH 7.4、100 mM NaCl、0.5 mM苯甲基磺酰氟、，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Calbiochem，默克密理博西格玛，德国达姆施塔特，目录号：539131），1%（重量/体积）Triton X-100，在-80°C下储存。
注：如本文所述，该方案也可与非基于Triton X-100的重组程序结合应用于纯化蛋白制剂。在所有情况下，应在无磷酸盐缓冲液中制备样品，以便进行脂质磷酸盐测定。

材料和试剂
1.铝箔
2.夹具（例如，办公室纸夹，Lomax，目录号：9801110）
3.铜带（切割至约70mm长、50mm宽、0.07mm厚，康拉德电子，目录号：545614-62）
4.盖玻片（26×76 mm，#1.5，赛默飞世尔科技公司，美国尤金生命技术公司）
5.用于清洁ITO载玻片的洗涤剂
6.一次性移液管（编号：1702；VWR-150 mm）
7.过滤器（样本盘，SS-033，ELITechGroup，生物医学系统，洛根，UT，美国）
8.镊子（例如VWR，目录号：232-0032）
9.玻璃罐（例如Fisher Scientific，目录号：15603977）
10.玻璃移液管（例如，刻度移液管BLAUBRAND®3类AS，10毫升，刻度：10毫升；Carl Roth，目录号：HXT8.1）
11.玻璃瓶（Rotilabo®-螺纹颈ND8小瓶，棕色玻璃，1.5毫升；Carl Roth，目录号：KE30.1），带螺帽（无钻孔，无隔膜，PP，黑色，ND8；Carl Roth，目录号：KE39.1）用于脂质校准。

12.冰桶（例如，Magic Touch 2TM带盖冰桶；Sigma Aldrich，目录号：BAM16807202）
13.ITO涂层玻片（50×60 mm，1 mm厚；Präzitions Glas&Optik GmbH，Iserlohn，
（德国）
14.容量为1.5毫升的微型离心管（SARSTEDT AG&Co.KG，目录号：72.690.001）
15.容量为2毫升的微型离心管（SARSTEDT AG&Co.KG，目录号：72.691）
16.Pyrex烧瓶（费希尔科学公司，目录号：15446113）
17.带螺帽的圆底玻璃管（KIMBLE®一次性螺纹培养管，圆底，16×100mm，DWK Life Science，目录号：73770-16100）（带密封件的PP螺帽，黑色，DURAN WHEATON KIMBLE，DWK Life Science，目录号：299901307）
18.硅橡胶垫片（切割至50×60 mm，1 mm厚，德国纽曼股份有限公司，目录号：510 1001）
19.粘滑8井（Ibidi，目录号：80828）
20.湿巾（精密湿巾，KIMTECH Science，Kimberly Clark®Professional，目录号：7552）
21.冰醋酸（VWR，目录号：20104）
22.丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：904082）
23.Alexa Fluor 647 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）（赛默飞世尔科学生命技术公司，目录号：A20006），溶解于二甲基亚砜中，并在-20°C下储存
24.四水合钼酸铵（卡尔·罗斯，目录号：3666.1）
25.（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES，Sigma-Aldrich，目录号：440140）
26.L-抗坏血酸（卡尔·罗斯，目录号：3525.2）
27.Avidin（赛默飞世尔科学生命技术公司，目录号：434401），储存温度为-20°C
28.Bio Beads SM-2树脂（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1523920）
29.生物素聚（乙二醇）-琥珀酰亚胺碳酸酯（（乙二醇）-（生物素聚乙二醇SC，5000 Da，美国阿拉巴马州莱桑生物公司），储存温度为-20℃
30.Bio-Gel P-6（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：1504130），溶于去离子水中，并在4°C下储存
31.氯仿、乙醇稳定，并经认证不含光气和盐酸（VWR，目录号：22711.290）
32.去离子水
33.1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺标记为ATTO488（ATTO488-PE），作为粉末（ATTO-TEC GmbH，目录号：67335）购买，溶解在氯仿中，并在-20°C下储存
34.二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
35.鸡蛋L-α-磷脂酰胆碱（EggPC，目录号：840051）和1,2-二油基-sn-甘油-3磷酸乙醇胺-N-（cap-biotinyl，18:1）（biotin PE，目录号：870273）作为粉末（Avanti Polar Lipides，伯明翰，美国）购买，溶解在氯仿：甲醇（1:1，体积/体积）中，并储存在-20°C下
36.70%乙醇

37.葡萄糖（费希尔科学公司，目录号：10122730）
38.HEPES（卡尔·罗斯，目录号：6763.3）
39.冰
40.甲醇（VWR PROLABO®化学品；Fontenay sous Bois，目录号：20834.291）
41.甲氧基聚（乙二醇）-琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG SC，5000 Da，美国阿拉巴马州莱桑生物公司），储存温度为-20°C
42.N2气体（ALPHAGAZ 1 N2，99.999%，液化空气，德国杜塞尔多夫）
43.NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：30620）
44.NaCl（Anlar NORMAPUR，VWR PROLABO®化学品；Fontenay sous Bois，目录号：27810.295）
45.诺兰光学粘合剂60（诺兰产品有限公司目录号：6016）
46.290 mmol kg-1的渗透压标准（OPTIMOLETM，290 mmol kg-1，ELITechGroup，生物医学系统，洛根，UT，美国）
47.Parafilm（Parafilm®M；Sigma-Aldrich，目录号：P7793-1EA）
48.高氯酸（VWR，目录号：20589）
49.皮尔斯旋转柱（Bio-Rad Laboratories Inc.，目录号：7326008）
50.容量为15毫升和50毫升的聚丙烯管（如Falcon管、SARSTEDT AG&Co.KG、目录号：62.554.502和62.547.254）
51.孔径为0.2μm的聚醚砜膜（Filtropur，SARSTEDT AG&Co.KG，目录
电话：83.1826.001）
52.氢氧化钾（费希尔科学公司，目录号：P250-1）
53.碳酸氢钠（费希尔科学公司，目录号：S233-500）
54.连二亚硫酸钠（费希尔科学公司，目录号：10274490）
55.二水合磷酸氢钠（VWR，目录号：28029）
56.蔗糖（费希尔科学公司，目录号：10638403）
57.Triton X®100（卡尔·罗斯，目录号：3051.3）
58.低离子标记缓冲液（见配方）
59.去离子水中的P-6凝胶（见配方）
60.低离子缓冲液（见配方）
61.含Triton X-100的低离子缓冲液（见配方）
62.磷酸盐标准溶液（4mm）（见配方）
63.钼酸盐溶液（12 mg mL-1）（见配方）
64.抗坏血酸溶液（50 mg mL-1）（见配方）
65.250 mM蔗糖溶液（渗透压250 mmol kg-1）（见配方）
66.250 mM葡萄糖溶液（渗透压250 mmol kg-1）（见配方）
67.饱和氯化钠溶液（见配方）
68.5.0 M氢氧化钾（见配方）
69.1.0 M氢氧化钾（见配方）
70.碳酸氢钠（10mM，pH值8.5）（见配方）

71.在去离子水中加入0.2mg mL-1的抗生物素（见配方）

设备

1.分析天平（例如，Sartorius Entris-I II，220 g/0.1 mg；Buch Holm，目录号：4669128）
2.共焦激光扫描显微镜。在本方案中，使用了配备63×/1.20 NA水靶的徕卡TCS SP8（德国韦茨拉尔莱茨）。使用400 Hz单向扫描仪、246.27×246.27μm的像素尺寸、100μm（1 AU）的针孔和徕卡HyD探测器获取图像。
3.端对端旋转器（INTELLI-MIXER，neoLab®，德国海德堡，目录号：7-0045）
4.使用有机溶剂的流动柜
5.冷冻柜（-20°C）
6.冷冻柜（-80°C）
7.函数发生器（例如TG315函数发生器3 MHz；遥测电子设备，目录号：29788）
8.玻璃干燥器（Boro 3.3，带盖插座，20厘米，包括旋塞阀；品牌：GmbH，目录号：65238）
9.玻璃烧杯（例如Aldrich®Essentials烧杯，Griffin；Sigma-Aldrich，目录号：Z740572）
10.玻璃管（卡尔·罗斯，杜兰C208.1）
11.玻璃弹珠（例如Fisher Scientific，目录号：S04581）
12.10µL、100µL、250µL、500µL和1000µL的汉密尔顿700系列注射器（美国内华达州汉密尔顿®注射器，700和1000系列）
13.加热块（Rotilabo®-加热块H 250；CARL ROTH，目录号：Y264.1）
14.制冰机
15.磁力搅拌器（例如，IKAMAG®、德雷扎尔电子、IKA、德国布雷斯高施陶芬）
16.磁铁
17.pH计（pH计761 Calimatic，德国柏林尼克斯）
18.移液管P20、P200、P1000（GILSON®，目录号：FD10001、FD10005和FD10006）
19.移液管尖端为2µL、20µL、200µL和1000µL（SARSTEDT AG&Co.KG，目录号：70.1130.212、70.3021、70.760.002和70.3050.020）
20.聚苯乙烯反应杯（SARSTEDT AG&Co.KG，目录号：67.742）
21.石英反应杯（10毫米宽，QS，高精度电池，石英SUPRASIL®；Hellma®分析，目录号：HL109004F-10-40）
22.冰箱（4摄氏度）
23.旋转蒸发器（BUCHI，真空泵V-100，接口I-100，Rotavapor R-100，瑞士弗利菲尔）
24.剪刀
25.超声波仪（130 W，超声波清洗机；ALLPAX，目录号：10015895；0）
26.分光光度计（例如，日本京都岛津UV-1280紫外可见分光光度计）

27.台式离心机（Eppendorf 5810 R，转子A-4-62，德国汉堡）
28.紫外线/臭氧探头和表面去污装置（美国伊利诺伊州布恩市Novascan Technologies Inc.）
29.蒸汽压渗透压计（WESCOR®，5600型，ELITechGroup，生物医学系统公司，美国犹他州洛根）
30.Vortexer（Vortex Genie 2 TM，BENDER&HOBEIN AG，瑞士苏黎世）

软件

1.GrofPad棱镜版本91.0用于Windows（GrofPad软件，2021，La Jula加利福尼亚，美国，www.graphpad。通用域名格式)
2.ImageJ（Wayne，Rasband，S.，美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院，https://imagej.nih.gov/ij/index.html)
3.墨水库项目（2020），墨水库，团队，2021https://inkscape.org)
4.徕卡应用套件X（德国威茨拉尔莱茨LAS X）
5.微软Excel（微软公司，2018年，https://office.microsoft.com/excel)

启动前的注意事项

A.报告者的选择在基于显微镜的分析中使用的荧光脂质需要满足三个要求：它们应该是（i）低盐条件下ER SCRAMBLASE的基质，（ii）通过使用膜不渗透的二亚硫酸二铵进行化学还原而变为非荧光，以及（iii）在显微镜下是可光的。用荧光标记的脂质类似物488（Andra等人，2018年；Mathiassen等人，2021年）可以满足这些要求。磷脂酶显示出相对较低的特异性，并运输基于神经酰胺的脂质和甘油磷脂，包括ATTO488修饰的磷脂，同样在分析的时间分辨率范围内（Herrmann et al.，1990；Buton et al.，2002；Vishwakarma et al.，2005；Sahu and Gummadi，2008；Sanyal et al.，2008；Chalat et al.，2012；Wang et al.，2018；Bushell et al.2019；Mathiasen et al.，2021）。在GUV形成之前，我们验证了每一种含有LUV重组的scramblase的要求（i）和（ii）。通过对含有ATTO488-PE的单个GUV进行一系列共焦荧光成像，并通过量化第一张图像与后续图像的膜ATTO488荧光强度，验证了要求（iii）（Mathiassen等人，2021年）。注意，大多数ATP依赖性脂质转运蛋白对磷脂转运表现出头基特异性，在这种情况下，不包括使用头基标记的脂质类似物（Theorin等人，2019年）。

B.巨大的单板层小泡的形成我们在低盐条件下将蛋白质重组为LUV，通过在ITO涂层中施加振荡电场，促进其随后在电铸中用于GUV形成

室2004年，在肌浆细胞中加入了有效的ATP酶，并在肌浆细胞中保持了低的ATP酶活性。然而，在这些条件下，并非所有膜转运蛋白都能保持活性。在这种情况下，我们注意到，通过施加更高频率（~500 Hz）的电压，可以在含有生理盐浓度的溶液中制备GUV（Pott等人，2008年；Méléard等人，2009年；Shaklee等人，2010年；Stein等人，2017年）。在这些条件下，GUVs的产量较低，蛋白质并入GUVs的情况更不均匀，主要是因为电场被溶液中的离子屏蔽（Girard等人，2004年；Politano等人，2010年；Aimon等人，2011年；Garten等人，2015年）。此外，带负电的脂质可以在电铸后直接在双层膜上产生不对称的脂质分布。在这种条件下，GUV悬浮液应在室温下储存数小时，并通过使用连二亚硫酸钠反应性荧光脂质探针等方法测试脂质分布（Steinkühler等人，2018年）。此外，ITO涂层载玻片的各种尺寸都是可用的，这可能会改变形成的GUV的数量、形态和尺寸分布。因此，应分析GUV输出，以确保再现性。我们注意到，对其他转运体的研究可能需要对LUV进行其他重组程序，以便下一代含有蛋白质的GUV。我们建议验证GUV中的蛋白质掺入情况（例如，通过使用荧光标记的蛋白质），并使用连二亚硫酸钠分析ATTO488-PE在无蛋白/空GUV双层上的分布，如下文所述。

C.处理巨大的单层囊泡 GUV易碎，在玻璃上容易破裂。因此，在观察自由漂浮的GUV时，重要的是用β-酪蛋白等钝化覆盖玻片，以防止破裂/附着（Streicher等人，2009）。在这个方案中，我们的目标是固定一部分生物素化的GUV，以便于随着时间的推移追踪单个囊泡。使用Chandradoss等人（2014）改编的方案清洁盖玻片，然后使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基硅烷化。表面聚乙二醇化采用Lamichane等人（2010）改编的方案进行，该方案采用功能化PEG（mPEG-SC和生物素PEG-SC）的混合物，引入生物素化PEG分子。为了使用抗生物素蛋白作为固定链接器来增加GUV的固定，可能需要对协议进行调整，因为大多数GUV固定在我们手中，而不是固定在我们手中。

程序

当使用其他蛋白质标记技术时，如SNAP标记和/或重建程序，如本文所述，不基于Triton X-100，跳过步骤1-4，从步骤5开始。

A.制备大的单层囊泡（见图1）

图1。蛋白质重组和大的单层囊泡的制备。
实验工作流程。Triton从酵母中提取的ER膜蛋白（TE）用Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺酯（左）进行荧光标记，产生Alexa Fluor 647荧光标记的TE（TE647）。通过尺寸排阻色谱法（SEC）去除未反应的荧光团，然后使用含Triton X-100的缓冲液（TX）将洗脱液与脂质、eggPC、ATTO488-PE和生物素PE一起重新组合成大的单层囊泡（LUV）。预清洗的生物珠用于去除洗涤剂，产生密封的TE647 LUV（中间）。ProteinFee/空LUV并行生成（右）。

1.TE膜蛋白的胺标记：
a、在冰上解冻鸡蛋。 b、将TE与过量摩尔数为3倍的Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺酯在1.8倍体积的低离子标记缓冲液（见配方1）中在2毫升试管中混合。注：我们通常在每次重组时标记95µg TE。
c、将“标签混合物”在室温下培养1小时，端对端旋转，覆盖铝箔。 d、将旋转柱放入15毫升Falcon管中，并打开盖子。 e、将P-6凝胶（见配方2）添加到旋转柱中，在台式离心机中以453×10的速度离心 gav和4°C持续3分钟。
f、在低离子标记缓冲液中清洗P-6柱两次（见配方1），在453×gav和4°C的台式离心机中离心3分钟。 g、将P-6柱放入清洁的15 mL Falcon管中，并打开盖子。 h、使用平衡的P-6柱去除未反应的荧光团，方法是将“标记混合物”放置在P-6柱顶部，等待约2分钟，并使用台式离心机在453×gav和4°C下离心3分钟。 2.SM-2生物珠洗：
a、在玻璃烧杯中称量比所需量稍多的SM-2生物珠，因为一些生物珠在清洗过程中会丢失。 b、添加磁铁，在流量柜下用甲醇清洗，每次清洗两次，每次15分钟。用玻璃移液管除去甲醇。 c、在去离子水中清洗，在室温下轻轻搅拌，每次清洗两次，每次15分钟。用玻璃移液管除去溶液。 d、在低离子缓冲液（见配方3）中，在室温下轻轻搅拌15分钟
用玻璃移液管除去低离子缓冲液。
e、将洗涤后的SM-2生物珠储存在4°C的低离子缓冲液（见配方3）中，直至使用。注意：新鲜使用或一周内使用。
3.根据Chalat等人（2012年）的说法，将洗脱的Alexa Fluor 647荧光标记TE（TE647）重组为所需蛋白质与磷脂比率（PPR）的LUV。我们通常以35（重量/重量）的PPR重组TE647，如下所示：
a、在流动柜下，用氯仿：甲醇（1:1，体积/体积）清洁汉密尔顿注射器三到五次。注：区分用于未标记和荧光标记的Hamilton注射器
脂质。处理有机溶剂时，避免使用塑料制品。
b、使用汉密尔顿注射器将所需量的未标记（4.32µmol eggPC和43.2 nmol生物素PE）和标记（4.42 nmol ATTO488-PE）脂质（溶解于氯仿：甲醇）混合到一个覆盖铝箔的圆底玻璃管中，以保护冰上的荧光团。 c、在室温下，在温和的氮气流下蒸发溶剂约15分钟，以形成一层薄薄的脂质膜。注：我们将一次性玻璃巴斯德移液管的大头滑入实验室管道
连接到调节器的氮气气瓶上。使用调节器上的出口阀，调节流量，使氮气流通过移液管。移液管可以用环形支架夹钳固定在固定位置。
d、将脂质膜置于真空干燥器中，在约10毫巴和室温下放置1小时，以去除最后的溶剂痕迹。注：我们使用玻璃干燥器连接到耐化学腐蚀的真空泵，
达到10 mbar（±2 mbar）的最终真空和1.5 m3 h-1的吸入容量。
e、用Triton X-100添加等份200µL低离子缓冲液（见配方4）。轻轻旋转，让样品在冰上放置约5分钟，然后添加下一份样品。对于无蛋白/空LUV，用Triton X-100添加1毫升低离子缓冲液（见配方4）。对于含TE647的LUV，在添加四倍于200µL的低离子缓冲液（含Triton X-100）后，添加适量的TE647，并使用Triton X-100的低离子缓冲液填充至1 mL。
注：对于35（重量/重量）的PPR，我们添加95微克TE647。
f、轻轻且短暂地旋转样品，让悬浮液孵化，同时继续下一步。注：在添加SM-2生物珠之前，混合物应与水一样清澈。
g、每1ml样品加入100mg洗涤和干燥的SM-2生物珠。在室温下放置在端盖旋转器上3小时。注：干燥的SM-2生物珠是通过去除含有SM的低离子缓冲液来定义的-
2 在称重之前，使用一次性玻璃巴斯德吸管储存生物珠。
h、每1ml样品额外添加200mg洗涤和干燥的SM-2生物珠。位置
在4°C的端对端旋转器上过夜。
i、使用一次性玻璃巴斯德吸管，将LUV悬浮液转移至不含SM-2生物珠的1.5 mL试管中，并在4°C下储存，直至使用。 4.根据Hrafnsdóttir和Menon（2000年）的说法，确定用Triton X-100重组后去除洗涤剂的效率。所有描述的步骤都在流动柜中进行，以避免直接接触有机溶剂。
a、用Triton X-100（见配方4）将0、7.5、15、30和45µL的低离子缓冲液转移到分离的圆底玻璃管（对应于0、0.05、0.1、0.2和0.3%的Triton X100）中，并将低离子缓冲液（见配方3）添加到150µL的最终体积中。我们建议制备两份标准品。 b、我们建议将50µTEV的离子缓冲液加入到单独的玻璃管中，并将其转移至50µTEV的离子缓冲液中。 c、向所有样品（包括标准品）中添加600µL甲醇和300µL氯仿，并进行简单的测定。 d、使用石英反应杯在分光光度计上测量275 nm（A275）处的吸光度。 e、平均每个标准品和样品的重复读数。 f.从所有标准样品和样品读数中减去空白标准值（0% Triton X-100）的平均吸光度值。这是校正后的吸光度。 g、使用线性回归分析（例如Microsoft Excel）绘制标准曲线（%Triton X-100与平均吸光度A275）。 h、通过将样品吸光度与获得的标准曲线进行比较，使用线性回归方程计算样品的Triton X-100浓度。注：超过99.95%的Triton X-100初始量通常被去除。
5.根据Menlett（1957/2016）和Menlett（1959/2016）的小分子修饰，测定产生的磷脂浓度。
注：以下所有步骤均应在通风柜中进行，使用适当的个人防护，并遵循实验室安全指南。
a、打开通风柜中的电加热块，并将其设置为145°C。 b、稀释磷酸盐标准溶液。 c、将0,5,12.5和20µL磷酸盐标准溶液（参见配方5，对应于0,20,50和80 nmol磷酸盐）转移到单独的玻璃管中，并添加去离子水至最终体积为50µL。从10倍稀释磷酸盐标准溶液中获得额外的标准溶液，例如5,12.5，以及25µL 0.4 M磷酸盐标准溶液（对应于2、5和10 nmol磷酸盐）。我们建议制备两份标准。 d、将12µL（约50 nmol）的LUV溶液转移到单独的玻璃管中，并添加去离子水至50µL的最终体积。我们建议制备复制品并使用
不同量的LUV溶液，以确保读数在标准值范围内。
注：添加SM-2生物珠（步骤3e）之前，取一份洗涤剂溶解的LUV
可包括在分析中，以确定磷脂回收率。重建后，我们通常可以恢复70–90%的磷脂。
e、向包括标准品在内的所有样品中添加300µL高氯酸，用玻璃球松散地封闭玻璃管以防止蒸发，并在145°C下加热1小时。 f、从加热块上取下玻璃管，让其冷却至室温。 g、将加热块上的温度设置为100°C。 h、向所有样品中加入1毫升去离子水，然后搅拌。 i、向所有样品中加入400µL新制备的钼酸盐溶液（见配方6），并短暂搅拌。 j、向所有样品中加入400µL新制备的抗坏血酸溶液（见配方7），并短暂搅拌。 k、用玻璃弹珠松散地封闭玻璃管，并在100°C下加热10分钟。 l、让样品冷却至室温，并使用一次性聚苯乙烯反应杯在分光光度计上测量797 nm（A797）处的吸光度。 m、平均每个标准品和样品的重复读数。从所有标准样品和样品读数中减去空白标准值（0 nmol磷酸盐）的平均吸光度值。这是校正后的吸光度。 o、使用Microsoft Excel等工具绘制标准曲线（nmol磷酸盐与平均吸光度[A797]之间的线性回归分析）。 p、通过将样品吸光度与获得的标准曲线进行比较，使用线性回归方程计算样品的磷酸盐浓度。
B.巨大单层囊泡的制备（见图2）

图2。从大囊泡制备巨大的单囊泡。
A.巨大单层囊泡（GUV）形成室的设备。B.通过电铸形成GUV的示意图。将稀释的大单分子囊泡（LUV）沉积在两片氧化铟锡（ITO）涂层的载玻片上，然后在饱和氯化钠（NaCl）条件下脱水过夜，形成一层薄薄的脂质膜。将两个ITO涂层的载玻片夹在中间，以组装一个ITO腔室，该腔室由硅橡胶垫片隔开，每侧带有铜带，用Parafilm密封，并用夹具固定在一起。使用注射器注入1毫升250毫米蔗糖溶液（未图示），然后用Parafilm密封，然后立即将腔室连接到用于GUV形成的函数发生器。修改自Mathiassen等人（2021年）。

1.紫外线/臭氧清洁氧化铟锡（ITO）涂层载玻片：
a、用洗涤剂、去离子水和70%乙醇清洗四个ITO涂层的载玻片。注：组装一个ITO室需要两个ITO载玻片。含酶

和无蛋白/空GUV总是平行进行比较（分别为SGUV和EGUV）。
b、用湿巾擦干玻片。 c、紫外线/臭氧使用紫外线/臭氧清洁剂清洁导电侧10分钟。 d、打开试验箱前，打开表面去污装置15分钟。

2.调整用于处理巨大单层囊泡的溶液的渗透压：
a、使用前打开蒸汽压渗透压计并使其平衡约30分钟。 b、在蒸汽压渗透计处放置一个带镊子的过滤器。 c、通过在过滤器上施加10µL的体积，使用290 mmol kg-1的渗透压标准平衡蒸汽压渗透计。 d、测量250mM蔗糖溶液（见配方8）和250mM葡萄糖溶液（见配方9）的渗透压。 e、如果需要，用去离子水调整溶液的渗透压。 3.巨大单层囊泡电形成：
a、将TE647 LUV和无蛋白/空LUV在去离子水中稀释至0.8 mg mL1的脂质浓度，在单独的1.5 mL试管中稀释至100µL的总体积。 b、对于每个样品，通过在导电和清洁的ITO涂层玻璃载玻片的每侧上沉积50µL体积的2µL液滴来制备两个清洁的ITO涂层玻璃载玻片。 c、在含有饱和氯化钠（见配方10）的干燥器中使ITO涂层的载玻片脱水过夜，形成脂质膜。 d、将两个涂有ITO的玻璃载玻片组装到一个腔室中，腔室之间用铜带隔开，铜带面向导电侧。用Parafilm和夹具密封，以防止ITO室泄漏。 e、使用1000µL汉密尔顿注射器将1毫升250毫米蔗糖溶液（见配方8）注入试验箱。用Parafilm密封开口，防止蒸发。 f、立即将ITO腔室连接至信号发生器，方法是施加正弦电压4小时，20赫兹，0.2–1.3伏，每6分钟增加一次。用铝箔覆盖腔室以保护荧光团。 g、将电气设置更改为4 Hz和1.3 V，持续30分钟，切断成型的GUV。 h、小心地翻转ITO腔室，取下夹子和副膜，同时从一个角打开腔室，将GUV转移/放入1.5 mL管中。 i、在室温下用铝箔覆盖GUV，保存到显微镜下观察。 j、如上所述，清洁拆下的ITO涂层载玻片。

C.巨大单板层囊泡scramblase试验的制备（见图3）

图3。准备巨大的单层囊泡scramblase分析装置。
A.用于组装显微镜观察室的设备。B.使用移液管尖端，聚乙二醇化的一面朝上，用紫外线将粘性载玻片的角部粘上。C.紫外线干燥紫外线胶水。
D.剪式切取移液管尖端，用于处理巨大的单层囊泡（GUV）。E.荧光法测定GUV中磷脂酶的工作流程示意图。将生物素聚乙二醇化的盖玻片粘在粘性玻片上，用于组装显微镜观察室。加入亲和素结合生物素化PEG分子，然后固定化生物素化GUV。荧光脂质探针ATTO488-PE使用63×水镜的共焦荧光显微镜进行观察。在添加连二亚硫酸钠之前和之后采集图像。含有促凝血酶的GUV（SGUV）预计会导致完全的ATTO488漂白，而在空GUV（EGUV）中，只有外部小叶ATTO488被漂白，产生约50%的荧光减少。修改自Mathiassen等人（2021年）。

1.根据Chandradoss等人（2014年）对方案进行修改，清洁盖玻璃载玻片和Pyrex烧瓶，如下所示。所有描述的步骤都在流动柜中进行，以避免直接接触有机溶剂。
a、将盖玻片放入玻璃罐中，用去离子水冲洗五次。
注：可使用任何玻璃罐，其中盖玻片完全覆盖在溶液中。
b、在新鲜去离子水中超声处理10分钟，去除污垢。 c、处理去离子水，并用新鲜去离子水冲洗三次。 d、用甲醇冲洗并超声处理10分钟。 e、在丙酮中超声处理20分钟。 f、丢弃丙酮，用去离子水冲洗三次，以去除丙酮残留物。 g、在5.0 M氢氧化钾（见配方11）中超声处理20分钟。 h、用去离子水冲洗六次。 i、在甲醇中超声处理2分钟，并在甲醇中保存盖片，直到第2步（见下文）。 j、用去离子水冲洗Pyrex烧瓶数次。 k、将Pyrex烧瓶在1.0 M KOH（见配方12）中超声处理30分钟。 l、将Pyrex烧瓶在甲醇中超声处理30分钟。 2.根据Lamichane等人（2010）的说法，使用甲氧基聚（乙二醇）-琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG SC）和生物素聚（乙二醇），通过3氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）对带有胺基的干净玻片进行表面功能化-
琥珀酰亚胺碳酸酯（生物素聚乙二醇SC）如下所述：
a、在清洁的Pyrex烧瓶中混合300毫升甲醇、15毫升冰醋酸和3毫升APTES，制备氨基硅烷化溶液。 b、在装有清洁的盖玻片的玻璃罐中更换甲醇，培养20分钟，超声处理1分钟，然后进一步培养10分钟。 c、用甲醇冲洗四次，一次用去离子水冲洗，一次用甲醇冲洗。 d、在聚乙二醇化前，用氮气流干燥盖玻片。 e、将干燥的盖玻片放入一个干净的容器或一个装有约10%二甲基亚砜或去离子水的移液管尖盒中。关闭箱子以防灰尘积聚。注意：记得在盖玻片的侧面贴上标签，以便以后区分聚乙二醇化的一面。
f、将10mg生物素PEG SC和200mg mPEG SC溶解在1.6ml 100mM碳酸氢钠中，制备PEG溶液（约35张载玻片）（见配方13）。轻轻旋转使其混合。注：使用前将PEG分子平衡至室温。在将PEG分子返回至-20°C之前，用N2气体冲洗小瓶，用Parafilm密封，用铝箔包裹，并干燥。 g、每次将90µL PEG溶液添加到一个盖玻片上。轻轻地在顶部放置另一个清洁的盖玻璃滑块。关闭盒子，在室温下黑暗中培养5-6小时。注意：确保幻灯片之间没有气泡。如果载玻片在孵育期间移动，则使用干净的移液管尖端重新定位。

h、轻轻滑动以分离盖玻片，用去离子水冲洗，并用氮气干燥。 i、将聚乙二醇化盖玻片储存在单独的50 mL Falcon管中，用氮气冲洗，用Parafilm密封，并用铝箔包裹，在-20°C下使用。注：我们通常在3个月内使用聚乙二醇化盖玻片
3.显微镜观察室的组装：
a、让聚乙二醇化盖玻片平衡至室温。 b、将Ibidi粘性载玻片8充分粘在聚乙二醇化盖玻璃载玻片上。 c、用紫外线胶密封房间的角落。 d、在紫外线/臭氧清洁剂下干燥紫外线胶水2分钟。 e、打开试验箱前，打开表面去污装置5分钟。 4.巨大单层囊泡固定：
a、将200µL抗生物素（去离子水中0.2 mg mL-1，见配方14）添加到每个培养箱中，培养10分钟或更长时间。 b、使用移液管，用400µL 250 mM葡萄糖溶液（见配方9）轻轻冲洗掉任何未结合的抗生物素。 c、用剪刀剪下一个200µL移液管尖端。 d、使用剪式切割的200µL移液管尖端添加100µL GUV，并培养10分钟或更长时间。注：最终体积为500µL。
5.测定巨大单层囊泡中的磷脂酶活性：
a、将连二亚硫酸钠粉末放在20毫升冰管中保存。 b、打开共焦显微镜、计算机，并打开LAS X软件。我们使用以下设置：63×1.20水物镜，使用400 Hz单向扫描仪进行图像采集，像素尺寸为246.27×246.27μm，以及带有徕卡HyD探测器的100μm（1 AU）针孔。用于成像的λex/λem如下：对于ATO488，为507/517–550 nm；对于Alexa647，为645/655–780 nm。 c、在连二亚硫酸钠处理之前（对应于t=0 min），使用显微镜载玻片上的机动样本获取多个标记位置的图像。 d、将连二亚硫酸钠溶解在600µL 250 mM葡萄糖溶液中（见配方9），并在使用前旋涡。注：为每个实验系列制备新鲜连二亚硫酸钠溶液。连二亚硫酸钠溶液不稳定，分解速度快！
e、添加5µL连二亚硫酸钠（最终浓度为2 mM），并立即获得一个时间序列的图像（对应于t>0 min）。 f、对于250mM葡萄糖溶液（见配方9）的添加，也进行了类似的程序，作为对照。
数据分析

ImageJ用于分析连二亚硫酸钠处理前后单个GUV的膜荧光强度（见图4）。Only unilamellar giant vesicles are used for analysis. Scramblasecontaining and empty GUVs (sGUVs and eGUVS, respectively) should always be prepared and assayed on the same day.
1.Export data (series of images) as .tif files from the LAS X software and import into the ImageJ software.
2.A region of interest (ROI) is placed around the GUV of interest to measure the ATTO488 fluorescence intensity of the membrane, by measuring the integrated density value per pixel.
3.Another ROI is placed within the GUV lumen and subtracted from the membranal density value per pixel, which is then subtracted from the membrane signal, by multiplying with the area of the membrane ROI. The background signal was typically insignificant, but nevertheless used as an offset correction as part of our standard procedure.
4.Repeat the procedure for each time frame and save the data as an Excel (xls) file.
5.We used GraphPad software to analyze and characterize the fluorescence trace of the individual GUVs over time after dithionite treatment. The fluorescence intensity of an individual GUV prior to dithionite addition can be compared with the fluorescence intensity over time after dithionite addition, or with the last frame obtained. For each selected GUV, we normalized each data point to the initial fluorescence intensity prior to dithionite treatment, and analyzed the fluorescence over time by a “one phase decay model” with a nonlinear fit: y = (y0-plateau)*exp(-k*x) + plateau, where y0 and the plateau are same units as y, and y0 is constrained to 1.0, y starts at y0 and decays (with one phase) down to plateau, x is time in seconds, and the rate constant k equals the reciprocal of the x axis units, which is constrained to k > 0. The bleaching kinetics allow to extract the number of scramblase-competent GUVs (GUV that lost >80% of the initial fluorescence within 10 minutes). Analysis of the kinetics of scrambling as a function of the number of reconstituted scramblases is best carried out with fluorescently labeled purified scramblases, rather than the crude TE preparation that we use here as a source of scramblase activity.
6.Repeat the analysis of 250 mM glucose treated GUVs to ensure the ATTO488 fluorescence is not photobleached over the duration of the selected time frames. This experiment should ideally be the first analysis performed.

Figure 4. Quantification of ATTO488-PE membrane fluorescence.
A. For giant unilamellar vesicle (GUV) analysis, an outer region of interest (ROI) is placed around the GUV membrane and its total ATTO488 fluorescence is determined (blue circle). Another ROI is defined within the GUV lumen to quantify background fluorescence (punctured blue circle). The average fluorescence per pixel of the lumenal ROI is determined and scaled to the pixel area of the outer ROI for background subtraction. B. Dithionite bleaching of ATTO488-PE fluorescence in five empty GUVs (eGUVs, coded in different shades of green). The arrowhead indicates dithionite addition. The red line is a monoexponential fit of the combined data (t½ = 0.56 min, span = 0.47). C. Dithionite bleaching of ATTO488-PE fluorescence in eleven individually tracked scramblase-containing GUVs (sGUVs, coded in different colors), normalized to the fluorescence value at t = 0 min. The arrowhead indicates dithionite addition. Four of the traces show complete loss of fluorescence by t = 3 min, four show complete loss of fluorescence by t = 6 min, and three still show detectable fluorescence at t = 12 min. The horizontal dashed line corresponds to 50% loss of fluorescence. Modified from Mathiassen et al. (2021).

Notes

Aliquots of the TE prior to, during, and after fluorescent amine labeling can be analyzed by SDS-PAGE in-gel fluorescence with aliquots after protein-reconstitution into LUVs. The presence of protein can by visualized by silver or colloidal staining (Mathiassen et al., 2021).

Recipes

All solutions were filter-sterilized over a 0.2 µm Acrodisc® Syringe Filter and stored at 4°C unless stated otherwise, but equilibrated to room temperature before use.
1.Low ionic labeling buffer 1 mM NaCl
2 mM HEPES/NaOH，pH值8.3
1%（重量/体积）Triton X-100
用1 M NaOH溶液调节pH值。
2.去离子水中的P-6凝胶

将P-6凝胶在去离子水中在4°C条件下轻轻搅拌膨胀过夜，然后在4°C条件下储存。
3.低离子缓冲液1mM NaCl
2 mM HEPES/NaOH，pH值7.4
用1 M NaOH溶液调节pH值。
4.含Triton X-100 1mM NaCl的低离子缓冲液
2 mM HEPES/NaOH，pH值7.4
1%（重量/体积）Triton X-100
用1 M NaOH溶液调节pH值。
5.磷酸盐标准溶液（4mm）
在去离子水中溶解35.598 mg二氢磷酸二钠，最终体积为50 mL。
6.钼酸盐溶液（12 mg mL-1）
将144 mg新鲜四水合钼酸铵溶解在去离子水中，最终体积为12 mL。不要储存。
7.抗坏血酸溶液（50 mg mL-1）
将600 mg新鲜L-抗坏血酸溶解在去离子水中，最终体积为12 mL。不要储存。
8.250 mM蔗糖溶液（渗透压250 mmol kg-1）
9.250 mM葡萄糖溶液（渗透压250 mmol kg-1）
10.饱和氯化钠溶液
在搅拌下向100毫升去离子水中加入约35–40克氯化钠。
11.5.0 M氢氧化钾
在去离子水中溶解14 g KOH至最终体积为50 mL。
12.1.0 M氢氧化钾
在去离子水中溶解2.8 g KOH至最终体积为50 mL。
13.碳酸氢钠（10mM，pH值8.5）
在去离子水中溶解8.4 mg碳酸氢钠，最终体积为10 mL。不需要调整pH值。
14.在去离子水中加入0.2mg mL-1的抗生物素

致谢

感谢美国康奈尔州纽约市康奈尔大学（Robert Anaderil，Tampon，Germany）和纽约市康奈尔大学（Tim Weichs）提供的有益的医学建议。这项工作得到了DAD（Grand 57386621，T.G.P.）和德国研究基金会（GU 1133／11-1；NST 213 /88 6-1 FuGG到T.G.P）的支持。P.P.M.感谢波鸿鲁尔大学门户奖学金的支持。本协议基于我们之前的出版物Mathiassen等人（2021年）。

竞争利益

作者声明没有相互竞争的经济利益。

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